GS FLX的技术
2014-基因组学——最终版
基因组学题库一基因组学介绍1 基因组与基因组学基因组是指生物的整套染色体所含有的全部DNA序列，是生物体所有遗传信息的总和。
基因组学（Genomics）是以生物信息学分析为手段研究基因组的组成、结构、表达调控机制和进化规律的一门学科，研究对象是基因组结构特征、变演规律和生物学意义。
2 C质与C质悖论C值（C value)通常是指某一生物单倍体基因组DNA的总量。
C值悖论（C Value Paradox)：生物的复杂性与基因组的大小并不完全成比例增加。
3 人类基因组计划及其8个目标人类基因组计划(human genome project, HGP)是由美国科学家于1985年率先提出，于1990年正式启动的。
美、英、法、德、日和我国科学家共同参与了这一预算达30亿美元的人类基因组计划。
按照这个计划的设想，在2005年，要把人体内约10万个基因的密码全部解开，同时绘制出人类基因的谱图。
其8个目标：1）人类DNA序列（Human DNA sequence）；2）开发测序技术（Develop sequencing technology）；3）识别人类基因组序列变异（Identify human genome sequence variation）；4）功能基因组学技术（Functional genomics technology）；5）比较基因组学（Comparative genomics）；6）伦理、法律、社会问题（ELSI: ethical, legal, and social issues）；7）生物信息学和系统生物学（Bioinformatics and computational biology）；8）Training and manpower。
4 什么是宏基因组（metagenomics）？研究一类在特殊的或极端的环境下共栖生长微生物的混合基因。
生境中全部微小生物遗传物质的总和。
它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因，目前主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。
转录组高通量测序转录组数据分析差异表达基因分析
Genei Sum(genei)
sampleA a c
sampleB b d
• ᵡ2=[(ad-bc)2(a+b+c+d)]/[(a+b)(c+d)(a+c)(b+d)] • df=1
Illumina Genome Analyzer
3.转录组数据分析
4.差异表达基因分析
• 统计学分析： • 1. Fold change, 一般2-fold increase or decrease (平行实验的样本较
少) • 2. p-value (平行实验的样本较多)
under-expressed
• 1.转录组 • 2.高通量测序 • 3.转录组数据分析 • 4.差异表达基因分析 • 5.趋势性上调和下调基因分析 • 6.基因集功能富集分析
1.1transcriptome
➢ 转录组（transcriptome）是指特定生物体在某种状态或某一生 理条件下，细胞内所有基因转录产物的总和，包括信使RNA 、核糖体RNA、转运RNA及非编码RNA；狭义上指所有 mRNA的集合。
illumina测序平台的特点
• 1）可控制的高通量：一次实验可读取量大于 15 亿个碱基/芯片 • 2）上样需求低：上样量只在pmol级（ng级） • 3）简单、快速、自动化 • 4）低错误测序比例
利用新颖的可逆荧光标记终止子，可以在DNA链延伸的过程中检 测单个碱基掺入。由于四个可逆终止子dNTP在每个测序循环都存 在，自然的竞争减少了掺入的错配。
（4）反应体系中剩余的dNTP和残留的少量ATP在Apyrase的作用下发生降解。 （5）加入另一种dNTP，使第2－4步反应重复进行，根据获得的峰值图即可读
高通量测序技术介绍及其应用
目录一、高通量测序技术背景知识 (1)1、什么是测序 (1)Sanger法测序 (1)高通量测序 (1)2、常见的测序平台介绍 (2)Illumina Solexa测序技术 (2)Roche454测序技术 (2)ABI SOLiD测序技术 (3)3、高通量测序技术的应用 (1)二、各类型测序技术介绍及其使用目的* (2)1、基因组重测序 (2)2、De novo测序 (3)3、外显子测序（Whole Exon Sequencing） (3)4、转录组测序（RNA-seq） (3)5、小RNA测序（Small RNA Sequencing） (4)6、ChIP-seq测序 (4)7、CHIRP-Seq测序 (4)8、CLIP-seq测序 (5)9、宏基因组测序（Metagenome Sequencing） (5)三、不同类型高通量测序技术在基础医学领域中的应用* (6)1、Exome-seq在医学研究中的应用 (6)2、RNA-seq数据分析在医学研究中的应用 (7)3、Small RNA-seq数据分析在医学研究中的应用 (9)4、ChIP-seq在医学研究中的应用 (10)5、HITS-CLIP在医学研究中的应用 (11)四、高通量测序数据的基本概念和数据质量控制 (13)1、FASTA文件的格式 (13)2、FASTQ文件格式 (14)3、FASTQ文件中Reads ID号的命名规则 (14)4、FastQC测序质量评估工具中各个图表的解释 (15)五、高通量测序数据序列比对介绍 (19)1、序列比对的基本概念 (19)2、RNA-seq序列比对软件Tophat相关主要参数的设置和意义 (20)3、“.sam”格式高通量测序数据比对输出结果文件介绍 (21)一、高通量测序技术背景知识1、什么是测序测序是指通过专业的分析工具测定物种细胞内DNA或RNA碱基排序的过程。
根据方法的不同，目前测序主要分为Sanger法测序和高通量测序。
高通量基因测序技术在HLA领域的应用
新一代测序技术及其商业化平台推出后，其低廉的价格、 高通量的数据、简易的样品处理过程、将基因组学水平研 究带入了一个新的时期
感谢聆听，欢迎交流！
高通量基因测序技术在HLA领 域中的应用
课前导读
高通量基因测序技术的核心思想是边合成边测序或边连 接边测序，一次就可以对几十万到几百万条NA分子 进行序列测定，是一种深度测序，是新一代测序技术
本课着重介绍了以罗氏公司测序系统GS FLX为代表的 新一代基因测序技 理，并介绍了新一代测序技术的广泛应用领域
思考
GS FLX系统的操作过程是怎样的？ （思考后，请在接下来的内容中验证您的答案是否准确）
重点回顾
• 高通量测序技术的核心思想是：边合成（连接）边 测序法
• GS FLX测序系统其测序原理主要采用了焦磷酸测 序法
• GS FLX 测序系统在DNA构建过程中在DNA两 端加上AB两者衔接子，其序列完全不一样
测序技术及测序仪器的比较
河南农业大学本科生毕业论文（设计）题目现阶段的测序技术及测序仪器的比较学院生命科学学院专业班级2007级生物技术4班学生姓名徐志超指导教师高玉千撰写日期：2011年5月5日现阶段的测序技术及测序仪器的比较徐志超生命科学学院摘要：自sanger测序技术发明以来，经人类基因组计划的促进，测序技术有了跨越式的发展，以实验方法与实验仪器的改进为标志,测序技术经历了三代的发展，同时测序技术向着高通量测序，单分子测序，低价格测序的方向发展，目前测序技术已成为分子生物学实验中的重要的实验手段。
本文主要简单回溯了测序技术的发展历史，介绍了现阶段主流测序仪器IlluminaGA，ROCH-454，ABI 3730XL，ABI SOLID及HeliScope的原理及工作流程。
关键词：测序技术；测序仪；IlluminaGA；ROCH-454；ABI-3730XL；ABI-SOLID；HeliScope Studies on sequencing technology and sequencerXU Zhi-chaoCollege of Life SciencesAbstract:Sequencing technology has leaping developed promoted by the Human Genome Project since the Sanger sequencing technology been invented.Sequencing technology has gone through three generation by the improvement of sequencing methods and sequencer, at the same time, sequencing technology developed towards high-flux, single molecule sequencing and lower price. Sequencing technology has become the most important experimental means in molecular biology experiments currently. This paper simply reviews the historical development of sequencing technology,introduces the principle and workflow of the main sequencer.Keywords: sequencer;IlluminaGA;ROCH-454;ABI-3730XL;ABI-SOLID;HeliScope1953年Watson和Crick揭示了DNA的双螺旋结构[1]，这大大激励了人们对DNA 序列的探索。
临床基因组学检验：第七章 Sanger测序及高通量测序技术
Ion Chef™ 系统
Ion torrent PGM的基本原理
DNA / RNA
Prepare Library
Library Preparation
Clonal Amplification
Isolate Positive Ion Sphere™ Particles
Template Preparation*
高通量测序的常用名词
• 高通量测序技术（High-throughput sequencing，HTS）是对传统 Sanger测序（称为一代测序技术）革命性的改变, 一次对几十万 到几百万条核酸分子进行序列测定, 因此在有些文献中称其为下 一代测序技术(next generation sequencing，NGS )足见其划时代的 改变, 同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细 致全貌的分析成为可能, 所以又被称为深度测序(Deep sequencing)
Load Chip and Sequence
DNA Sequencing*
Data Analysis
Data Analysis
dNTP H+
Sensing Layer Sensor Plate
Bulk
Drain
Source
Silicon Substrate
∆ pH ∆Q
∆V
To column receiver
高通量测序平台
Roche 454 Genome Sequencer FLX
Illumina MiSeq NextSeq 500
Life Ion PGM; Ion proton
Roche 454 Genome Sequencer
• GS FLX • GS Junior System
高通量测序生物信息学分析(内部极品资料,初学者必看)
基因组测序基础知识㈠De Novo测序也叫从头测序，是首次对一个物种的基因组进行测序，用生物信息学的分析方法对测序所得序列进行组装，从而获得该物种的基因组序列图谱。
目前国际上通用的基因组De Novo测序方法有三种：1. 用Illumina Solexa GA IIx 测序仪直接测序；2. 用Roche GS FLX Titanium直接完成全基因组测序；3. 用ABI 3730 或Roche GS FLX Titanium测序，搭建骨架，再用Illumina Solexa GA IIx进行深度测序，完成基因组拼接。
采用De Novo测序有助于研究者了解未知物种的个体全基因组序列、鉴定新基因组中全部的结构和功能元件，并且将这些信息在基因组水平上进行集成和展示、可以预测新的功能基因及进行比较基因组学研究，为后续的相关研究奠定基础。
实验流程：公司服务内容1.基本服务：DNA样品检测；测序文库构建；高通量测序；数据基本分析（Base calling，去接头，去污染）；序列组装达到精细图标准2.定制服务：基因组注释及功能注释；比较基因组及分子进化分析，数据库搭建；基因组信息展示平台搭建1.基因组De Novo测序对DNA样品有什么要求？(1) 对于细菌真菌，样品来源一定要单一菌落无污染，否则会严重影响测序结果的质量。
基因组完整无降解(23 kb以上)， OD值在1.8～2.0 之间；样品浓度大于30 ng/μl；每次样品制备需要10 μg样品，如果需要多次制备样品，则需要样品总量=制备样品次数*10 μg。
(2) 对于植物，样品来源要求是黑暗无菌条件下培养的黄化苗或组培样品，最好为纯合或单倍体。
基因组完整无降解(23 kb以上)，OD值在1.8～2.0 之间；样品浓度大于30 ng/μl；样品总量不小于500 μg，详细要求参见项目合同附件。
(3) 对于动物，样品来源应选用肌肉，血等脂肪含量少的部位，同一个体取样，最好为纯合。
基因组学总结
Roche 454（GS FLX Titanium System）超高通量测序技术原理2005年底，454公司推出了革命性的基于焦磷酸测序法的超高通量基因组测序系统——Genome Sequencer 20 System，被《Nature》杂志以里程碑事件报道，开创了边合成边测序的先河。
2007年又推出了性能更优的第二代基因组测序系统——Genome Sequencer FLX System。
2008年10月，454推出了全新的GS FLX Titanium系列试剂和软件，让GS FLX的通量一下子提高了5倍，准确性和读长也进一步提升。
GS FLX 测序原理：GS FLX系统的测序原理和GS 20一样，也是一种依靠生物发光进行DNA序列分析的新技术；在DNA 聚合酶，ATP硫酸化酶，荧光素酶和双磷酸酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号释放偶联起来(图1)。
通过检测荧光信号释放的有无和强度，就可以达到实时测定DNA序列的目的。
此技术不需要荧光标记的引物或核酸探针，也不需要进行电泳；具有分析结果快速、准确、灵敏度高和自动化的特点。
Roche GS FLX System是一种基于焦磷酸测序原理而建立起来的高通量基因组测序系统。
在测序时，使用了一种叫做“Pico TiterPlate”（PTP）的平板，它含有160多万个由光纤组成的孔，孔中载有化学发光反应所需的各种酶和底物。
测序开始时，放置在四个单独的试剂瓶里的四种碱基，依照T、A、C、G的顺序依次循环进入PTP板，每次只进入一个碱基。
如果发生碱基配对，就会释放一个焦磷酸。
这个焦磷酸在各种酶的作用下，经过一个合成反应和一个化学发光反应，最终将荧光素氧化成氧化荧光素，同时释放出光信号。
此反应释放出的光信号实时被仪器配置的高灵敏度CCD捕获到。
有一个碱基和测序模板进行配对，就会捕获到一分子的光信号；由此一一对应，就可以准确、快速地确定待测模板的碱基序列。
第二代测序技术
SO、油包水PCR
SOLiD流程
3、含DNA模板P1磁珠的固定
SOLiD流程
4、SOLiD双碱基编码原理及测序流程
SOLiD流程
4、SOLiD双碱基编码原理及测序流程
SOLiD流程
5. 数据分析原理
Polonator
第二代高通量测序技术简介
四大高通量测序平台
Solexa，454 (GS-FLX)，
SOLiD和Polonator
测序原理
合成法测序(Sequencing by Synthesis) 连接法测序(
Roche：（2005，2007，2008） 原理：在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光 素酶和双磷酸酶的作用下，将每一个dNTP的 聚合与一次化学发光信号的释放偶联起来， 通过检测化学发光信号的有无和强度，达到 实时检测DNA序列的目的。
至300-800bp间，经末端修复与特异性接头 连接等修饰后变性处理回收单链的DNA 。
454 (GS-FLX)流程
包水的混合 物，每个独特的片断在自己的微反应器里进 行独立的扩增，回收纯化；
454 (GS-FLX)流程
3、测序反应：携带DNA片段的磁珠被放入 PTP板中供测序反应使用。
454 (GS-FLX)流程
4、数据分析：GS FLX系统在10小时的运行 当中可获得100余万个读长，读取超过4-6亿 个碱基信息
Solexa-Illumina Genome Analyzer
测序原理： Polonator系统高质量测序是一种以连接 反应进行DNA序列分析的技术，该系统采用 结合在磁珠上单分子DNA片段簇为测序模板， 以CY5、Texas Red、CY3、6-FAM四色荧 光标记的9碱基单链荧光探针混合物进行连续 的连接反应为基础，对扩增的DNA片段进行 大规模高通量测序。
454测序
第二代测序技术（Next-Generation Sequencing）NGS之基础篇2001年，美、英、法、德、日、中六国合作，历时十年，耗资数十亿美元的人类基因组计划（Human Genome Project，HGP）宣告完成。
转眼又是十年过去，在此期间，各国科学家仍在为解读基因的密码而不懈努力，这其中最大的突破，就是第二代测序技术的推出。
HGP的顺利完成证明了我们有能力对自身的遗传信息进行研究，然而，高昂的成本、漫长的时间、巨大的人力需求，无不限制着对遗传密码的进一步认识。
从HGP开始的第一天期，科学家们就在寻求更好的方法来对基因组进行研究，“鸟枪法”就是其中之一。
2006年，美国X大奖基金会（）设立了奖金高达1000万美元的基因组Archon X大奖，旨在奖励第一个在10天内以低于100万美元的成本完成100个人类基因组测序的民间团队。
而罗氏（Roche）、应用生物系统（Applied Biosystems，ABI）、Illumina三家公司先后推出了各自的第二代高通量测序平台，成为NGS领域的领头羊。
2005年底，454公司推出第一个基于焦磷酸测序原理的高通量基因组测序系统——Genome Sequencer 20 System，这是核酸测序技术发展史上里程碑式的事件。
随后，罗氏公司以1.55亿美元收购了454公司，并在2006年推出了更新的GS FLX测序系统，该系统可在10小时的运行中获得100万条读长（reads），4~6亿个碱基信息（base pair），且准确率达到99%以上。
2008年，GS FLX系统再次升级，通量提高了5倍，读长和准确率也有所增加。
虽然454 GS测序平台也许不是市场占有率最高的测序仪，但截至2011年3月，利用该系统进行研究的论文已发表超过1000余篇，而它在读长上的优势明显胜于另两套系统，因此在从头测序（de novo）和宏基因组测序（meta genome）方面有着不可替代的地位。
焦磷酸测序
罗氏454测序系统中文名罗氏454测序系统测试原理基于焦磷酸测序法特点依靠生物发光对DNA序列进行检测测序流程支持各种不同来源的样品序列测定测试原理GS FLX系统的测序原理是基于焦磷酸测序法，依靠生物发光对DNA序列进行检测。
在DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，荧光素酶和双磷酸酶的协同作用下，GSFLX系统将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号释放偶联起来。
通过检测荧光信号释放的有无和强度，就可以达到实时测定DNA序列的目的。
此技术不需要荧光标记的引物或核酸探针，也不需要进行电泳；具有分析结果快速、准确、高灵敏度和高自动化的特点。
测序流程1. 样品种类：GS FLX系统支持各种不同来源的样品序列测定，包括基因组DNA，PCR产物，BACs，cDNA及小分子RNA等，不同类型的样品测序都可在一台仪器上完成。
2. 样品DNA打断：样品如基因组DNA或BAC等被打断成300到800bp的片段；对于小分子的非编码RNA，这一步骤并不需要。
短的PCR产物则可利用GS融合引物扩增后直接进行步骤4。
3. 加接头：借助一系列标准的分子生物学技术，将3′端和5′端有特异性的A和B接头连接到DNA片段上。
接头也将在后继的纯化，扩增和测序步骤中用到。
图中仅仅显示了后续步骤中要用到的单链的DNA片段。
4. 一条DNA片段=一个磁珠：接头使成百上千条DNA片段分别结合到一个磁珠上，磁珠被单个油水混合小滴包被后，在这个小滴里进行独立的扩增，而没有其他的竞争性或者污染性序列的影响，从而实现了所有DNA片段进行平行扩增（emPCR）。
5. 一个磁珠=一条读长：经过emPCR扩增后，每个磁珠上的DNA片段拥有了成千上万个相同的拷贝。
经过富集以后，这些片段仍然和磁珠结合在一起，随后就可以放入到Pico Titer Plate板中供后继测序使用了。
6. 数据读取和分析工具：GS FLX系统提供三种不同的生物信息学工具对测序数据进行分析，适用于不同的应用。
提RNA反转录的详细流程
提RNA反转录的详细流程SMART 技术制备GS FLX 样品cDNA详细流程第一天一．RNA的提取1.用QiagenRneasy Mini Kit 提取组织总RNA(详见Handbook)：1）在1.5 ml管中加入600ulRL T和6ul B-巯基乙醇2）取10—30mg组织样品放入管中，用剪刀或电动匀浆机破碎，3—5min3）12000rpm/3min,取上清移入新管4）加入1倍体积70%乙醇，轻柔混匀（吸打），不能离心，并立即转入收集柱，10000rpm/30s,弃废液。
(分两次移吸附柱，离心弃废液后，打开盖子让酒精挥发一下再操作)5）加入700ulRW1, 10000rpm/30s,弃废液6）加入500ulRPE, 10000rpm/30s,弃废液7）加入500ulRPE, 10000rpm/2min,弃废液，换新收集管，空转12000rpm/1min8）将收集柱移入1.5mlRnase-free管中，加30—50ulRnase-free water,静置1min,10000rpm/1min..(由于下步用Dnase去除DNA,需用87.5ul RNA溶液，因此用45ul Rnase-free water洗两次) 9）定量，跑胶2.用Tiangen Rnase-Free Dnase I 去除DNA 污染1）反应体系：共100ul87.5ul RNA 溶液10ul buffer RDD2.5ul Dnase I储存液（配制：干粉溶于550ul的Rnase-Free ddH20中，分装，-20℃保存）2）20—25℃孕育10min3.用Qiagen Rnwasy Mini Kit 纯化1）100ul除DNA后的RNA+350ulRL T,混匀2）加入250ul无水乙醇，轻柔混匀，不能离心，并立即移入收集柱，10000rpm/30s，弃废液3）加入500ulRPE, 10000rpm/30s,弃废液4）加入500ulRPE, 10000rpm/2min,弃废液，换新的收集管，空转1min5) 换 1.5ml管，加30—50ulRnase-free water，置1min,10000rpm/1min6）定量，跑胶第二天二．反转录（SMART Kit,详见Manual）1.做逆转录之前对RNA的处理：浓缩RNA1）在所提取的RNA里（大约为10ug），加无水乙醇（2倍体积），醋酸钠（3M. PH=15.2 0.1倍体积）2）-70℃, 酝酿40min或过夜.3）取出溶液，3000g/1min; 换个方向，12000rpm/5min4）弃上清，用70%的乙醇洗两次。
Roche 454(GS FLX Titanium System)超高通量测序技术原理
Roche 454（GS FLX Titanium System）超高通量测序技术原理2005年底，454公司推出了革命性的基于焦磷酸测序法的超高通量基因组测序系统——Genome Sequencer 20 System，被《Nature》杂志以里程碑事件报道，开创了边合成边测序（sequencing-by-synthesis）的先河。
之后，454公司被罗氏诊断公司以1.55亿美元收购。
2007年，他们又推出了性能更优的第二代基因组测序系统—— Genome Sequencer FLX System (GS FLX)。
2008年10月，454推出了全新的GS FLX Titanium系列试剂和软件，让GS FLX的通量一下子提高了5倍，准确性和读长也进一步提升。
想当年，GS 20的出现，揭开了测序历史上崭新的一页。
Jonathan Rothberg博士就是大规模并行测序的发明者，同时也是454的创始人。
上世纪90年代，很多学者也都想到了大规模并行测序，他们试图将Sanger测序移到芯片上，但都以失败告终，因为这项技术没有可扩展性。
1999年，Rothberg的儿子出世，他放了两个星期的陪产假。
小家伙出生后被送入婴儿特护病房，Rothberg非常担心，甚至想获取儿子的基因组信息。
这段担惊受怕的经历给了他灵感，他突然意识到焦磷酸测序（pyrosequencing）不仅简单，而且具有可扩展性。
两个星期之后，Rothberg就开始设计芯片和流动室，让测序在更小的反应室中进行，并同时进行几百万个反应。
硬件的设计和制造也只是成功的一半，在样品制备上还有同样漫长的路要走。
Rothberg摒弃了传统的细菌克隆与挑选，将DNA打断成随机片段，并寻找一种方法来克隆每个片段。
受到其他学者乳液实验的启发，他也想将DNA放入油包水的乳液中，这样就省去了反应管。
一个好汉三个帮。
在Joel Bader等人的帮助下，Rothberg验证了这些想法的可行性，并利用了炸药中的表面活性剂来维持乳液的热稳定性。
NGS测序
Solexa的测序原理是可逆终止化学反应。DNA片段加上接头之后，可以随机的附着于玻璃表面（Flow cell），并且在固相的表面经过桥式扩增。这样就形成了数千份相同的单分子簇，被用做测序模板。测序采取边合成边测序的方法，和模板配对的ddNTP原料被添加上去，不配对的ddNTP原料被洗去，成像系统能够捕捉荧光标记的核苷酸。随着DNA 3'端的阻断剂的去除，下一轮的延伸就可以进行。和焦磷酸测序不同，每次DNA的只能延伸一个核苷酸。Solexa的读长在100-150bp之间，适合小RNA鉴定、甲基化和表观遗传学研究。
高通量测序（High-Throughput Sequencing）又名下一代测序（Next Generation Sequencing，NGS），是相对于传统的桑格测序（Sanger Sequencing）而言的。目前高通量测序的主要平台代表有罗氏公司(Roche)的454测序仪（Roch GS FLX sequencer），Illumina公司的Solexa基因组分析仪（Illumina Genome Analyzer）和ABI的SOLiD测序仪（ABI SOLiD sequencer）。
454公司首选将焦磷酸测序应用在测序技术上，之后便被罗氏诊断收购，形成了目前的Roche 454。待测DNA样品被打断成300-800bp的片段后，3' 和5'端分别加上接头，这些接头会使DNA片段结合到微珠上。测序PCR反应就发生在固相的微珠上，并且整个PCR反应和相关的酶被油包水的液滴包裹，每个油滴系统只包含1个DNA模板。扩增后，每个DNA分子可以得到富集，每个微珠只能形成一个克隆集落。454测序仪的测序通道体积非常狭小，只能容纳一个微珠。测序过程中，GS FLX系统会将引物上dNTP的聚合与荧光信号释放偶联起来。通过检测荧光信号，就可以达到DNA测序的目的。相对于Sanger测序，Solexa和Solid测序而言，454可以提供中等的读长和适中的价格，适合de novo 测序、转录组测序、宏基因组研究等。
DNA测序技术的发展历史与最新进展
・技术与方法・生物技术通报B I O TECHNOLOGY BULL ET I N2010年第8期DNA 测序技术的发展历史与最新进展解增言 林俊华 谭军 舒坤贤(重庆邮电大学生物信息学院,重庆400065) 摘 要: DNA 测序技术是现代分子生物学研究中最常用的技术。
从1977年第一代测序技术的出现,经过30多年的发展,DNA 测序技术取得重大进展,以高通量为特点的第二代测序技术逐步成熟并商业化,以单分子测序为特点的第三代测序技术也已经出现。
介绍每一代测序技术的特点,并重点介绍了第二代测序技术及其应用。
展望新的测序技术对于未来生物学研究及人们自身健康与人类疾病等方面研究的影响。
关键词: 第一代DNA 测序技术 第二代DNA 测序技术 第三代DNA 测序技术 高通量 单分子测序The History and Advances of DNA Sequenc i n g TechnologyXie ZengyanL in JunhuaTan JunShu Kunxian(College of B io 2infor m ation,Chongqing U niversity of Posts and Teleco mm unications,Chongqing 400065) Abs trac t: A s the commonly used technol ogy in molecular bi ol ogy,DNA sequencing technol ogy has seen great advances in morethan thirty years since 1977.Next 2generati on DNA sequencing technol ogy,characterized by high 2thr oughput,has entered the market and been gr owing t o maturity .The third 2generati on sequencing technol ogy has als o arisen,which can sequence single DNA moleculars .I n this review,we intr oduced three generati ons of sequencing technol ogies and emphasized on the second 2generati on sequencing technol o 2gy and its app licati ons .A t the end of the review,the effect of new DNA sequencing technol ogies on research and medicine were p re 2viewed . Key wo rds: First 2generati on DNA sequencing technol ogy Second 2generati on DNA sequencing technol ogyThird 2generati onDNA sequencing technol ogy H igh 2thr oughput Single 2molecular sequencing technol ogy .收稿日期:2010202202基金项目:重庆邮电大学博士启动金(A2009218)作者简介:解增言,男,博士,讲师,研究方向:生物信息学;E 2mail:zengyanxie@g mail .comDNA 测序技术是分子生物学研究中最常用的技术,它的出现极大地推动了生物学的发展。
Thermage FLX 第五代热玛吉FLX说明文档
舒适脉冲技术
黄金治疗头
2009
2013
蓝色治疗头 皮下穿透0-2.4 mm
温度低于50℃
2015年获得CFDA认证 皮下穿透0-4.3 mm 温度65-75℃
Thermage FLX™
AccuREP™ 技术
2017
4.0 cm² Total Tip （2017）
Thermage®的演进
15年的创新和久 经考验的结果
真皮层密度增加
SCN 406 治疗前
Histology images: Thermage Treatments by Julio Barba, M.D. & Javier Ruiz-Esparza, M.D.
26 D007371B
Thermage永葆青春光彩
12
D007371B
Thermage FLX技术特点
Thermage FLX与Thermage CPT 异同
相同之处
• 面部治疗头具有同样的穿透 深度0-4.3mm和治疗温度 以及加热时间。
• 同样为单极回路式射频技术 能够产生三维立体式皮肤紧 致。
• 都能够对面部、眼部、体部 区域进行治疗且一次治疗即 可有效
D007371B
不同之处
• Theramge FLX加入Total Tip 4.0治疗头，节约25%的 治疗时间。
无创紧肤射频系统 治疗输出速度更快
2002
1.0 cm²眼部治疗头 （2002）
1.5 cm²面部治疗头 （2004）
3.0 cm²面部治疗头 （2005）
0.25 cm²眼部治疗头 （2006）
D007371B
2007
16.0 cm²身体治疗头 （2008）
高通量测序在环境微生物学中的应用
Science & Technology Vision
科技视界
高通量测序在环境微生物学中的应用
杜 姗 1 杨 唐 2 赵英杰 2 渊1.中国海洋大学环境科学与工程学院袁山东 青岛 266100曰 2.青岛理工大学环境与市政工程学院袁山东 青岛 266033冤
揖摘 要铱微生物群落是生态系统中最活跃的结构单位和功能单位袁因此了解各种环境中微生物的群落结构有着重要的意义袁其研究的技 术也一直在进步遥高通量测序可以一次获得多条基因序列袁使得其在环境微生物学中的研究中倍受青睐遥探讨了 454 高通量测序早在环境微生 物学中的应用遥
夏围围等[7]将新一代高通量测序技术与 DGGE 两种技术结合使用 到了研究是新西兰典型草地和森林土壤微生物群落结构上袁 以 16S rRNA 基因为标靶, 通过两种技术来分析土壤微生物群落的结构组成 和多样性袁同时以此来比较两种技术的优缺点遥 测序分析结果显示袁新 西兰草地土壤检测到 22 门袁54 纲袁60 目袁131 科和 350 属曰 而 DGGE 却只检测到 6 门袁9 纲袁8 目袁10 科袁10 属袁 这表明了高通量测序比 DGGE 能更完整的表达出微生物的群落结构组成遥 同样的袁在森林土 壤也显示出了类似的规律遥
1 高通量测序技术Fra bibliotek.随着科技的迅猛发展袁测序技术也在进步袁这些测序技术可以在 种的水平上对环境微生物进行分析和研究遥 出现在上世界 70 年代的 Sanger 测序法[1]袁成本高测序通量低袁成为了其广泛使用的限制因素袁 但它却是 20 世纪 90 年代到本世纪初期一直在使用的测序技术遥
gswifi原理
gswifi原理GSWifi原理GSWifi是一种无线网络技术，它基于IEEE 802.11标准，通过无线信号传输数据，实现了无线网络连接。
本文将介绍GSWifi的原理和工作方式。
一、GSWifi的基本原理GSWifi的基本原理是通过无线信号传输数据。
无线信号是通过调制和解调技术在空气中传播的，GSWifi利用这一技术将数据转换成无线信号，并在接收端将无线信号转换回数据。
GSWifi的工作流程如下：1. 手机或电脑等设备发送数据到GSWifi模块。
2. GSWifi模块将数据转换成无线信号，通过天线发送出去。
3. 无线信号经过传输介质（如空气）传播到接收端。
4. 接收端的GSWifi模块将无线信号转换成数据。
5. 接收端设备接收到数据。
二、GSWifi的工作方式GSWifi的工作方式可以分为两个部分：发送端和接收端。
1. 发送端：发送端的GSWifi模块负责将数据转换成无线信号并发送出去。
当发送端设备需要发送数据时，GSWifi模块会将数据进行编码和调制处理，将其转换成适合无线传输的信号。
这个过程包括：- 编码：将数据进行编码，以便在无线信号中传输。
- 调制：将编码后的数据转换成无线信号，通过调整频率、振幅、相位等参数来表示数据。
2. 接收端：接收端的GSWifi模块负责接收无线信号并将其转换成数据。
接收端设备通过天线接收到无线信号后，GSWifi模块会进行解调和解码处理，将无线信号转换成原始数据。
这个过程包括：- 解调：将接收到的无线信号转换成基带信号。
- 解码：将基带信号转换成原始数据。
三、GSWifi的优势和应用GSWifi作为一种无线网络技术，具有以下优势：1. 便捷性：GSWifi可以实现无线网络连接，消除了传统有线网络的限制，使得设备可以随时随地进行网络通信。
2. 灵活性：GSWifi可以支持多种设备连接，包括手机、电脑、智能家居设备等，为用户提供了更多的选择和便利。
3. 高速性：GSWifi可以提供较高的传输速度，满足用户对快速网络连接的需求。
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高通量基因组测序系统GS FLX的技术原理许冠东*（罗氏应用科学部罗氏诊断产品有限公司上海200031）摘要: 焦磷酸法最早是应用在检测DNA甲基化和SNP位点分析的一项技术, 在2005年底, 此技术被用来进行基因组序列的测定, 已经成为下一代高通量测序中最成熟的一种技术。
本篇文章着重介绍了采用焦磷酸测序法的罗氏公司最新一代高通量基因组测序系统GS FLX的技术原理, 操作过程和广泛的应用范围。
关键词: GS FLX, 焦磷酸测序, 高通量, 读长, 应用
GS FLX, the Leader in Next Generation Sequencer
XU Guan-Dong*
（Roche Applied Science, Roche Diagnostics (Shanghai) Limited, Shanghai 200031）Abstract: Pyrosequencing technology is famous for its application in detection of SNP site and DNA me-thylation. At the end of 2005, pyrosequencing technology was used to sequence the whole genome and it has become the most developed next generation high-throughput sequencing technonlogy. In this article, we in-troduce the theory, operation process and wide application field of the second generation genome sequencer FLX system provided by Roche
Keywords: GS FLX, Pyrosequencing, High throughput, Read length, Application
2007年9月28日, 在《Science》国际顶级学术期刊的网站上, 同时查询到3篇突破性的基础研究成果[1~3]。
这3篇文章的研究对象和领域完全不同, 分别涉及了对人类基因组变异的研究, 蜜蜂社会性的进化讨论以及灭绝的古生物线粒体全序列的测定。
然而它们的共同点是, 它们所使用的分析数据和实验结果都来自罗氏454 公司研发的高通量测序技术平Genome SequencerTM。
在1周的时间里就有3篇GS系统在不同研究领域的应用文章发表在《Science》上，累计已有近100篇Genome SequencerTM的应用成果发表在世界知名期刊上，说明454测序技术和GS系统在生命科学研究领域的广泛适用性。
Genome Sequencer FLX (GS FLX)系统是罗氏454 公司的第二代测序平台, GS FLX的命名正是来源于其多领域的灵活(flexible)应用。
GS FLX系统在技术原理和性能方面的表现优
越, 每个反应可以得到超过40万个序列读长, 单个序列的读长可达300bp, 一个测序反应就可以产出超过1亿个碱基信息。
目前, Genome SequencerTM系统已经被世界上几乎所有从事基因组测序和相关结构功能研究的顶级实验室配备使用, 相信随着该系统性能和应用领域的不断提升和扩展, 必将带来整个测序领域的技术发展, 对大规模基因序列研究的相关应用领域产生巨大的推动作用, 例如基因组学、比较基因组学、转录组分析和基因调控等。
1 GS FLX系统超高通量测序技术原理
与GS 20一样, GS FLX系统的测序原理也是基于焦磷酸测序法, 一种依靠生物发光进行DNA序列分析的新技术; 在DNA聚合酶, A TP硫酸化酶, 荧光素酶和双磷酸酶的协同作用下, 将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号释放偶联起来。
通过检测荧光信号释放的有无和强度, 就可以达到实时测定DNA序列的目的。
此技术不需要荧光标记的引物或核酸探针, 也不需要进行电泳; 具有分析结果快速、准确、高灵敏度和高自动化的特点。
GS FLX系统减少了传统测序样品制备过程中对大型自动站的依赖, 完全不需要进行繁琐的建库过程, 也不必进行克隆挑取、微孔板处理等工作; 利用创新的磁珠和emPCR技术进行样品制备, 同时提供完整的后续生物信息学分析解决方案。
1) 样品种类：GS FLX系统支持各种不同来源的样品序列测定：包括基因组DNA, PCR产物, BACs, cDNA, 及小分子RNA等等; 不同类型的样品测序都可在一台仪器上完成。
2) 样品DNA打断：样品如基因组DNA或BAC等被打断成300 bp-800 bp的片段; 对于小分子的非编码RNA, 这一步骤并不需要。
短的PCR产物则可利用GS融合引物扩增后直接进行步骤。
3) 衔接子连接：借助一系列标准的分子生物学技术, 将3′端和5′端有特异性的A和B衔接子连接到DNA片段上。
衔接子也将在后继的纯化, 扩增和测序步骤中用到。
图中仅仅显示了后续步骤中要用到的单链的DNA片段。
4) 一条DNA片段＝一个磁珠：衔接子使成百上千条DNA片段分别结合到一个磁珠上, 此磁珠被单个油水混合小滴包被后, 在这个小滴里进行独立的扩增, 而没有其他的竞争性或者污染性序列的影响; 所有DNA片段进行平行扩增(emPCR)。
5) 一个磁珠＝一条读长：经过emPCR扩增后, 每个磁珠上的DNA片段拥有了成千上万个相同的拷贝。
经过富集以后, 这些片段仍然和磁珠结合在一起, 随后就可以放入到PicoTiterPlate板中供后继测序使用了。
6) 数据读取和分析工具：GS FLX 系统提供三种不同的生物信息学工具对测序数据进行分
析, 适用于不同的应用：例如多达3GB序列的重测序, 对比已知参考序列进行的扩增产物差异分析, 及120MB的从头测序工作等。
3 GS FLX系统的技术优势
3.1 基于其特有的技术原理和性能操作
GS FLX系统具备诸多方面的的卓越性能7.5个小时的一个测序反应, 就可获得超过1亿的碱基数据。
高通量测序产品中无可比拟的最长读长, 可达300 bp通量更高, 每个反应可以得到超过40万个序列读长，读长超过200 bp时, 单一读长的准确性可以超过99.5%，测序结果一致性超过99.99%。
无需克隆和挑取克隆的操作工程, 生成的完整基因组库, 避免了克隆偏差的影响测序成本的大大降低
3.2 GS FLX系统具备完整的软件包是它的又一大特色
利用项目管理软件工具, 可以把多次测序反应得到的数据进行成组分析, 并且可以添加已完成的测序反应数据来进行其他方面的分析，同时可以整合Sanger测序结果进行拼接和作图, 包括配对末端的拼接支持将GS FLX的数据于第三方的软件工具整合, 例如Cosed可自主选择拼接时的参数采用新一代的算法, 保证获得高度可信的结果——无论是碱基识别, 拼接作图, 还是差异分析
4 GS FLX系统的广泛应用
这项技术的第一个“样本”就是来自有“DNA之父”之称的James D Waston, 他向454公司提供了自己的血液样本并获得了全部的基因组序列。
目前GS系统的用户在Nature、Science、PNAS、Cell等等世界顶级的期刊杂志上已经发表100篇的学术论文。
(详细列表请查询https:///sis/sequencing/genome/index.jsp)。
与GS 20系统相比较, 硬件配置和软件系统方面的革新改进, 使得GS FLX系统具有了更广泛的应用, 包括：
基于末端配对(Paired-End)应用的从头测序(De Novo Sequencing)
BAC文库的重测序(Resequencing)
基于全基因组测序的比较基因组学研究
生物群总体基因组和微生物多样性研究
考古学
扩增产物的测序, 识别高可信度的SNP位点
小分子RNA
转录组分析
甲基化和基因表达调控的研究
当前全球众多从事测序技术研发的工作者都在为实现只需花费$1000就可获取个人基因组序列信息的目标而努力着, 一旦这个目标得以实现, 个性化的早期疾病诊断和医疗服务将不再只是梦想。
罗氏454公司也将同样以此作为努力的方向, 不断地提升现有FLX系统平台功能, 包括读长的增加, 改进提升数据输出和分析工具; 对实验成本、覆盖率以及时间安排等方面的优化等。
参考文献
[1] Jan O Korbel,Alexarder Eckehart Urban , et al. Paired-End Mapping Reveals Extensive Structural Varia-tion in the Human Genome. Science, 2007, 318(5849): 420426.
[2] Amy L Toth, Kranthi Varala, Thomas C Newman, et al. Wasp Gene Expression Supports an Evolutionary Link Between Maternal Behavior and Eusocialityv. Science, 2007, 318(5849): 441 444.
[3] Gilbert MTP, Tomsho LP, Rendulic S, et al. Whole-genome shotgun sequencing of mitochondria from ancient hair shafts. Science, 2007, 317(5846): 19271930.。