细菌的简单染色和革兰染色实验报告

实验二：细菌的简单染色和革兰染色
一、实验目的
1.掌握细菌涂片的制备方法。

2.掌握细菌简单染色和革兰染色法的原理及操作步骤，识别细菌的革兰染色结果。

3.巩固显微镜油镜的使用方法。

4.学习无菌操作技术。

二、实验原理
1、染色原理：
细菌生长于酸性、中性和碱性溶液时常带负电荷，所以通常采用带正电荷的碱性染料（如美蓝、甲紫、碱性复红或孔雀绿等）使其着色。

当细菌分解糖类产酸时，细菌所带正电荷增加易被带负电的酸性染料（如伊红、酸性复红或刚果红）着色。

2、革兰染色法原理：
革兰染色法可根据细菌细胞壁结构和成分的不同，将其分为革兰阳性菌和革兰阴性菌。

革兰阳性细菌的肽聚糖层较厚，经乙醇处理后使之发生脱水作用而使孔径缩小，结晶紫与碘的复合物保留在细胞内而不被脱色；而革兰阴性细菌的肽聚糖层很薄，脂肪含量高，经乙醇处理后部份细胞壁可能被溶解并改变其组织状态，细胞壁孔径大，不能阻止溶剂透入，因而将结晶紫与碘的复合物洗去而被脱色。

另外，革兰染色的差异并不能完全认为是化学的差别，也有物理结构不同的结果。

如酵母菌细胞壁的成份完全与细菌不同，但具有革兰染色阳性反应。

三、实验仪器，材料和用具
1、仪器及用具：显微镜、酒精灯、火柴、接种环、载玻片、盖玻片、镊子、擦镜纸、镜油、无菌牙签
2、菌种：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、葡萄球菌、牙垢、未知菌S1和S3
3、试剂：结晶紫染液、革氏碘液、洗脱液（95%乙醇溶液）、番红染液
四、实验步骤
（1）简单染色
1、载玻片的处理：用纱布将取出的载玻片擦干，把要涂菌的部位在火焰上烤一下，冷却待用。

2、涂片：左手持菌液试管，右手持接种环在火焰上烧灼灭菌，待接种环冷却后在火焰旁从试管中取一环菌液，在洁净无脂的载玻片上涂一直径约2mm的均匀薄膜。

3、干燥：涂片后待其自然干燥。

4、固定：将以干燥好的涂片标本朝上，在酒精灯火焰上通过2~3次，要求载玻片温度不能超过60度，以手背触载片不烫为宜。

5、染色：滴加一滴结晶紫染液，染色1min。

6、水洗：用水将染液洗去，再用吸水纸将水吸干。

7、镜检
（2）革兰染色
1~4步与简单染色相同。

5、初染：滴加一滴结晶紫染液，染色1min。

而后水洗，吸干。

6、媒染：加一滴碘液覆盖涂片1min，水洗，吸干。

7、脱色：滴加洗脱液，轻轻摇动载玻片，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗，吸干。

整个脱色过程约20~30秒。

8、复染：滴加番红染液复染3min，水洗，吸干。

9、镜检：盖上盖玻片，从低倍镜到油镜依次观察标本。

五、实验结果（照片）
(a)金黄色葡萄球菌（100×10倍）
金黄色葡萄球菌（紫色）
(b)枯草芽孢杆菌（100×10倍）枯草芽孢杆菌（紫色）
(c)未知菌S1(100×10倍)
未知菌S1（显微镜下观察为紫色，
照出的结果有些失真）
(d)牙垢（100×10倍）
牙垢中的杆菌（紫色）
口腔上皮细胞
(e)未知菌S3（100×10倍）
未知菌S3（理论上应该是红色，
但结果是颜色全部脱掉了）
(f)大肠杆菌（100×10倍）
大肠杆菌（理论上是红色，但显
然番红并没有染上）
六、实验讨论
1、影响微生物革兰染色结果的因素：
（1）菌龄：
取处于对数生长期的细菌，结果更为典型
（2）操作：
热固定：温度不能太高，否则会造成细菌结构的破坏。

染料量：应过量，但也不需太多，以免浪费。

初染和媒染时间：在30~60sec为宜。

复染时间：可稍长。

脱色：20-30s，以流下的脱色液无色为准。

水洗：要充分。

2、微生物革兰染色注意事项：
（1）取菌液不要贪多，会造成菌体堆积，染色效果不好。

而且不容易干，浪费时间，涂2mm 左右大即可。

（2）接种环冷却后再取菌，避免加热时间过长，以免细菌破裂或变形。

染色不上往往是固定温度太高和加热时间过长造成的，固定温度应尽量低。

（3）脱色时，滴加一两滴洗脱液，摇摇倒掉，再滴加，再倒掉，直至倒掉的洗脱液无色，再迅速水洗。

（4）每一步水洗后都应将水吸干，以免稀释染液。

（5）复染时要不断地滴加染液（避免染液变干）使染色更充分。

3、酵母菌能进行染色吗?结果如何?为什么?
答：能。

结果理论上应是革兰阳性。

原因：酵母的细胞壁不含肽聚糖，主要成分是葡聚糖、甘露聚糖，还有几丁质等，它们都是多糖的复杂分支聚合物，不溶于乙醇。

且酵母细胞壁脂类较少，因此在媒染后，结晶紫-碘复合物不易脱出细胞壁，故呈现革兰氏阳性反应。

4、牙垢里大概能看到几类菌，哪几种较多？
通过网上的资料可知，牙垢（又称牙菌斑）是在牙齿表面逐渐沉积的生物薄膜，由食物残渣、脱落的口腔上皮细胞、唾液和细菌构成。

牙垢中的细菌主要是正常口腔内存在的链球菌、厌氧菌等。

这些细胞应大部分是革兰氏阳性细菌,其原因也可大致理解为：口腔中的环境对细菌的生长而言还是比较苛刻的，因此能适应这种环境的细菌表面的肽聚糖层应较厚，故为革兰氏阳性。

我们组在实验中观察到的牙垢中的细菌多数颜色还是比较深的，而且其中有许多紫色的小点（球状菌），但照出来的结果有些失真（细菌的颜色变浅，被染成紫色的球状菌也不见了），其原因我现在还没有想清楚，还请助教和老师不吝赐教。

另外，图中大的呈透明或粉红色的细胞是口腔上皮细胞，而不是细菌。

5、对未知菌S3和大肠杆菌染色结果的反思
从图中可以看出，未知菌和大肠杆菌的染色效果都不理想。

一方面可能是因为这两种菌确实比较难染出好的效果。

但我想，主要的原因应该还是我们自己的操作有许多不当之处。

首先是用接种环取菌液前，冷却的时间可能过短，致使接种环温度较高，使所取细菌破裂。

其次，可能是固定温度不合适。

因为是第一次做染色实验，没有经验，
不太清楚到底如何来控制固定温度，因此只能不断地去摸索和尝试。

很多时候，烤一次后用手背去感觉，温度较低，便再烤一次，再用手背去感觉，便觉得烫了。

所以，我觉得不能完全靠手背去感觉，还是应该大概控制一下时间和距火焰的高度，这样会比较稳妥、精确。

除此之外，致使染色效果不佳的另一个原因可能就是番红染色的时间和染液用量控制的不好。

开始几次染色，我都是一次性的加完染液，然后静等3min。

后来听到老师指点别的同学，才知道这样操作是不对的。

正确的操作应该是不断地补充染液，以免染液变干，起不到染色的效果。

所以，开始时自己的染液大概一分钟后就干了，之后的时间其实染液是没有起到染色作用的，所以染出的效果都不理想。

另外，像大肠杆菌这样较难上色的，可能应该加长染色的时间，以使其呈现出红色。

七、实验感想
本次试验使我们接触到了非常基础的微生物革兰染色法，感觉收获还是颇多的。

预习时，感觉操作非常得简单，只是按照流程染几次色便好了。

但真正操作的时候才发现，这是一个对操作规范性要求很高的实验。

任何一个细节处理得不好，就很难染出理想的效果。

而且，许多操作都需要经验来把握，并不是仅仅小心去应对就够了。

所以往往一种细菌，我们要染出两三个装片，才能从中挑选出一个效果不错的。

也正是这个原因，我们的实验做到了晚上六点。

不过我觉得，第一次难免都会遇到许多问题，这是不可避免的。

而有了这次的经验后，之后再用到类此的方法，我们就能操作得更加自如和熟练。

另外，革兰氏染色法是鉴别菌种的一个极常用的方法，具有很高的实用意义。

所以，以后的试验中，我们更主要是用此法来鉴别未知的菌种。

而此次试验中，我们是已知菌种类别的，因此我们可以不断地重复操作，直至得到与理论相符的结果。

但这在将来的试验中是不可能的。

因此，这就要求我们的每一步操作都十分规范，要有一次做出正确结果的把握。

最后，非常感谢老师清晰的讲解，以及助教们对我提出的问题的耐心解答。