慢病毒的浓缩与纯化——PEG-8000浓缩法
病毒纯化浓缩方法
病毒纯化浓缩方法方法一超速离心沉淀法1 仪器超速离心机(BECKMAN OPTIMAL-80XP) 50000~80000rpm相对离心力最大可达510000×g；高速冷冻离心机(BECKMAN AVANTIJ-26XP)20000~25000rpm 最大离心力为89000×g；超速离心管 (Beckman 344058)，Ultra-clear SW28离心管2 方法步骤（1）转染后44-48小时，收集上清液到50ml离心管内，并加入20ml Production 培养基以便第二轮病毒的收集。
将收集的上清液4℃，4000g离心10分钟，去除细胞碎片，然后0.45 μm滤膜过滤到40ml超速离心管中。
（2）取6个Beckman超速离心管，70%乙醇清洗后在生物安全柜中风干并紫外消毒30min。
（3）每个Ultra-clear SW28管加入30ml 预先处理过滤过的病毒上清。
（4）取一支10ml的移液管，吸取12 ml 20%的蔗糖溶液(PBS配制)。
将移液管一直插入到离心管的底部，缓慢将蔗糖溶液打出4 ml，形成一个蔗糖垫。
同样地，将剩下8 ml的蔗糖溶液分别加入到另两个离心管中。
另取一支干净的移液管，对剩下3管进行同样处理。
（5）务必确定离心管没有裂缝且用PBS调整各管重量使两两平衡。
（6）4℃离心，25000rpm （82700g）2 h。
（7）离心完毕后小心取出超速离心管，小心弃去上清液，留下管底沉淀。
管底可见少量的半透明或白色沉淀。
将超速离心管倒置在吸水纸上晾干约10min，并用Tip头吸去管壁上多余的液体。
（8）每管中加入100ul不含钙和镁的冷PBS洗下沉淀。
（9）将SW28超速离心管插入到50ml锥底离心管中，盖上盖子。
（10）在4℃溶解2小时，每隔20分钟轻轻震荡。
（11）4℃，500g离心1分钟，使溶液集中于管底。
（12）用200μl 移液器轻柔吹打使沉淀重悬。
整理)慢病毒稳转细胞株步骤
稳转慢病毒一、所需试剂1、慢病毒载体（详细信息见附录及《质粒的扩增提取》）（大肠杆菌-80℃保存2-3年，质粒-20℃保存2-3年，病毒液-80℃保存1年）（1）载体质粒：两端的LTR、剪切位点、包装信号Ψ以及抗性或荧光基因、gag基因5′端350bp的序列及位于env序列中的RRE，含宿主RNA聚合酶识别部分（2）包装质粒（psPAX2）：包含了pol、gag包装成分（3）包膜质粒（pMD2.G）：用其他病毒的包膜蛋白代替了env基因.三种质粒共同转染产生不具有自我复制能力的病毒载体。
2、包装细胞：293T细胞3、菌株：大肠杆菌，用于提取质粒4、转染试剂：XTREME-GENE（-20℃保存，不可分装），一种脂质与其他组份构成的混合物5、浓缩试剂（配好后4℃保存，原材料室温保存）：5X PEG8000/NaCl溶液（聚乙二醇）：NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中，高压蒸汽灭菌**也可直接从公司买来病毒液（-80℃封口膜封口冻存管保存，4℃保存3天）：滴度一般为108TU/ml6、10mg/ml polybrene（-20℃分装保存）：溴化己二甲铵。
是带正电的小分子，与细胞表面的阴离子结合，提高慢病毒对细胞的感染效率，通常加入polybrene 能提高感染效率2～10 倍。
有一定细胞毒性，需要摸索浓度（1～10μg/ml）7、无血清培养基：optimen8、贴壁细胞（复苏后3代以上的细胞）9、puromycin：嘌呤霉素，用于筛选稳转细胞二、具体步骤<一>病毒包装与收集（中皿，转染步骤类似于瞬转）第一天1、种板，10×105个293T细胞，加入全培养基双抗DMEM 4-5ml，过夜2、配制5X PEG8000/NaCl溶液称取NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中；121摄氏度30min 湿热灭绝30min；保存在4℃第二天2、加入2ml全培养基DMEM3、将1加入2，孵育10h，换成5ml全培养基第四天第五天：1、9:00和17:00各收取一次5ml培养液，共20ml（-80℃保存）2、过滤：用孔径为0.45mm的过滤器除去上清中的293T细胞3、加入5ml 5XPEG8000/NaCl溶液，每30min-1h上下摇匀一次4、4℃过夜第六天1、4℃，3500rpm，20min2、弃上清，倒扣纸上静置1-2min，吸干残余液体3、加入120-150μl PBS，缓慢吹打，以防形成气溶胶4、50μl分装，-80℃保存。
慢病毒生产及使用操作技巧介绍材料
慢病毒生产及使用操作手册一、实验流程制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，共转染293T细胞，转染后6 h 更换为完全培养基，培养48和72h后，分别收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，病毒上清液通过超离心浓缩病毒。
以下内容由汉恒生物科技（上海）有限公司精心整理总结。
二、实验材料（一）慢病毒载体、包装细胞和菌株该病毒包装系统为三质粒系统，组成为pspax2, pMD2G, pHBLV TM系列质粒。
1、载体信息（见附录）2、细胞株293T，慢病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为DMEM(含10% FBS)。
贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。
3、菌株大肠杆菌菌株DH5α。
用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒。
三、包装细胞293T细胞的培养（一）293T细胞的冻存随着传代的次数增加，293T细胞会出现生长状态下降、突变等。
为了防止此类现象的出现，我们需要在开始就对细胞进行大量冻存，以保证实验的稳定性和持续性。
在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。
1、去掉上清液，加入PBS洗去残留的培养基；2、加入0.25%的胰酶，消化1～2min后，镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，去除胰酶，加入新鲜培养基吹打混匀，移入离心管中。
3、细胞计数，将细胞全部晃下，加入3mL 37 ℃预热的10％DMEM，用10mL 移液管进行吹打，较大力吹打6～8 次即可，不留死角，之后，将所有细胞吸出，置于15mL 离心管中，取50ul 混匀后的细胞于1.5mL eppendorf 管中，加入450ul 10％DMEM，即为10 倍稀释，混匀，取10ul 细胞于计数板中计数。
计数板上共4 大格，每大格16 小格。
计数时，4 大格均计数，总数除以4（得每大格细胞数），再乘以10（10 倍稀释），即为实际n万/mL 细胞浓度。
4、细胞离心，1000rpm，5min。
慢病毒纯化
慢病毒纯化
慢病毒纯化是指从慢病毒病毒培养物中分离和纯化出慢病毒颗粒的过程。
这个过程通常包括以下步骤：
1.细胞培养：首先，需要将慢病毒所感染的细胞系培养到适
当的细胞密度和病毒扩增时间，以确保足够的病毒产量。
2.细胞裂解：将培养的细胞收集并经过离心等方法分离，然
后使用裂解缓冲液裂解细胞，释放出细胞内的慢病毒。
3.离心和过滤：经过细胞裂解后，样品需要进行离心，以去
除细胞碎片和核酸残余物。
然后，可以使用过滤器对澄清
的上清液进行过滤以去除大颗粒物质。
4.病毒浓缩：慢病毒通常是低浓度的，因此需要进行浓缩。
可以使用超滤、离心和沉淀等方法，将病毒颗粒从大量液
体中浓缩到较小的容量中。
5.梯度离心：为了进一步纯化病毒，可以使用梯度离心技术，
如葡聚糖梯度离心或离心浓缩。
这个过程可将纯化的病毒
与细胞碎片、蛋白质和其他污染物分离开来。
6.病毒沉淀：经过梯度离心后，可以进行病毒的最终沉淀。
使用离心来将病毒沉淀到盘底或在离心管底端形成浓缩的
沉淀。
7.再悬浮：将病毒沉淀用缓冲液再悬浮，以便进行后续实验
应用。
在整个慢病毒纯化的过程中，必须遵守基本的生物安全措施，
并使用无菌操作、合适的缓冲液和处理设备。
每一步之间的温度、离心速度和离心时间等参数也需要根据具体的实验条件和病毒类型进行优化和调整。
整理)慢病毒稳转细胞株步骤
稳转慢病毒一、所需试剂1、慢病毒载体（详细信息见附录及《质粒的扩增提取》)（大肠杆菌-80℃保存2—3年，质粒—20℃保存2-3年，病毒液-80℃保存1年）(1)载体质粒：两端的LTR、剪切位点、包装信号Ψ以及抗性或荧光基因、gag基因5′端350bp 的序列及位于env序列中的RRE，含宿主RNA聚合酶识别部分（2）包装质粒（psPAX2)：包含了pol、gag包装成分(3)包膜质粒（pMD2。
G)：用其他病毒的包膜蛋白代替了env基因.三种质粒共同转染产生不具有自我复制能力的病毒载体。
2、包装细胞：293T细胞3、菌株：大肠杆菌，用于提取质粒4、转染试剂:XTREME-GENE（-20℃保存，不可分装),一种脂质与其他组份构成的混合物5、浓缩试剂(配好后4℃保存,原材料室温保存）:5X PEG8000/NaCl溶液(聚乙二醇)：NaCl 8.766 g；PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中,高压蒸汽灭菌*＊也可直接从公司买来病毒液（—80℃封口膜封口冻存管保存，4℃保存3天)：滴度一般为108TU/ml6、10mg/ml polybrene（—20℃分装保存)：溴化己二甲铵.是带正电的小分子，与细胞表面的阴离子结合,提高慢病毒对细胞的感染效率，通常加入polybrene能提高感染效率2~10 倍。
有一定细胞毒性，需要摸索浓度（1～10μg/ml）7、无血清培养基：optimen8、贴壁细胞(复苏后3代以上的细胞）9、puromycin：嘌呤霉素，用于筛选稳转细胞二、具体步骤<一〉病毒包装与收集(中皿,转染步骤类似于瞬转)第一天1、种板,10×105个293T细胞,加入全培养基双抗DMEM 4—5ml，过夜2、配制5X PEG8000/NaCl溶液称取NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中；121摄氏度 30min 湿热灭绝 30min;保存在4℃第二天2、加入2ml全培养基DMEM3、将1加入2，孵育10h，换成5ml全培养基第四天第五天：1、9：00和17：00各收取一次5ml培养液,共20ml（-80℃保存)2、过滤:用孔径为0。
慢病毒纯化
慢病毒纯化引言慢病毒（Slow virus）是一类具有潜伏期长、传播缓慢的病毒。
它们主要侵害中枢神经系统，引起一系列慢性疾病，如亚急性硬化性全脑炎、破伤风等。
由于慢病毒的潜伏期长、传播缓慢，对患者的治疗和预防带来了极大的困难。
因此，对慢病毒的纯化研究至关重要。
纯化方法慢病毒纯化是将慢病毒分离和提纯出来的过程。
常用的慢病毒纯化方法包括超速离心法、聚合物沉淀法、密度梯度离心法等。
以下将介绍使用密度梯度离心法进行慢病毒纯化的步骤和技术要点。
材料准备•脑组织样本（含有慢病毒）•PBS缓冲液•10% Triton X-100•加碘氯仿•硫酸铂•Sucrose•KBr步骤1.准备慢病毒感染的脑组织样本，并用PBS缓冲液进行冲洗，去除杂质。
2.将脑组织样本加入适量的PBS缓冲液中。
3.加入10% Triton X-100，破解细胞膜并释放病毒。
4.使用高速离心将细胞碎片和杂质从悬浮液中分离出来。
5.收集上清液，加入加碘氯仿，离心使其分离。
6.将上清液转移到新离心管中，然后加入一定浓度的硫酸铂。
7.使用离心机进行高速离心，使病毒与硫酸铂结合。
8.分离上清液，加入Sucrose溶液中。
9.准备密度梯度离心管，将上清液缓慢地加入离心管中。
10.使用超速离心机进行离心，使病毒在密度梯度中分离。
11.分离纯化后的病毒。
技术要点密度梯度离心法密度梯度离心法是一种根据物质密度差异来分离混合物的方法。
在慢病毒纯化中，通过在离心管中制备密度递增的梯度，利用不同物质在梯度中的沉降速度差异来实现病毒的分离和纯化。
脑组织样本处理脑组织样本是进行慢病毒纯化的关键原料。
在收集脑组织样本后，应及时用PBS缓冲液进行冲洗，去除杂质。
通过加入10% Triton X-100等破解细胞膜的方法，可以有效释放慢病毒。
超速离心机超速离心机是进行密度梯度离心的必备设备，具有高速、高精度离心的特点。
合理设置超速离心机的离心参数，如转速、离心时间等，有助于提高慢病毒纯化的效果。
整理)慢病毒稳转细胞株步骤
稳转慢病毒一、所需试剂１、慢病毒载体(详细信息见附录及《质粒得扩增提取》)(大肠杆菌-８０℃保存2－3年,质粒－20℃保存2-3年,病毒液－８０℃保存1年)(1)载体质粒:两端得LTR、剪切位点、包装信号Ψ以及抗性或荧光基因、gag基因5′端350bp 得序列及位于eｎv序列中得RRE,含宿主RＮA聚合酶识别部分(2)包装质粒(psPAX2):包含了pol、ｇag包装成分(3)包膜质粒(pMD２、Ｇ):用其她病毒得包膜蛋白代替了env基因、三种质粒共同转染产生不具有自我复制能力得病毒载体。
2、包装细胞:2９3T细胞3、菌株:大肠杆菌,用于提取质粒4、转染试剂:XTＲEＭE—GENE(-20℃保存,不可分装),一种脂质与其她组份构成得混合物5、浓缩试剂(配好后4℃保存,原材料室温保存):5X PEＧ8000/NaCl溶液(聚乙二醇):ＮaCl 8、7６6g;PEG８00050g溶解在2００ml Milli－Q纯水中,高压蒸汽灭菌＊*也可直接从公司买来病毒液(—8０℃封口膜封口冻存管保存,4℃保存3天):滴度一般为１08ＴU／mｌ6、10mｇ/mｌpolybrene(-2０℃分装保存):溴化己二甲铵、就是带正电得小分子,与细胞表面得阴离子结合,提高慢病毒对细胞得感染效率,通常加入pｏlｙｂrene 能提高感染效率2~10 倍。
有一定细胞毒性,需要摸索浓度(1～1０μｇ/ｍl)７、无血清培养基:optiｍｅn8、贴壁细胞(复苏后3代以上得细胞)９、pｕroｍｙcin:嘌呤霉素,用于筛选稳转细胞二、具体步骤<一〉病毒包装与收集(中皿,转染步骤类似于瞬转)第一天１、种板,１0×1０5个293Ｔ细胞,加入全培养基双抗DMEM 4-5ｍl,过夜２、配制5X PEG80０0/ＮaＣl溶液称取ＮaCl 8。
766 g; ＰＥG8００0 50ｇ溶解在200ml Ｍilli－Q纯水中;１2１摄氏度30ｍｉn 湿热灭绝 30min;保存在４℃第二天Ａ+B混合室温静置２0miｎ2、加入2ml全培养基DMEM3、将１加入2,孵育10ｈ,换成5ｍl全培养基第四天第五天:１、9:00与17:0０各收取一次5ml培养液,共20ml(—80℃保存)2、过滤:用孔径为0、45mｍ得过滤器除去上清中得293Ｔ细胞3、加入5ml 5XPＥG8０00／NaCl溶液,每30ｍin－1ｈ上下摇匀一次4、4℃过夜第六天1、4℃,3５0０rpｍ,20min2、弃上清,倒扣纸上静置１-2mｉn,吸干残余液体3、加入120－150μl PBＳ,缓慢吹打,以防形成气溶胶4、50μl分装,－80℃保存。
病毒纯化浓缩方法
病毒纯化浓缩方法方法一超速离心沉淀法1 仪器超速离心机(BECKMAN OPTIMAL-80XP) 50000~80000rpm相对离心力最大可达510000×g；高速冷冻离心机(BECKMAN AVANTIJ-26XP)20000~25000rpm 最大离心力为89000×g；超速离心管 (Beckman 344058)，Ultra-clear SW28离心管2 方法步骤（1）转染后44-48小时，收集上清液到50ml离心管内，并加入20ml Production 培养基以便第二轮病毒的收集。
将收集的上清液4℃，4000g离心10分钟，去除细胞碎片，然后0.45 μm滤膜过滤到40ml超速离心管中。
（2）取6个Beckman超速离心管，70%乙醇清洗后在生物安全柜中风干并紫外消毒30min。
（3）每个Ultra-clear SW28管加入30ml 预先处理过滤过的病毒上清。
（4）取一支10ml的移液管，吸取12 ml 20%的蔗糖溶液(PBS配制)。
将移液管一直插入到离心管的底部，缓慢将蔗糖溶液打出4 ml，形成一个蔗糖垫。
同样地，将剩下8 ml的蔗糖溶液分别加入到另两个离心管中。
另取一支干净的移液管，对剩下3管进行同样处理。
（5）务必确定离心管没有裂缝且用PBS调整各管重量使两两平衡。
（6）4℃离心，25000rpm （82700g）2 h。
（7）离心完毕后小心取出超速离心管，小心弃去上清液，留下管底沉淀。
管底可见少量的半透明或白色沉淀。
将超速离心管倒置在吸水纸上晾干约10min，并用Tip头吸去管壁上多余的液体。
（8）每管中加入100ul不含钙和镁的冷PBS洗下沉淀。
（9）将SW28超速离心管插入到50ml锥底离心管中，盖上盖子。
（10）在4℃溶解2小时，每隔20分钟轻轻震荡。
（11）4℃，500g离心1分钟，使溶液集中于管底。
（12）用200μl 移液器轻柔吹打使沉淀重悬。
聚乙二醇8000透析浓缩蛋白
聚乙二醇8000透析浓缩蛋白一、介绍在生物科学研究中，透析浓缩蛋白是一项常见的实验技术。
本文将介绍使用聚乙二醇8000（PEG-8000）进行透析浓缩蛋白的方法和原理。
二、聚乙二醇8000的特性1.聚乙二醇8000是一种高分子化合物，具有较高的相对分子质量。
2.聚乙二醇8000在水中可溶解，形成透明的溶液。
3.聚乙二醇8000具有较低的毒性，对生物大分子的结构和功能影响较小。
三、透析浓缩蛋白的原理透析浓缩蛋白是利用溶质在溶液中的扩散作用，通过选择性透膜将小分子溶质从大分子溶质中分离出来的过程。
在透析浓缩蛋白中，聚乙二醇8000被用作透析液。
四、透析浓缩蛋白的步骤透析浓缩蛋白的步骤如下：1. 准备透析袋1.将透析袋浸泡在去离子水中，去除残留的溶质。
2.将透析袋加入含有聚乙二醇8000透析液的容器中，使透析袋充分吸收透析液。
2. 加入蛋白溶液1.将待透析浓缩的蛋白溶液加入透析袋中。
2.将透析袋封闭，确保蛋白溶液不会外泄。
3. 透析过程1.将装有蛋白溶液的透析袋放入含有透析液的容器中。
2.透析液中的小分子溶质会通过透析袋与蛋白溶液中的大分子溶质发生扩散作用，从而实现分离。
3.透析过程需要一定的时间，根据蛋白溶液的浓度和透析液的浓度来确定透析时间。
4. 浓缩蛋白1.将透析袋取出，收集透析液中的小分子溶质。
2.透析袋中的蛋白溶液浓缩，达到所需浓度。
五、优点和注意事项透析浓缩蛋白使用聚乙二醇8000具有以下优点： - 聚乙二醇8000在水中可溶解，方便操作。
- 聚乙二醇8000对大分子溶质的结构和功能影响较小。
注意事项： 1. 选择适当的透析袋和透析液，以确保透析效果和蛋白溶液的稳定性。
2. 控制透析时间，避免过度透析导致蛋白损失。
3. 透析过程中需注意卫生和操作规范，以避免污染和损坏。
六、总结通过使用聚乙二醇8000进行透析浓缩蛋白，可以实现对蛋白溶液中小分子溶质的分离和浓缩。
该方法简单易行，且对蛋白的结构和功能影响较小。
慢病毒的浓缩与纯化——PEG-8000浓缩法
慢病毒的浓缩与纯化——PEG-8000浓缩法
实验试剂
1. NaCl
2. PEG8000
实验设备
1. 高压灭菌锅
2. 0.45μm滤头
3. 高速离心机
4. 低温冰箱
实验步骤
1. 5X PEG8000 NaCl配制称取NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中；121摄氏度 30min 湿热灭绝 30min；保存在4℃。
2. 使用0.45μm滤头过滤慢病毒上清液；
3. 每30ml过滤后的病毒初始液，加入5X PEG-8000 NaCl母液7.5 ml；
4. 每20～30min混合一次，共进行3-5次；
5. 4度放置过夜；
6. 4度，4000 g，离心 20min；
7. 吸弃上清，静置管子1～2分钟，吸走残余液体；
8. 加入适量的慢病毒溶解液溶解慢病毒沉淀；
9. 集中后的病毒悬液分装成50 μl每份，保存在成品管中。
用碎干冰速冻后储存在-80 ℃。
（学习的目的是增长知识，提高能力，相信一分耕耘一分收获，努力就一定可以获得应有的回报）。
病毒纯化浓缩方法
病毒纯化浓缩方法之巴公井开创作方法一超速离心沉淀法1 仪器超速离心机(BECKMAN OPTIMAL-80XP) 50000~80000rpm相对离心力最大可达510000×g；高速冷冻离心机(BECKMAN AVANTIJ-26XP)20000~25000rpm 最大离心力为89000×g；超速离心管(Beckman 344058)，Ultra-clear SW28离心管2 方法步调（1）转染后44-48小时，收集上清液到50ml离心管内，并加入20ml Production培养基以便第二轮病毒的收集。
将收集的上清液4℃，4000g离心10分钟，去除细胞碎片，然后0.45 μm滤膜过滤到40ml超速离心管中。
（2）取6个Beckman超速离心管，70%乙醇清洗后在生物平安柜中风干并紫外消毒30min。
（3）每个Ultra-clear SW28管加入30ml 预先处理过滤过的病毒上清。
（4）取一支10ml的移液管，吸取12 ml 20%的蔗糖溶液(PBS配制)。
将移液管一直拔出到离心管的底部，缓慢将蔗糖溶液打出4 ml，形成一个蔗糖垫。
同样地，将剩下8 ml的蔗糖溶液分别加入到另两个离心管中。
另取一支干净的移液管，对剩下3管进行同样处理。
（5）务必确定离心管没有裂缝且用PBS调整各管重量使两两平衡。
（6）4℃离心，25000rpm （82700g）2 h。
（7）离心完毕后小心取出超速离心管，小心弃去上清液，留下管底沉淀。
管底可见少量的半透明或白色沉淀。
将超速离心管倒置在吸水纸上晾干约10min，并用Tip头吸去管壁上多余的液体。
（8）每管中加入100ul不含钙和镁的冷PBS洗下沉淀。
（9）将SW28超速离心管拔出到50ml锥底离心管中，盖上盖子。
（10）在4℃溶解2小时，每隔20分钟轻轻震荡。
（11）4℃，500g离心1分钟，使溶液集中于管底。
（12）用200μl移液器轻柔吹打使沉淀重悬。
AAV的包装纯化浓缩方法总结
AAV的包装纯化浓缩方法总结腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）,也称腺伴随病毒,属于微小病毒科依赖病毒属,是目前发现的一类结构简单的单链DNA缺陷型病毒，需要辅助病毒（通常为腺病毒）参与复制。
它编码两个末端的反向重复序列（ITR）中的cap和rep基因。
ITRs对于病毒的复制和包装具有决定性作用。
cap基因编码病毒衣壳蛋白， rep基因参与病毒的复制和整合。
AAV能感染多种细胞。
rep基因产物存在时，病毒DNA很容易整合到人类第19号染色体。
重组腺相关病毒载体(rAAV) 源于非致病的野生型腺相关病毒，由于其安全性好、宿主细胞范围广(分裂和非分裂细胞)、免疫源性低，在体内表达外源基因时间长等特点，被视为有前途的基因转移载体之一，在世界范围内的基因治疗和疫苗研究中得到广泛应用。
经过10余年的研究，重组腺相关病毒的生物学特性己被深入了解，尤其是其在各种细胞、组织和体内实验中的应用效果方面已经积累了许多资料。
在医学研究中，rAAV被用于多种疾病的基因治疗的研究(包括体内、体外实验)；同时作为一种有特点的基因转移载体，还广泛用于基因功能研究、构建疾病模型、制备基因敲除鼠等方面。
实验步骤1、准备HEK 293T细胞：提前一天分HEK 293T细胞，包装时细胞密度85%-90%且细胞分布均匀，状态良好(即：显微镜下观察，培养基中无杂质，无细胞悬浮或有少量细胞悬浮，细胞饱满，在培养皿中贴壁均匀)。
2、包装病毒1）提前一到两个小时给细胞换液，换成无血清的DMEM培养基（1%HEPES和1%P/S）。
换液时移液管要靠近培养皿内壁但不要贴住培养皿内壁缓慢加入DMEM，防止将已经贴壁的细胞吹起，同时换液时应注意避免移液管污染换液用培养基及细胞。
2）转染：以5个15cm培养皿的量为例：向15ml离心管中依次加入DMEM:9ml，Helper:124μg，RC:76μg，目的质粒：65.1μg，PEI:1ml，振荡混匀后室温静置30min。
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2. 每个Ultra-clear SW28离心管中加入约32ml的预先处理的病毒上清液。
3. 取一支10ml的移液管，吸取12 ml 20%的蔗糖溶液。
将移液管一直插入到离心管的底部，缓慢将蔗糖溶液打出4 ml。
同样地，将剩下8 ml的蔗糖溶液分别加入到另两个离心管中。
另取一支干净的移液管，对剩下3管进行同样处理。
4. 用PBS调整各管的重量，使对应的离心管之间的重量相差不超过0.1g。
5. 按次序将所有6个离心管放入Beckman SW28 超速离心转头中。
6. 4℃，25，000 rpm. (82，700g) 离心2小时。
7. 小心将管子从转头中取出。
倒掉上清，将离心管倒扣在纸巾上放置10分钟使剩余的上清流干。
吸掉剩余的液滴。
在管底应当有可见的沉淀。
8. 每管中加入100ml 不含钙和镁的PBS洗下沉淀。
9. 将SW28超速离心管插入到50ml锥底离心管中，盖上盖子。
10. 在4℃溶解2小时，每隔20分钟轻轻震荡。
11. 4℃，500g离心1分钟，使溶液集中于管底。
12. 用200μl 移液器轻柔吹打使沉淀重悬。
避免产生泡沫。
将所有管中的液体集中到一个SW28离心管中。
13. 集中后的病毒悬液分装成50μl 每份，保存在成品管中。
用碎干冰速冻后储存在-80 ℃。
方法二 PEG-8000浓缩法1. 5X PEG8000+NaCl配制称取NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200mlMilli-Q纯水中；121摄氏度 30min 湿热灭绝 30min；保存在4℃。
病毒纯化浓缩方法
病毒纯化浓缩办法之羊若含玉创作办法一超速离心沉淀法1 仪器超速离心机(BECKMAN OPTIMAL-80XP) 50000~80000rpm相对离心力最大可达510000×g；高速冷冻离心机(BECKMAN A V ANTIJ-26XP)20000~25000rpm 最大离心力为89000×g；超速离心管 (Beckman 344058)，Ultra-clear SW28离心管2 办法步调（1）转染后44-48小时，收集上清液到50ml离心管内，并参加20ml Production造就基以便第二轮病毒的收集.将收集的上清液4℃，4000g离心10分钟，去除细胞碎片，然后0.45 μm滤膜过滤到40ml超速离心管中.（2）取6个Beckman超速离心管，70%乙醇清洗后在生物平安柜中风干并紫外消毒30min.（3）每个Ultra-clear SW28管参加30ml 预先处理过滤过的病毒上清.（4）取一支10ml的移液管，吸取12 ml 20%的蔗糖溶液(PBS 配制).将移液管一直拔出到离心管的底部，迟缓将蔗糖溶液打出4 ml，形成一个蔗糖垫.同样地，将剩下8 ml的蔗糖溶液分离参加到另两个离心管中.另取一支清洁的移液管，对剩下3管进行同样处理.（5）务必确定离心管没有裂痕且用PBS调剂各管重量使两两平衡.（6）4℃离心，25000rpm （82700g）2 h.（7）离心完毕后小心取出超速离心管，小心弃去上清液，留下管底沉淀.管底可见少量的半透明或白色沉淀. 将超速离心管倒置在吸水纸上晾干约10min，并用Tip头吸去管壁上过剩的液体.（8）每管中参加100ul不含钙和镁的冷PBS洗下沉淀.（9）将SW28超速离心管拔出到50ml锥底离心管中，盖上盖子.（10）在4℃溶解2小时，每隔20分钟轻轻震荡.（11）4℃，500g离心1分钟，使溶液集中于管底.（12）用200μl移液器轻柔吹打使沉淀重悬.防止产生泡沫.将所有管中的液体集中到一个SW28离心管中，分装50ul/管，保管于成品管中，用碎干冰速冻后储存在-80℃冻存.办法二 PEG-8000浓缩法(1)5X PEG8000+NaCl配制称取NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中；121摄氏度 30min 湿热灭尽 30min；保管在4℃.(2)使用0.45μm滤头过滤慢病毒上清液；(3)每30ml过滤后的病毒初始液，参加5X PEG-8000+NaCl母液7.5 ml；(4)每20～30min混杂一次，共进行3-5次；(5)4度放置留宿；(6)4度，4000 g，离心 20min；(7)吸弃上清，静置管子1～2分钟，吸走残存液体；(8)参加适量的慢病毒溶解液溶解慢病毒沉淀；(9)集中后的病毒悬液分装成50 μl每份，保管在成品管中.用碎干冰速冻后储存在-80 ℃办法三慢病毒纯化浓缩试剂盒1.每10ml过滤后的病毒初始液，参加Concen Solution 3ml，每20-30min混杂一次，共进行3-5次.2.2. 4℃放置留宿.3. 4℃，3000 g，离心45min.4. 去失落上清，静置管子1-2min，吸走残存液体.5. 参加无血清DEME充分溶解慢病毒沉淀.6. 病毒悬液分装成200μl每份,保管在离心管中，速冻后储存在-80 ℃.。
用PEG8000大量制备和纯化质粒的方法（实验室版）
用PEG8000大量制备和纯化质粒的方法（实验室版）PEG8000沉淀法大量制备和纯化腺病毒质粒1．取经小提质粒鉴定正确后的菌液于LB平皿上进行四区连续划线（划二区时，接种针无需烧灼处理），37℃培养过夜。
挑取1个单菌落接种到500 ml 含特定抗生素的LB培养液内（可用1000ml三角烧瓶），于37℃，250~300 rpm震摇过夜。
2．收集500 ml菌液至干净的离心管，离心，5000 rpm，20 min (肉眼观察上清液，应澄清、透明)。
3．弃上清，在洗水纸上扣干。
先后加入溶液Ⅰ10 ml （用洗管将细菌充分悬起、混匀）, 溶液Ⅱ20 ml（上下颠倒混匀20次、室稳静臵5 min）和溶液Ⅲ 15 ml（上下颠倒混匀20次）。
离心，5000 rpm，15 min。
4．转移上清至干净的50 ml离心管（如果膜状物质比较松散，可以用parafilm 进行简单过滤处理），加入0.6倍体积的异丙醇（27 ml），充分混匀。
离心，4000 rpm，15 min。
5．弃上清，用3 ml TE (1mM EDTA, 10 mM Tris-HCl, pH8.0)充分溶解所有沉淀（用吸管操作），加入等体积5 M LiCl（此时总体积为6 ml），混匀（此时溶液呈白色浑浊状），离心，4000 rpm，15 min。
6．转移上清（6 ml）至50 ml干净的离心管，加入0.6倍体积的异丙醇（3.6 ml），混匀。
离心，4000 rpm，15 min。
7．弃上清，用0.5 ml TE 充分溶解沉淀（首先应确定沉淀的位臵。
分两步溶解，先加300 μl充分溶解并转移DNA后，再用200 μl溶解剩余沉淀并转移。
溶解时，最好使用吸管），并将溶液转移至1.5 ml Ep管（此时溶液为无色、稍粘稠液体），加入5 μl RNaseA，37℃ 1 hr。
加入等体积的1.6 M NaCl 含13% PEG 8000，倒臵混匀数次，可观察到白色絮状沉淀。
慢病毒包装、浓缩、纯化、滴度实验步骤
一、包装细胞293T细胞的培养一、293T细胞的冻存1. 随着传代的次数增加，293T细胞会出现生长状态下降，出现突变等。
所以要在细胞购进时就进行冻存。
2. 在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。
3. 倒去细胞上清液，加入D-Hank's液洗去残留的培养基。
4. 加入0.25%的胰酶，消化10-20s后倒去。
5. 镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，加入新鲜培养基吹打混匀。
6. 细胞计数。
7.将细胞离心，1000rpm，2min。
8. 根据计数结果加入细胞冻存液（70%完全培养基+20%FBS+10% DMSO）重悬细胞，密度为3×106个/ml。
10. 第二天将细胞放入液氮灌，并记录。
二、293T细胞的传代1. 当细胞生长至汇合率达到80~90%需要对细胞进行传代操作，以扩大细胞数量，维持细胞良好的生长状态。
2. 消化细胞，方法同上。
3. 细胞离心结束后，加入完全培养基重悬。
密度为3×105个/ml。
4. 分到10cm培养皿中，10ml/皿。
三、293T细胞的复苏1. 当细胞传代次数过多（超过50代），细胞状态变差时或细胞出现污染事故时，需要丢弃并对开始冻存的细胞进行复苏。
2. 打开水浴锅，设置温度为40℃。
3. 查看细胞库记录，根据记录从液氮灌中取出冻存的细胞（需戴上棉手套，防止被冻伤），迅速丢入水浴锅中并快速晃动，在1~2 min内使细胞溶液完全溶解。
4. 将1ml细胞溶液加入9 ml完全培养基中并混匀后转入10cm培养皿。
5. 放回37℃、3%CO2和95%相对湿度的培养箱中培养。
6. 第二天观察细胞存活率。
倒掉旧的培养基，加入10ml新鲜培养基。
二、慢病毒的包装、浓缩和滴度测定1. 所用病毒检测引物为WPRE特异引物，序列如下5'-CCTTTCCGGGACTTTCGCTTT-3' (forward primer),5'-GCAGAATCCAGGTGGCAACA-3' (reverse primer) and5'-FAM-ACTCATCGCCGCCTGCCTTGCC-TAMRA-3' (probe)2. TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems，cat. no. 4304437)3. TaqMan DNA Template Reagent Kit (Applied Biosystems，cat. no. 401970)4. TaqMan RNaseP control reagent (Applied Biosystems，cat. no. 4316844) 用于包装的293T细胞的培养用于包装的293T细胞(ATCC No. CRL-11268)必需选择处于生长旺盛期，细胞状态较佳，存活率90%以上，细胞边缘清晰，传代次数较低。
慢病毒包装、浓缩、纯化、滴度实验步骤之欧阳语创编
一、包装细胞293T细胞的培养一、293T细胞的冻存1. 随着传代的次数增加，293T细胞会出现生长状态下降，出现突变等。
所以要在细胞购进时就进行冻存。
2. 在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。
3. 倒去细胞上清液，加入D-Hank's液洗去残留的培养基。
4. 加入0.25%的胰酶，消化10-20s后倒去。
5. 镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，加入新鲜培养基吹打混匀。
6. 细胞计数。
7.将细胞离心，1000rpm，2min。
8. 根据计数结果加入细胞冻存液（70%完全培养基+20%FBS+10% DMSO）重悬细胞，密度为3×106个/ml。
10. 第二天将细胞放入液氮灌，并记录。
二、293T细胞的传代1. 当细胞生长至汇合率达到80~90%需要对细胞进行传代操作，以扩大细胞数量，维持细胞良好的生长状态。
2. 消化细胞，方法同上。
3. 细胞离心结束后，加入完全培养基重悬。
密度为3×105个/ml。
4. 分到10cm培养皿中，10ml/皿。
三、293T细胞的复苏1. 当细胞传代次数过多（超过50代），细胞状态变差时或细胞出现污染事故时，需要丢弃并对开始冻存的细胞进行复苏。
2. 打开水浴锅，设置温度为40℃。
3. 查看细胞库记录，根据记录从液氮灌中取出冻存的细胞（需戴上棉手套，防止被冻伤），迅速丢入水浴锅中并快速晃动，在1~2 min内使细胞溶液完全溶解。
4. 将1ml细胞溶液加入9 ml完全培养基中并混匀后转入10cm培养皿。
5. 放回37℃、3%CO2和95%相对湿度的培养箱中培养。
6. 第二天观察细胞存活率。
倒掉旧的培养基，加入10ml 新鲜培养基。
二、慢病毒的包装、浓缩和滴度测定1. 所用病毒检测引物为WPRE特异引物，序列如下5'-CCTTTCCGGGACTTTCGCTTT-3' (forward primer),5'-GCAGAATCCAGGTGGCAACA-3' (reverse primer) and5'-FAM-ACTCATCGCCGCCTGCCTTGCC-TAMRA-3' (probe)2. TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems， cat. no. 4304437)3. TaqMan DNA Template Reagent Kit (Applied Biosystems， cat. no. 401970)4. TaqMan RNaseP control reagent (Applied Biosystems， cat. no. 4316844)用于包装的293T细胞的培养用于包装的293T细胞(ATCC No. CRL-11268)必需选择处于生长旺盛期，细胞状态较佳，存活率90%以上，细胞边缘清晰，传代次数较低。
PEG收集沉淀病毒的方法
PEG收集沉淀病毒的方法
1、用超声波或冻融的方法使细胞破碎释放出病毒；
2、慢慢搅动并加入NaCl终浓度是0.5mol/L,有助于病毒的沉淀，再等量加入10％
PEG(一般使用的是PEG6000就可以了。
3、4过夜或放置一段时间；
4、8000r/min离心30分钟，收集病毒沉淀；
5、将病毒沉淀加入适量的PBS中，4℃过夜；
6、10000r/min离心1小时,沉淀即为浓缩的病毒。
还可以用梯度离心或其他方法进一步纯化。
取100mL毒液，10000r/min，10min，取上清。
上清中加入10Gpeg-20000和2gNaCl4℃
溶解过夜，20000r/min，离心30min，弃上清，留沉淀。
沉淀用3ml无菌PBS重悬，
转入透析袋中，2L预冷PBS透析液4℃透析，每4h换一次液，到第三次过夜透析。
将透析袋放入平皿中，覆盖蔗糖浓缩至1.5ml，500μl1支分装至EP管中。
-80℃备
用。
将细胞反复冻融3次后，则获得病毒液。
取500mL病毒液，于4℃2000rpm离心10min，取上清；在超净工作台中，向上清中加入PEG6000和10gNaCl，边加边轻轻搅拌混匀，于4℃溶解过夜（注意要溶解完全，防止有未溶解的PEG）；于4℃8500g离心30min，弃上清，留取沉淀；沉淀用1.5mL无菌的PBS重悬，转入透析袋中，置于2L的预冷的PBS中进行透析，每4h更换一次透析液，至第3次时透析过夜；用蔗糖进行浓缩，500μL/每支分装到EP管中，-80℃保存；采用紫外分光光度计和BCA进行蛋白定量，定量结果为20.5mg/mL。