一、核酸的分离、提纯和定量测定
第十二章 核酸的研究方法.
六.DNA的化学合成 将待活化的核苷酸上的某些游离基团保 护（封闭）起来，使反应按设计的方向 进行。5'-OH用二对甲氧三苯甲基 （DMT）保护，碱基上的氨基用苯甲酸 保护。 对3 ' -OH用氨基亚磷酸化合物进行活化。
A 第一个核苷酸的3 ' -OH与固相（树脂）结合在一起， 它的5'-OH与活化的单体之间形成一个亚磷酸三酯，活 化单体上的5'-OH及碱环上的氨基等由于受到保护而不 会参与反应。 B 亚磷酸三酯经碘氧化形成磷酸三酯 C 加入二氯乙酸除去生长链中的5'-OH上的保护剂DMT， 至此DNA链已延伸了一个核苷酸单位，并可投入下一 轮反应。 D 整个DNA片段合成完毕后，用苯硫酚除去5'-OH上的 保护剂DMT，用浓氢氧化铵将DNA片段与固相树脂断 开，使DNA得以洗脱下来。再用浓氢氧化铵在加热条 件下使碱基上的保护剂除去。最后除去氢氧化铵，在 真空中抽干。
这三个热反应过程的重复称为一个循环(cycle)
PCR主要由高温变性、低温退火和适温延伸三个步骤反 复的热循环构成： 即在高温（95℃）下，待扩增的靶 DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板；而后在低温 （37～55℃）情况下，两条人工合成的寡核苷酸引物与 互补的单链DNA模板结合，形成部分双链；在Taq酶的最 适温（72℃）下，以引物3’端为合成的起点，以单核苷 酸为原料，沿模板以5’→3’方向延伸，合成DNA新链。 这样，每一双链的DNA模板，经过一次解链、退火、延 伸三个步骤的热循环后就成了两条双链DNA分子。如此 反复进行，每一次循环所产生的DNA均能成为下一次循 环的模板，每一次循环都使两条人工合成的引物间的 DNA特异区拷贝数扩增一倍，PCR产物得以2n的批数形 式迅速扩增，经过25～30个循环后，理论上可使基因扩 增109倍以上，实际上一般可达106～107倍。
第15章 核酸的研究方法
核酸的核苷酸序列测定(4) 核酸的核苷酸序列测定
Sanger DNA测序原理 测序原理
核酸的核苷酸序列测定(5) 核酸的核苷酸序列测定
(二)DNA的化学法测序 二 的化学法测序
化学法测序由Maxam和Gilbert于1977年所发明。其基本原理 和 年所发明。 化学法测序由 于 年所发明 是用特异的化学试剂作用于DNA分子中不同碱基，然后用哌啶切 分子中不同碱基， 是用特异的化学试剂作用于 分子中不同碱基 断反应碱基的多核苷酸链。 种不同的特异反应 种不同的特异反应， 断反应碱基的多核苷酸链。用4种不同的特异反应，就可以使末端 标记的DNA分子切成不同长度的片断，其末端都是该特异的碱基。 分子切成不同长度的片断， 标记的 分子切成不同长度的片断 其末端都是该特异的碱基。 经变性胶电泳和放射自显影得到测序图谱。 经变性胶电泳和放射自显影得到测序图谱。
寡核苷酸链释放
PCR:聚合酶链式反应 聚合酶链式反应(1) 聚合酶链式反应
由引物决定的DNA扩增片断 扩增片断 由引物决定的
①加热使DNA双链分开 加热使 双链分开 加入寡聚DNA引物片 ②加入寡聚 引物片 段，冷却
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
重复步骤③ 重复步骤③
③升温至TaqDNA聚 升温至 聚 合酶最适温度， 合酶最适温度，使子 链自引物向前延伸
核酸的凝胶电泳
(一) 琼脂糖凝胶电泳 一 以琼脂糖作为支持物,电泳的迁移率决定于以下因素 以琼脂糖作为支持物 电泳的迁移率决定于以下因素: 电泳的迁移率决定于以下因素 (1) 核酸分子大小 (2) 胶浓度 (3) DNA的构象 的构象 (4) 电压 (5) 碱基组成 (6) 温度 (二) 聚丙烯酰氨凝胶电泳 以聚丙烯酰氨作支持物,单体丙烯酰氨在加入交联剂后, 以聚丙烯酰氨作支持物,单体丙烯酰氨在加入交联剂后, 就成聚丙烯酰氨.由于这种凝胶的孔径比琼脂糖胶要小, 就成聚丙烯酰氨.由于这种凝胶的孔径比琼脂糖胶要小,所以 可用于分析相对质量小于1000bp DNA片段和RNA的电泳 1000bp的 片段和RNA的电泳. 可用于分析相对质量小于1000bp的DNA片段和RNA的电泳.
核酸2
2. 碱水解：
RNA可被碱水解为核苷酸。
DNA对碱具有一定抗性。
RNA的磷酸酯键对碱敏感 室温，0.3-1mol/L KOH，18-24h，可将RNA完
全水解，得到2’-ysis of RNA under alkaline conditions.
3. 酶水解：
定义：
高温、酸、碱及某些变性剂（如尿素等）能破
坏核酸中的氢键，使有规律的双螺旋结构变成单
链的、无规律的线团，此作用称DNA的变性。
•变性不涉及共价键的断裂。 •变性后，核酸紫外吸收值增加，粘度、比旋下降，生物
活性部分或全部丧失。
Stages in the reversible denaturation and renaturation of DNA.
• 核酸酶（nuclease）（特异性地水解核酸）
根据作用方式
核酸内切酶 核酸外切酶
核糖核酸酶 如：牛胰核糖核酸酶（ RNaseⅠ）
根据底物 核糖核酸酶T1
脱氧核糖核酸酶 如：牛胰脱氧核糖核酸酶（DNaseⅠ）
牛脾脱氧核糖核酸酶（DNase Ⅱ） 限制性核酸内切酶
An example of nuclease specificity: The specificity of RNA hydrolysis by bovine pancreatic Rnase （RNaseⅠ）.
（670nm比色）
（2）二苯胺法定性、定量鉴定DNA: 加热 D-2-脱氧核糖 + 酸 + 二苯胺 冰醋酸，少量浓硫酸
蓝色物质
（595nm比色）
（3）核酸的溴化乙锭（EB）染色： EB是一种荧光染料，可插入核酸相邻碱基对之间。在紫
外灯下，结合EB的核酸呈橙红色荧光。
核酸的研究方法
二、的化学法测序
• 化学法测序由和于1977年所发明。 • 基本原理：用特异的化学试剂作用于分子中不
同碱基，然后用哌啶切断反应碱基的多核苷酸 链。用4组不同的特异反应，就可以使末端标 记的分子切成不同长度的片段，其末端都是该 特异的碱基。经变性胶电泳和放射自显影得到 测序图谱。
2、的加样量与加样方法。 A：浓度太高，易产生拖尾与弥散
现象；太少，分辨不清。一般 0.1已足够肉眼观察。 B：样品液要与样品缓冲液（溴芬 兰指示剂+50%蔗糖）混合。加样
3、（溴化乙锭）染色 A：在胶中和电泳缓冲液中同时加
入0.5。 B：只在胶中加入0.5。 C：电泳完毕后，将胶放在含有0.5
• 聚丙烯酰胺凝胶的孔径比琼脂糖胶要小，所 以可用于分析相对分子质量小于1000的片段 和的片段。分辨率很高，只相差1个的核酸 片段也能分开。
• 聚丙烯酰胺中一般不含有，用于的分析不会 分解样品
第三节 核酸的核苷酸序列测定
一、酶法测序
• 又称 “加减法” • 于1975年设计，工作原理：
先随机合成片段， 然后除去4种dNTP
• 再利用苯酚或氯仿-异戊醇或广谱蛋白酶 去除蛋白质
一、的分离
浓盐法：
浓盐破碎细胞 离心，取上清
加水，使沉淀
酚/氯仿去蛋白，纯化
二、的分离
• 制备通常需要注意3点： • ①所有用于制备的玻璃器皿都要经过高温焙烤，
塑料用具经过高压灭菌，不能高压灭菌的用具 要用0.1％焦碳酸二乙酯()处理，再煮沸以除 净。能使蛋白质乙基化而破坏活性。 • ②在破碎细胞的同时加入强变性剂(如胍盐)使 失活。 • ③在的反应体系内加入的抑制剂(如)。
核酸检测原理和方法
核酸检测原理和方法核酸是以氮基对（Nucleotide）为组成单位的高分子化合物，是调控生物体活动和遗传特征的重要物质，也是临床诊断的重要技术手段。
本文将全面介绍核酸检测的原理和方法，以期可以帮助读者提升核酸检测的知识水平。
一、核酸检测原理核酸检测完全依赖于核酸的特性，它具有稳定性、可重组性与复制性等特点，因此核酸检测的原理涉及到核酸的分离、检测和定量三要素。
1.酸分离：核酸分离是核酸检测的第一步，包括体内采集、细胞或组织抽提和分子抽提等，这些都是以实现核酸的分离提取为目的的各种技术。
2.酸检测：核酸检测是指用特殊的实验方法，经过抽取和分离的核酸，可以检测出核酸的性质、引物序列、单体或多体等内容。
3.酸定量：核酸定量是指检测核酸含量的定量方法，它是在实验室作用下，根据核酸检测的结果估算样本含量的方法。
二、核酸检测方法核酸检测方法可分为生物实验法和仪器法，其中生物实验法有定量PCR（polymerase chain reaction）、基因扩增技术、限制性片段长度多态性（RFLP）、 Southern blot技术、Northern blot技术和定点突变检测等。
仪器法有质谱技术（MS）、核磁共振技术（NMR）、荧光分析技术（Fluorescence Assay）、DNA测序技术（Sequencing）、超敏聚合酶链反应（PCR）等。
三、应用核酸检测的应用正在不断的发展和完善，目前主要用于临床诊断、基因组学研究及基因工程以及制药等方面，它可以有效检测病毒、细菌、真菌等微生物，以及某些疾病的标志物，从而指导临床实施精准用药。
四、结论从上述介绍可知，核酸检测是一种在临床实践中应用广泛，能够进行精准检测的技术，而它的原理及检测方法也是技术工作者应该掌握的基本技能。
未来，核酸检测还将在临床诊断及科学研究等领域发挥重要作用，而随着测序技术的发展，核酸检测在临床实践中的价值也将不断提升。
核酸抽样工作原理
核酸抽样工作原理
核酸抽样工作原理是通过采集样本中的核酸分子，通过特定的处理步骤将核酸分子提取出来进行后续的分子生物学分析。
以下是核酸抽样的基本工作原理：
1. 采样：根据需要，采用合适的方法和工具采集样本，常见的样本包括血液、唾液、粪便、尿液等。
2. 细胞破碎：对于含有细胞的样本，首先需要将细胞破碎，以释放细胞内的核酸。
通常使用化学物质或机械方法破碎细胞。
3. 核酸提取：根据不同的样本类型和需要，选择合适的核酸提取方法。
常用的方法包括酚-氯仿提取法、磁珠提取法、硅胶
柱提取法等。
这些方法可以将核酸从其他非核酸成分分离出来。
4. 纯化和浓缩：提取到的核酸可能会含有其他杂质，需要进行纯化。
常用的纯化方法包括酒精沉淀和筛选PCR纯化试剂盒等。
此外，还可以通过浓缩方法提高核酸的浓度。
5. 质量评估：通过核酸电泳、分光光度计等方法对提取到的核酸进行质量评估，检测核酸的纯度和浓度。
6. 存储：将提取纯化后的核酸样品存储在适当的条件下，如低温、干燥和避光环境中，以保证其稳定性和长期保存。
核酸抽样工作原理是一系列步骤的组合，可以根据不同的实验目的和需求进行调整和优化，以获得高质量的核酸样品。
这些
提取和纯化的步骤对于后续的核酸分析，如PCR、测序等起到了关键作用。
实验四 植物组织中核酸的提取和测定
实验四 植物组织中核酸的提取和测定一、 实验目的1.掌握从植物组织中提取核酸的方法。
2.掌握RNA 、DNA 的定性鉴定方法。
二、实验原理用冰冷的稀三氯乙酸或稀高氯乙酸溶液在低温下抽提植物组织匀浆，以除去酸溶性小分子物质，再用有机溶剂，如乙醇、乙醚等抽提，去掉脂溶性的磷脂等物质。
最后用浓盐溶液(10％氯化钠溶液)和0.5mol ／L 高氯酸(70℃)分别提取DNA 和RNA ，再进行定性鉴定。
由于核糖和脱氧核糖有特殊的颜色反应，经显色后所呈现的颜色深浅在一定范围内和样品中所含的核糖和脱氧核糖的量成正比，因此可用此法来定性、定量测定核酸。
1.核糖的测定测定核糖的常用方法是苔黑酚(即3，5－二羟甲苯法(Orcinol 反应))。
当含有核糖的RNA 与浓盐酸及3，5－二羟甲苯在沸水浴中加热10～20分钟后，有绿色物产生，这是因为RNA 脱嘌呤后的核糖与酸作用后生成糠醛，后者再与3，5－二羟甲苯作用产生绿色物质。
2.氧核糖的测定测定脱氧核糖的常用方法是二苯胺法。
含有脱氧核糖的DNA 和二苯胺在沸水浴中共沸10分钟后，产生蓝色。
这是因为DNA 嘌呤核苷酸上的脱氧核糖与酸生成ω－羟基－6－酮基戊醛，它再和二苯胺作用产生蓝色物质。
此法易受多种糖类及其衍生物和蛋白质的干扰。
上述两种定糖的方法准确性较差，但快速、简便，能鉴别DNA 与RNA ，是鉴定核酸、核苷酸的常用方法。
三、仪器、原料与试剂仪器：恒温水浴锅、离心机、吸管、量筒、电炉、布氏漏斗装置、 烧杯、剪刀。
原料：新鲜菜花(花椰菜) 试剂：1. 95％乙醇：600mL2. 丙酮：400mL3. 5％高氯酸溶液：200 mL4. 0.5mol/L 高氯酸溶液：200mL5. 10％氯化钠溶液：400mL6. 标准RNA 溶液(5mg/100mL)：50mL7. 标准DNA 溶液(15mg/100mL)：50mL8. 粗氯化钠：250g 9. 海砂：5g 10. 二苯胺试剂60mL将1g 二苯胺溶于100 mL 冰醋酸中，再加入2.75 mL 浓硫酸(置冰箱中可保存6个月。
核酸的检测原理范文
核酸的检测原理范文核酸检测是目前新冠病毒检测的常用方法之一、其原理是通过提取样本中的核酸（RNA或DNA），然后通过逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）或核酸序列扩增技术（例如PCR）来检测病原体的存在。
核酸检测的过程分为样本预处理、核酸提取、逆转录和定量PCR放大、检测结果分析等步骤。
首先，在样本预处理过程中，需对采集的样本进行处理，以确保样本中的病原体核酸的完整性和纯度。
例如，对于呼吸道样本，需要将样本中的黏液和其他成分分离以减少干扰物。
样本预处理的目的是清除可能存在的抑制核酸扩增的物质，并提高核酸的纯度，从而提高检测的灵敏度。
接下来，核酸提取是将样本中的病原体核酸从细胞或病毒颗粒中提取出来的过程。
通常使用化学方法或磁珠来提取核酸。
在提取的过程中，核酸提取试剂将与样本中的核酸结合，在特定的条件下，核酸与蛋白质、细胞膜等分离。
提取出的核酸作为RT-PCR或PCR的模板。
然后是逆转录过程，主要用于检测单链RNA病毒，如新冠病毒。
在逆转录过程中，使用逆转录酶将RNA模板转录成相应的DNA。
逆转录常采用聚合酶链反应（PCR），使用逆转录酶和特定的引物或逆转录试剂，将RNA反转录成相应的DNA。
这一步的主要目的是将RNA转化为双链DNA，为接下来的PCR扩增提供模板。
最重要的是定量PCR放大过程，PCR扩增技术根据样本中核酸的模板序列，使用特异性引物和酶来扩增目标序列。
PCR一般采用热循环反应，通过多个温度区域进行不同的反应步骤，如变性、退火和延伸，从而在每个循环中扩增DNA序列。
这样经过多个循环后，目标序列会被指数级扩增，放大到检测的可识别范围。
PCR的结果可以通过凝胶电泳等方法进行直观的检测，也可以利用实时定量PCR设备进行定量分析。
最后，检测结果分析是对核酸扩增反应体系进行读数和结果判断。
使用荧光或吸光度测定，定量PCR设备可以实时测量PCR反应中特定荧光信号的增长，并根据设定的标准曲线来确定目标序列的数量。
核酸的分离
核酸的分离
1. 酚-氯仿抽提法：这是一种传统的核酸分离方法，常用于从细胞或组织中提取 DNA。
该方法利用酚和氯仿的混合物来溶解细胞膜和蛋白质，而核酸则不溶于其中。
通过离心和萃取步骤，可以将核酸与其他成分分离开来。
2. 离心柱法：离心柱法是一种快速、简便的核酸分离方法。
它使用特殊的离心柱，其中填充了吸附核酸的树脂或膜。
将细胞或组织裂解物加载到离心柱上，通过离心和洗涤步骤，核酸可以选择性地结合到柱子上，而其他杂质被洗去。
3. 磁珠法：磁珠法利用磁性颗粒来结合核酸。
这些磁珠通常表面修饰有特定的探针或抗体，可以与目标核酸结合。
通过外加磁场，可以将结合了核酸的磁珠从混合物中分离出来。
4. 凝胶电泳：凝胶电泳是一种基于分子量差异的核酸分离方法。
它将核酸样品加载到琼脂糖凝胶中，并在电场作用下分离不同大小的核酸片段。
通过电泳后的染色或荧光标记，可以检测和分离特定大小的核酸。
5. 色谱法：色谱法包括亲和层析、离子交换层析和尺寸排阻层析等技术，可以根据核酸的物理和化学性质进行分离。
这些方法通常用于纯化和分离特定类型的核酸。
无论使用哪种核酸分离方法，都需要注意操作的准确性和实验条件的控制，以确保获得高质量的核酸样品。
核酸分离是许多分子生物学和遗传学研究的基础步骤，对于后续的分析和应用非常重要。
基础生物化学-核酸化学联系
第一章核酸化学或第一节核酸导言一、核酸的发现1868年，瑞士的科学家F.Miescher从外科绷带上的脓细胞的核中分离出一种富含磷元素的酸性化合物，称为“核素”(nuclein)。
1889年，Altman等人从酵母和动物的细胞核中制得了不含蛋白质的核酸，首次使用“核酸”（nucleic acid）一词。
二、核酸是遗传与变异的物质基础1944年O.t.Avery等人通过细菌转化实验（肺炎双球菌转化实验）证明核酸是遗传物质。
PPT部分如下：S球菌：有毒肺炎球菌，光滑、有夹膜。
R型球菌：无毒肺炎球菌，粗糙、无夹膜。
二、核酸的种类及分布核酸是生物体内的高分子化合物，包括DNA和RNA两大类。
1.脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid, DNA)分布：原核生物：核质区、质粒。
真核生物：95%在细胞核、5%在线粒体和叶绿体。
功能：携带遗传信息，决定细胞和个体的基因型(genotype)。
2.核糖核酸（ribonucleic acid, RNA）分布：原核生物：细胞质真核生物： 75%在细胞质15%在线粒体和叶绿体10%在细胞核RNA种类：mRNA （信使RNA , messenger RNA）：约占总RNA的5％，蛋白质合成模板。
rRNA（核糖体RNA，ribosoal RNA）：约占总RNA的80％，核蛋白体组分。
原核生物核糖体中有三类rRNA：5S、16S、23S真核生物核糖体中有四类rRNA：5S、5.8S、18S、28StRNA（转移RNA，transfer RNA）：约占总RNA的10％～15％，转运氨基酸。
hnRNA（核内不均一RNA）:成熟mRNA的前体。
snRNA(核内小RNA)：参与hnRNA的剪接、转运。
snoRNA（核仁小RNA）：rRNA的加工、修饰。
scRNA（胞浆小RNA）：蛋白质内质网定位合成的信号识别体的组分。
第二节核酸组成成分一.元素组成主要元素有C、H、O、N、P与蛋白质比较，核酸一般不含S，而P的含量较为稳定，占9-11%。
核酸的物理化学性质和第15章核酸的研究方法辅导版
为了水解嘧啶糖苷键，需要较高的温度。用甲 酸（98%～100%）密封加热至175℃2h，无论RNA 或DNA都可以完全水解，产生嘌呤碱和嘧啶碱，缺 点是尿嘧啶的回收率较低。改用三氟乙酸在155℃加 热60min（对DNA）或80min（对RNA），嘧啶碱的 回收率显著提高。
DNA分子的热变性曲线
异质的
DNA变性温
度范围宽，
均质的DNA 变性温度范
bacterial DNA
Viral DNA
围窄。
影响DNA分子Tm的因素
（1）G－C含量：G－C之间有3个氢键，所以G －C含量越高Tm越高。通过测定Tm值，可以推
算出DNA中G－C的含量，其经验公式为:
xGC (Tm 69.3) 2.44
RNA只有局部的双螺旋，所以其Tm较低，变
性温度范围较宽。不管是DNA还是RNA，加入甲
酰胺可降低其Tm值。双链RNA的变性曲线几乎与 双链DNA相同。
1.一种浮萍的18SrRNA
2.酵母的杀伤RNA（双 链）加甲酰胺
3.同2，但无甲酰胺
DNA的复性
变性DNA在适当条件下，可以使两条分开的
单 链重 新 缔合 成 双链 DNA， 这 个 过程 称 为复 性 （renaturation）。将热变性的单链DNA骤然冷却， DNA不 能 复性 ， 只有 缓 慢降 温 才能 使 热变 性 的 DNA复性，这个过程又称为退火（annealing）。
核酸的碱水解
RNA的磷酸酯键易被碱水解，产生核苷酸。
第九章核酸的分离与提纯
核酸得种类
脱氧核糖核酸(DNA):细胞核,单链或双链
核糖体RNA
核糖核酸(RNA) 转运RNA 信使RNA
细胞质, 单链或双链
但无论哪核酸,在生物体中一般以核蛋白得形式存在, 因此,为了提取制备核酸,必须将核蛋白解联(即利用接
联剂将核蛋白裂解为核酸和蛋白)并去除蛋白, 同时必须维持核酸得天然性状,不使核酸发生变性或降
常与其她方法结合使用。
5、高通量得RNA分离技术
(1)微量移液法(micropipeting)
由Karrwer等人于1995年建立得一种方法。 特点:此法借助毛细管或微量移液管直接提取细
胞得内含物,进行RNA抽提。
操作过程
用激光移液管拉伸器(1aserpipette puller)将毛细石 英管拉成孔径为l0um得微量移液管,将其顶端弯曲23°, 以便穿透细胞壁。
分离总RNA
分离细胞器DNA RNA poly(A)RNA 特异DNA
感染或转染细胞(病毒型) 转化细菌细胞(质粒型)
分离病毒颗粒
培养转化细胞、收集菌体
病毒载体DNA分离与纯化
破碎细胞
பைடு நூலகம்
质粒DNA分离与纯化
大家学习辛苦了，还是要坚持
继续保持安静
(3)防止核酸得生物降解
细胞内外各种核酸酶可作用于磷酸二酯键,直接破坏核酸得 一级结构,使其降解;
DNA酶需要Mg 2+、Ca 2+得激活,因此实验中常加入 EDTA、柠檬酸盐,以络合核酸酶作用时所必需得Mg 2+离 子,以抑制DNA酶得活性;
制备RNA则需克服核糖核酸酶(RNase)得降解作用。因为 RNase不但分布广泛,极易污染,而且耐高温,即使加热到蛋 白变性, Rnase得活力也不会完全丧失,且具有惊人得回复 力,而细胞内得核蛋白又总就是和她联在一起,若去除不彻底, 她将部分恢复活力,导致RNA降解。
【大学】核酸的研究方法
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（二）RNA的分离
制备RNA时，最重要的是使RNase灭活：
①所有容器都要经过高温处理，不能高温高压 的用0.1％焦碳酸二乙酯（DEPC）处理。
②加入强变性剂（如胍盐）使RNase失活；
③在RNA的反应体系内加入RNase三）核酸含量的测定
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1、紫外吸收法 1个A～50μg/ml 双链DNA ～40μg/ml RNA或单链DNA
2、定糖法 RNA：核糖→ 糠醛→ →绿色物质（670-680nm）
浓HCl 苔黑酚/地衣酚
DNA：脱氧核糖+二苯胺→兰色物质（595-620nm）
浓硫酸
ρ ：浮力密度 ω ：角速度（弧度/秒） r：样品到转轴的距离
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（二）测定DNA的G-C含量
G-C含量与DNA的浮力密度之间呈正比关系 ρ=0.1 xG-C + 1.658 xG-C =（ρ-1.658）× 10
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（三）研究核酸的构象
RNA＞DNA 变性DNA＞双链DNA ＞蛋白质， 变性程度越大，浮力密度越大
第15章 核酸的研究方法
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一、核酸的分离、提纯和定量测定
制备天然核酸必需采用温和的条件， 防止过酸、过碱，避免剧烈搅拌，尤其 重要的是防止核酸酶的作用
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（一）DNA分离纯化
真核DNA以核蛋白（DNP）形式存在，DNP 溶于水或高盐溶液（1mol/L NaCl），但不 溶于低盐溶液（0.14mol/L NaCl
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MOV : MCB4.0\Dideoxy sequencing of DNA
631-生物化学 考试大纲
海南大学硕士研究生入学考试《631-生物化学》考试大纲一、考试性质海南大学硕士研究生入学考试初试科目。
二、考试时间180分钟。
三、考试方式与分值闭卷、笔试。
满分150分。
四、考试内容（一）氨基酸1、氨基酸——蛋白质的构件分子2、氨基酸的分类3、氨基酸的酸碱化学4、氨基酸的化学反应5、氨基酸的光学活性和光谱性质6、氨基酸混合物和分析分离（二）蛋白质的共价结构1、蛋白质通论2、肽3、蛋白质一级结构的测定4、蛋白质的氨基酸序列与生物功能5、肽和蛋白质的人工合成（三）蛋白质的三维结构1、稳定蛋白质三维结构的作用力2、多肽主链折叠的空间限制、3、二级结构：多肽链折叠的规则方法4、纤维状蛋白质5、超二级结构和结构域6、球状蛋白质与三级结构7、膜蛋白的结构8、蛋白质折叠和结构预测9、亚基缔合和四级结构（四）蛋白质结构与功能的关系1、肌红蛋白的结构与功能2、血红蛋白的结构与功能3、血红蛋白分子病4、免疫系统和免疫球蛋白5、肌球蛋白丝、肌动蛋白丝与肌肉收缩6、蛋白质的结构与功能的进化（五）蛋白质的分离、纯化和表征1、蛋白质的酸碱性质2、蛋白质分子的大小与形状3、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀4、蛋白质的分离纯化的一般原则5、蛋白质的离纯化方法1.根据分子大小不同的纯化方法2.利用溶解度差别的纯化方法3.根据电荷不同的纯化方法4.利用对配体特异生物学亲力力的纯化方法6、蛋白质的含量测定与纯度鉴定（六）糖类1、糖类的生物学作用.2、单糖的结构3、单糖的物理性质和化学性质4、重要的单糖和单糖衍生物5、寡糖和.多糖及细菌杂多糖6、糖蛋白及其糖链7、糖胺聚糖和蛋白聚糖8、糖链的结构分析（七）脂质1、脂质的生物学作用2、脂肪酸3、三酰甘油4、脂质过氧化作用5、磷脂6、糖脂7、萜和类固醇8、脂蛋白9、脂质的提取、分离与分析（八）核酸通论1、核酸的种类和公布2、核酸的生物功能（九）核酸的结构1、核苷酸2、核酸的共价结构3、DNA的高级结构4、RNA的高级结构（十）核酸的物理化学性质1、核酸的水解2、核酸的酸碱性质3、核酸紫外吸收4、核酸的变性、复性及杂交（十一）核酸的研究方法1、核酸的分离、提纯和定量测定2、核酸的超速离心3、核酸的凝胶电泳4、核酸的核苷酸序列测定5、DNA聚合酶链反应（PCR）（十二）酶通论1、酶催化作用的特点2、酶的化学本质及其组成3、酶的命名和分类4、酶的专一性5、酶和活力测定和分离纯化（十三）酶促反应动力学1、底物浓度对酶反应速率的影响2、酶的抑制作用3、温度对酶反应的影响4、pH对酶反应的影响5、激活剂对酶反应的影响（十四）酶的作用机制和酶的调节1、酶的活性部位2、酶催化反应的独特性质3、影响酶催化效率的有关因素4、酶催化反应机制的实例5、酶活性的调节控制6、同工酶（十五）维生素与辅酶1、维生素概论2、脂溶性维生素3、水溶性维生素4、作为辅酶的金属离子（十六）糖酵解作用1、糖酵解过程2、由葡萄糖转变为两分子酮酸能量转变的估算3、丙酮酸的去路4、糖酵解作用的调节5、其它六碳糖进入糖酵解途径（十七）柠檬酸循环1、丙酮酸进入柠檬酸循环的准备阶段—形成乙酰-CoA2、柠檬酸循环过程3、柠檬酸循环的化学总结算4、柠檬酸循环的调控5、柠檬酸循环的双重作用6、柠檬酸循环的发现历史（十八）生物氧化—电子传递和氧化磷酸化作用1、电子传递和氧化呼吸链2、氧化磷酸化作用（十九）戊糖磷酸途径和糖的其它代谢途径1、戊糖磷酸途径2、糖的其他代谢途径3、葡萄糖出入动物细胞的特殊运载机构4、乙醛酸途径5、寡糖类的生物合成和分解（二十）糖原的分解和生物合成1、糖原的生物学意义2、糖原的降解3、糖原的生物合成4、糖原代谢的调控（二十一）光合作用1、光合作用的概况2、叶绿素的光反应性:光吸收3、光驱动电子流:中心光化学事件4、光驱动的ATP合成:光合磷酸化5、暗反应:CO2固定6、光呼吸和C4途径（二十二）脂肪酸的分解代谢1、脂质的消化、吸收和传送2、脂肪酸的氧化3、不饱和脂肪酸的氧化4、酮体5、磷脂类的代谢6、甾醇的代谢7、脂肪酸代谢的调节（二十三）脂类的生物合成1、贮存脂肪2、脂类的合成（二十四）蛋白质降解和氨基酸的分解代谢1、蛋白质的降解3、氨基酸分解代谢3、尿素的形成4、氨基酸碳骨架的氧化途径5、生糖氨基酸和生酮氨基酸6、由氨基酸衍生的其他重要物质7、氨基酸代谢缺陷症（二十五）氨基酸及其重要衍生物的生物合成1、脂肪族氨基酸的生物合成2、芳香族氨基酸及组氨酸的生物合成3、氨基酸生物合成的调节5、氨基酸转化为其他代谢物（二十六）生物固氮1、生物固氮作用及固氨生物类型2、固氮酶的结构与功能研究3、固氮的基因表达调控4、生物固氮的基因工程（二十七）核酸的降解和核苷酸代谢1、核酸和核苷酸的分解代谢2、核苷酸的生物合成3、辅酶核苷酸的生物合成（二十八） DNA的复制和RNA的生物合成与加工1、DNA的复制2、DNA指导下RNA的合成3、RNA的转录后加工4、在RNA指导下RNA和DNA的合成（二十九）遗传密码1、DNA是遗传信息的携带分子2、RNA传递和加工遗传信息3、遗传密码的破译4、遗传密码的基本特性（三十）蛋白质合成及转运1、蛋白质合成的分子基础2、翻译的步骤3、蛋白质的运输及翻译后的修饰（三十一）细胞代谢与基因表达调控1、细胞代谢的调节网络2、酶活性的调节3、细胞结构对代谢途径的分隔控制4、细胞信号传递系统5、基因表达的调节。
hplc和质谱在核酸检测方面的应用
hplc和质谱在核酸检测方面的应用
HPLC和质谱在核酸检测方面的应用十分广泛，可以用于核酸的定性、定量和结构分析等方面。
HPLC（High Performance Liquid Chromatography）是一种高效液相色谱技术，通过其高分辨率、高灵敏度和高精确度的特点，可以用于核酸检测的定量分析。
例如，可以利用反相色谱柱对核酸样品进行分离，通过检测样品中核酸特有的吸收或荧光信号，定量分析核酸的含量。
质谱（Mass Spectrometry）则是一种分析技术，通过测量样品中离子质量和相对丰度的比例，可以用于核酸的定性和结构分析。
质谱技术可以将核酸样品转化为离子，并经过质谱仪进行质量-电荷比（m/z）的测量，进而确定核酸的分子量、序列和结构。
具体来说，在核酸检测方面，HPLC和质谱常常结合应用。
例如，HPLC可以与荧光检测器、紫外检测器或电化学检测器等联用，实现核酸的分离和定量测定。
而质谱技术可以用于核酸测序、核酸基序的鉴定以及修饰基的分析等。
总的来说，HPLC和质谱在核酸检测方面的应用能够提供高灵敏度、高分辨率和高特异性的分析结果，为核酸研究和生物医学领域提供了重要的工具和方法。
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核 酶法的技术基础主要有：（）用凝胶电泳分离单
酸
链片断时，小片断移动快，大片断移动慢，用适
的 研
当的方法可分离分子大小仅差一个核苷酸的片断。 （）用合适的聚合酶可以在试管内合成单链模板 的互补链。反应体系中除单链模板外，还应包括
究
合适的引物，种脱氧核苷三磷酸和若干种适量的
方 无机离子
法
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研 在所有 种反应中，哌啶也催化磷酸二酯键的
究 断裂，而这些断裂只发生在被哌啶所取代的
方 修饰碱基处。
法
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（三）的测序
第
15
章 主要个方法
（）用特异酶切法
核 从胰脏提取的 水解链中的嘧啶核苷酸的键——产
酸 生’端均为嘧啶核苷酸的寡聚片段
的 研
米曲霉 特异水解鸟嘌呤相邻的磷酸酯键——产 生’端均为鸟嘌呤核苷酸（…… )的寡聚片段
第
15 章
个人收集整理，仅供交流学习！
核
酸
的
研
究
方
法
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第 三、核酸的凝胶电泳 15 章
、琼脂糖凝胶电泳
核 酸 、聚丙烯酰胺凝胶电泳 的 研 究 方 法
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四、核酸的核苷酸序列测定
第
15 的序列测定目前多采用提出的酶法，和提出的化
章
学法 的策略：是把确定逐个核苷酸的序列测定变为以
测定片段长度推测序列。
第
15 章 热循环：
变性：℃ ，
核 退火：一般为引物中较低的减，
酸
延伸：℃ ， 扩增产量：
的 ()
研 :产量；扩增效率；循环次数
究方ຫໍສະໝຸດ 法YOUR SITE HERE
第 15 章
核
酸
的
研
究
方
法
(逆转录)
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第
15 章
个人收集整理，仅供交流学习！
核
酸
的
研
究
方
法
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T
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第 15 序列测定的新进展
章
用 种发射波长不同的荧光物质分别标记引物 或 种不同的双脱氧核苷酸，终止反应后，管
核 反应物可在同一电泳道上电泳，用激光扫描仪
酸 收集电泳信号，经计算机处理可直接打印出来
的 这种技术一次可测定个左右的核苷酸序列
研
究
方
法
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究
方
法
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第
15
章 从黑粉菌中分离的 在一定条件下特异性水解腺苷
酸的键
核 从多头粘菌分离的 水解、、三种核苷酸，但不
酸 水解胞苷酸
的 （２）用化学试剂裂解 研 （原理同化学法） 究 （３）逆转录成法
方
法
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五、聚合酶链反应（）
第
15
章 反应体系组成：
()引物。与被分离的目的基因两条链和一端序
核 酸
列互补的引物（通常) ()热稳定的聚合酶（如 聚合酶） ()四种
的 ()作为模板的序列（即要分离的目的）
研
究
方
法
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5’ 3’
第 15 章
核 酸 的 研 究 方 法 反应原理
变性并与引物退火 延伸 变性并与引物退火
延伸
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第 :硫酸二甲酯对的进行甲基化，然后在 间开 15 环，随后哌啶从戊糖处取代被修饰的鸟嘌呤。
章 ＋：甲酸使嘌呤环中氮的质子化，减弱了和
的糖苷键，然后哌啶取代了嘌呤。
核 ＋:肼使和的嘧啶环裂开，然后这些碱基化片
酸 的
段能被哌啶所取代。
：在存在时，只有与肼发生反应，修饰后的 能被哌啶所取代。
的 、在有一定盐存在下，加二倍体积的冷乙醇，
研
沉淀，用乙醚或乙醇洗涤后干燥。
究
方
法
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真核细胞的分离（方案二）
第
15 章
细胞悬浮液
直接加入
核
倍体的 的缓冲液
酸 的 广谱蛋白酶（如蛋白酶） 研℃
究
方
苯酚抽提
法
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第 （二）的分(离二）的分离
15 比更不稳定，到处存在 章 通常制备要注意点：
第章核酸的研究方法
0
第
15 一、核酸的分离、提纯和定量测定 章
二、核酸的超速离心
核 酸 三、核酸的凝胶电泳
的 研 四、核酸的核苷酸序列测定
究 五、聚合酶链反应（） 方
法
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一、核酸的分离、提纯和定量测定
第 15 章
防止降解和变性
核
采用温和的条件，防止过酸过碱，避免
酸 剧烈搅拌，尤其防止核酸酶的作用
制备了套脱氧寡核苷酸，把一种碱基特异性化
核
学试剂加到纯化的’或’末端标记脱氧寡核苷 酸中，使在一或二个特殊的核苷酸处随机断裂
酸 由于只有末端标记的片段在随后的测序胶放射
的 自显影中被看到，所以梯度被看到
研
究
方
法
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化学测序策略
第 15 章
核 酸 的 研 究 方 法
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’’双脱氧核糖核苷酸的结构（)
第
15
碱基有A、C、G、T
章
核
酸
的
研
究 对应四种碱基有四种双脱氧核苷三磷 方 酸ddATP、ddCTP等
法
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酶法核序列分析测定原理（从原理上讲的方法是开创性的）
酶法核序列分析测定原理（续）
第
15 章 电极 A
-
C
G
核 酸 的 研 究 方 法+
第 15 大分子的序列测定策略 章
核心：化大为小、化整为零、分段测序、最
核
后获得整体序列。
酸 步骤为：建立遗传图谱—获得物理图谱—测
的
序
研 前二步实际上是在分子上寻找建立化大为小
究
的标志，为化大为小、分段测序奠定基础。
方
法
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（二）的 化学法测序
第
15
章 由和创立的化学测序方法
（一）于年设计的“加减法”
第
15 章 引物
DNA聚合酶
核
4dNTPs（一种带32P 标记）
酸
的
研
究
方
法
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第 15 章
减法系统
核 如 -A 酸 的 研 究 方 法
加法系统 如 +A
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第
电泳分离8组加减法样品
15
章
’’ ’’
核
酸
的
研
究
方
法
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的
研
究
方
法
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第
15
(一）的分离
章
核 总的原则：先提取染色体，再去除蛋
酸 白质
的
研
究 氯化铯密度梯度离心制备
方
法
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真核生物染色体的分离：
第
15
章 、利用的溶解性分离：
溶于水和浓盐溶液（如 ），但不溶于生理盐
核
溶液（ ）
酸
、再以苯酚抽提，除去蛋白质（反复几次） （也可用氯仿异戊醇）
第 15 分光光度法： 章 、定糖法：
核糖的测定方法：苔黑酚法（苔黑酚亦称地衣酚，
是二羟甲苯）
核 含有核糖的与及苔黑酚在沸水浴中加热—，有绿 酸 色物质产生，
的 脱氧核糖的测定：二苯胺法（即中的二个被苯环 研 取代）含脱氧核糖的在酸性条件下与二苯胺在 究 沸水浴中加热，产生蓝色
方
法
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第
15 、紫外分光光度法： 章 ε ()
每升中磷的重量（）磷的原子量（）
核
ε ()
酸 的
天然 ε () 为， ε () 为 则（） [ ]÷ （） [ ]÷
研
究
方
法
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细胞或组织中核酸组分的分离和含量的测定
生物组织
的过氯酸或
冷的稀酸 三氯乙酸
酸溶性物质 残留物
有机溶剂抽提
（）所有玻璃器皿都有经高温焙烤，塑料用品经高
核 压灭菌，不能高压灭菌的要用的焦碳酸二乙酯处 酸 理。 的 （）细胞破碎时加入强变性剂（如盐酸胍） 研 （）加入抑制剂()
究
方 法
()用()亲和柱层析
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第
15
（三）核酸含量的测定
章
核
定磷法：定磷试剂
酸
兰色物质，
的
研
究
方
法
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脂溶性物质 残留物
碱法 碱降解再酸化
热酸法
冷酸法
酸提取液 残留物
残留物 残留物 酸提取液
（RNA）
(DNA) 酸抽提液 (RNA+DNA)
热酸 (RNA) 残
DNA
二、核酸的超速离心
第 15 章 、核酸密度的测定
氯化铯密度梯度离心
核 ρρ ω() × 酸 ρ标准的密度 的 、中含量的测定 研 ρ , ρ为浮力密度 究 、用于核构象的研究 方 、用于核酸的制备 法