利用啤酒废水培养普通小球藻生产微藻生物质和油脂

利用啤酒废水培养普通小球藻生产微藻生物质和油脂
曹海;张馨允;孔维宝;杨红;杨琪;王科荣
【摘要】研究了普通小球藻在未处理啤酒废水及改良啤酒废水中的生长及积累油脂特性,并优化了改良啤酒废水培养小球藻的营养盐组成.优化得到适于培养小球藻生产微藻生物质和积累油脂的改良啤酒废水培养基组成为:在未经处理的啤酒废水中添加KNO3 0.50 g/L、MgSO4 0.75 g/L、Na2HPO4 0.75 g/L,调整pH至8.0.在此培养基中小球藻细胞质量浓度达0.94 g/L,为对照组的2.69倍；体积油脂产率达11.84 mg/(L·d),为对照组的1.97倍.研究表明,利用改良的啤酒废水培养小球藻可同时实现有机废水的资源化利用与降低微藻培养成本的双重目的,具有潜在的应用前景.%The growth characteristics and lipid accumulation of Chlorella vulgaris in crude and modified brewery wastewater(BWW) were investigated. Furthermore, the modified BWW medium components were optimized. The results indicated that the optimized components of modified BWW medium for biomass production and lipid accumulation were that KNO3 (0. 50 g/L) , MgSO4 (0. 75 g/L) and Na2HPO4 (0.75 g/L) were added in crude BWW and the pH value was adjusted to 8.0. The biomass content of 0. 94 g/L( 2. 69 - fold compared with control) and the lipid productivity of 11. 84 mg/ ( L o d ) ( 1. 97 -. fold compared with control) were obtained in the modified BWW medium. The study suggested that cultivation of Chlorella vulgaris with organic wastewater exhibited potential application prospect since it could couple the resource utilization of organic wastewater and cost reduction of algae cultivation.
【期刊名称】《中国油脂》
【年(卷),期】2012(037)009
【总页数】5页(P65-69)
【关键词】普通小球藻;啤酒废水;微藻;生物质;油脂
【作者】曹海;张馨允;孔维宝;杨红;杨琪;王科荣
【作者单位】西北师范大学生命科学学院,兰州730070;西北师范大学生命科学学院,兰州730070;西北师范大学生命科学学院,兰州730070;西北师范大学生命科学学院,兰州730070;西北师范大学生命科学学院,兰州730070;西北师范大学生命科学学院,兰州730070
【正文语种】中文
【中图分类】TS222;Q949.2
Abstract:The growth characteristics and lipid accumulation of Chlorella vulgaris in crude and modified brewery wastewater(BWW)were investigated.Furthermore，the modified BWW medium components were optimized.The results indicated that the optimized components of modified BWW medium for biomass production and lipid accumulation were that KNO3(0.50 g/L)，MgSO4(0.75 g/L)and Na2HPO4(0.75 g/L)were added in crude BWW and the pH value was adjusted to 8.0.The biomass content of 0.94 g/L(2.69－fold compared with control)and the lipid productivity of 11.84 mg/(L·d)(1.97－fold compared with control)were obtained in the modified BWW medium.The study suggested that
cultivation of Chlorella vulgaris with organic wastewater exhibited potential application prospect since it could couple the resource utilization of organic wastewater and cost reduction of algae cultivation.
Key words:Chlorella vulgaris;brewery wastewater;microalgae;biomass;lipid 微藻具有生长快速、培养周期短、光合效率高等特点，每年固定的 CO2约占全球净光合产量的40%［1］，是目前所知的唯一可能替代化石能源的原料［2］。

同时，微藻生长过程中会吸收大量的氮、磷等元素作为营养物质供细胞生化组分的合成，既可生产有效生物质，又可用来处理工农业生产废水［3］。

因此，基于光合作用，微藻细胞可以用来去除废水中的氮、磷和其他有机化合物，并以有机物的形式将其储存在细胞中。

其中，可作为生物柴油原料的油脂为微藻细胞内主要的贮藏物质之一。

当前，利用微藻生产生物质能源和去除废水中氮、磷的研究均得到了广泛的重视。

但是，将二者结合起来的研究报道较少［4－5］。

将微藻培养和废水处理技术结合起来，可实现微藻培养基的低成本化、废水中有机质的资源化利用、微藻生物质生产和水资源循环利用多重目的的耦合［6］。

因此，针对目前微藻培养过程中养殖成本高、水体富营养化和水资源短缺问题，选择具有排放量大、无毒、有机化合物含量高、可生化性强等特点的啤酒废水(BWW)为主要培养基质［7－8］，利用普通小球藻(Chlorella vulgaris)的混合营养特性，探索利用BWW低成本培养普通小球藻和BWW生物处理的技术，实现微藻生物质生产与废水资源化利用的技术耦合。

1.1 实验材料
实验用普通小球藻(Chlorella vulgaris－31#)购自中科院水生生物研究所淡水藻种库。

藻种基础培养基为土壤浸出液培养基(SoilEM)。

啤酒生产废水取自华润雪花啤酒(甘肃)有限公司。

KNO3、Na2HPO4、MgSO4、NaOH、HCl、正己烷等，均为分析纯试剂。

TDL－5000B低温冷冻离心机，LDZX－40BI型立式自动电热压力蒸汽灭菌器，分析天平，恒温光照摇床，日立UV－1800紫外可见分光光度计，GY92－2D超声
波细胞破碎仪，电热烘箱，冷冻干燥机。

1.2 实验设计
首先将培养至对数期的小球藻种子培养液接种于经灭菌处理的BWW原液中进行
培养，通过测定小球藻细胞生长曲线，分析其生长特性。

然后根据BWW的组成
特性，进行外加营养盐(尿素或KNO3、MgSO4、Na2HPO4)的单因素实验，再
通过正交实验优化BWW中小球藻的生物量生产和产油条件。

最后，在优化条件
下分析小球藻在改良BWW培养基中的生长特性和产油特性。

1.3 小球藻培养方法
根据各个实验方案配制培养基，经适当调节pH等处理后在121℃高压灭菌20 min。

无菌条件下吸取对数生长期的藻种液10 mL接入100 mL的培养液中，摇
匀后将接入小球藻的锥形瓶置于恒温光照摇床中培养，平均光强度为2 500 lx，温度为(25± 1)℃，光周期为12光、12暗，培养6 d。

1.4 小球藻细胞质量浓度的测定方法
取4 mL培养液置于已预先烘干称重的5 mL离心管中，3 000 r/min离心10
min后，弃去上清液，加4 mL蒸馏水，振荡重新悬浮，再次离心，弃去上清液，以上过程重复2次。

将离心管敞口放入烘箱中，80℃下烘至恒重，取出置于干燥
器中，待冷却至室温后测定管重。

以3次重复测定的平均值计为小球藻细胞质量
浓度(g/L)。

1.5 小球藻油脂含量的测定方法
将萃取油脂的具塞玻璃试管清洗烘干后称重(m0)，取适量经冷冻干燥的藻粉并研
磨破壁成细粉后置于已称重的萃取试管中一同称重(m1)，加入5 mL正己烷在50℃
水浴中浸提油脂5次，每次1 h，每次浸提后在3 000 r/min下离心10 min，收
集上清液，蒸发去除溶剂后即得粗油脂;同时将含离心沉淀藻渣的试管在70℃烘箱中烘干至恒重，冷却至室温后称重(m2)，按公式计算粗油脂含量。

油脂含量=(m1－m2)/(m1－m0)×100%
2.1 未处理BWW中小球藻的生长特性
将小球藻接种于经灭菌处理的BWW原液中连续培养6 d，每天测定小球藻细胞质量浓度。

随着培养时间的延长，小球藻细胞质量浓度先增加后达到稳定，接种3 d 后，小球藻细胞质量浓度达最大值(0.42 g/L)，之后由于BWW中的营养物质匮乏，导致细胞质量浓度略有下降，且小球藻细胞颜色发黄，培养结束时，小球藻细胞质量浓度为0.35 g/L。

2.2 BWW中外加营养盐对小球藻细胞质量浓度和油脂含量的影响
2.2.1 KNO3质量浓度的影响
BWW中添加KNO3，质量浓度分别设为0.25、0.50、0.75 g/L和1.0 g/L，接种后培养6 d，分别测定小球藻细胞质量浓度和油脂含量，结果如图1所示。

由图1可见，在一定质量浓度范围内，随着KNO3质量浓度的增加小球藻细胞质
量浓度显著增加，当KNO3的质量浓度为0.50 g/L时，小球藻细胞质量浓度达最大值为1.03 g/L，是对照组的1.50倍;当质量浓度高于0.50 g/L时，小球藻细胞
质量浓度呈下降趋势;而油脂的含量与KNO3的质量浓度呈现负相关，油脂含量随KNO3的质量浓度的增加而不断降低。

说明BWW中添加一定量的KNO3有利于小球藻的生长和生物质的积累，但对油脂的合成有抑制作用。

王立柱等［9］的研究表明，在高氮源条件下有利于小球藻生物量的合成但油脂的含量低，本研究得到相同的结论。

2.2.2 MgSO4质量浓度的影响
图2为BWW中添加不同质量浓度MgSO4对小球藻细胞质量浓度和油脂含量的
影响。

由图2可见，随着BWW培养基中MgSO4质量浓度的增加，小球藻细胞质量浓
度先增后减，当MgSO4质量浓度为0.75 g/L时，小球藻细胞质量浓度达到最大
值为0.94 g/L，是对照组的1.36倍，说明在BWW原液中添加一定量的MgSO4可促进小球藻的生长。

但是随着BWW中MgSO4质量浓度的增加，油脂含量先
增后减。

当MgSO4质量浓度为0.25 g/L时，油脂含量达16.31%，说明添加一
定量的MgSO4有利于油脂的积累，但当MgSO4质量浓度过高时，反而不利于
油脂的合成。

2.2.3 Na2HPO4质量浓度的影响
图3为BWW中添加不同质量浓度Na2HPO4对小球藻细胞质量浓度和油脂含量
的影响。

由图3可见，BWW中添加不同质量浓度Na2HPO4培养小球藻，当Na2HPO4
的质量浓度在0～0.75 g/L范围内时，Na2HPO4质量浓度的提高，有利于小球藻的生长，Na2HPO4的质量浓度为0.75 g/L时，小球藻细胞质量浓度达1.13 g/L，明显高于对照组(0.88 g/L)，但当Na2HPO4质量浓度高于0.75 g/L时，小球藻
细胞质量浓度有下降趋势。

小球藻细胞中油脂的含量随着Na2HPO4质量浓度的
增大，油脂含量呈不断上升的趋势，当Na2HPO4质量浓度为1.0 g/L时，油脂
含量达15.85%。

由此可见，BWW 中添加一定量的Na2HPO4不仅有利于小球藻的生长，而且能显著提高小球藻细胞中油脂的含量。

2.3 初始pH对小球藻细胞质量浓度和油脂含量的影响
为了确定小球藻在BWW中生长和油脂积累的最适pH，将培养液的初始pH分别调至6.0、6.5、7.0、7.5和8.0，接种小球藻培养6 d后测定其小球藻细胞质量浓度和油脂含量，结果如图4所示。

由图4可知，当pH小于7.5时，小球藻细胞质量浓度随pH的升高而升高，当
pH为7.5时，质量浓度达最大值(0.88 g/L)，当pH高于7.5时，对其生长有抑制作用。

结果表明小球藻在BWW中生长的最适pH为7.5。

小球藻细胞中油脂含量随pH的增大而不断提高，由于BWW的初始pH一般为6.8～7.5，因此利用BWW培养小球藻时，需适当地提高BWW的pH，以利于小球藻的生长和油脂的合成。

2.4 正交实验优化BWW培养基
通过BWW中添加不同质量浓度营养盐的单因素实验和BWW不同初始pH实验，发现单独添加一种营养盐对小球藻的生长和油脂积累的影响各有优劣，并不能完全满足小球藻的生长要求。

因此，在此基础上设计了四因素三水平正交实验，以期确定适合小球藻生长和小球藻油脂合成的最佳培养基组成。

正交实验设计见表1。

在设计的条件接种培养6 d后，测定小球藻细胞质量浓度和油脂含量，实验结果
见表2。

由表2结果分析可知，利于小球藻生长的3种外加营养盐的最佳质量浓
度和废水的初始pH分别为KNO30.50 g/L，MgSO40.75 g/L，Na2HPO40.75
g/L，pH 8.0;适于油脂积累的营养盐的最佳质量浓度和废水的初始pH分别
为:KNO30.25 g/L，MgSO40.75 g/ L，Na2HPO40.75 g/L，pH 8.0。

对正交实验结果运用统计学方法分别对影响小球藻细胞质量浓度和油脂含量的4
个因素进行方差分析，如表3、表4所示。

由表3、表4可知，在设定的外加营养盐质量浓度范围内，KNO3、MgSO4对小球藻生长的影响不显著，Na2HPO4和pH对其影响显著;KNO3和pH对小球藻
油脂积累的影响显著，而Na2HPO4和MgSO4对其影响不显著。

综合考虑上述实验结果以及过多添加营养盐为去除废水COD造成的负荷，确定了适于培养小球藻生长的BWW改良培养基组成为:KNO30.50 g/L，MgSO40.75
g/L，Na2HPO40.75 g/L，pH 8.0;利于油脂积累的BWW改良培养基组成
为:KNO30.25 g/ L，MgSO40.75 g/L，Na2HPO40.75 g/L，pH 8.0。

2.5 改良BWW中小球藻的生长与产油特性
在上述研究基础之上，以未处理的BWW为对照组，考察了经正交实验优化的BWW培养基中小球藻的生长状况和产油特性。

图5为不同改良BWW培养基中小球藻的生长曲线。

由图5可知，对照组小球藻生长缓慢，培养3 d后小球藻细胞质量浓度达最大值为0.42 g/L，相比之下，改良的BWW培养基中小球藻的生长明显优于对照组，培养6 d后小球藻细胞仍表现出良好的增长趋势，且用于生产小球藻生物质的改良BWW培养基与用于生产油脂的改良BWW培养基相比，更有利于小球藻的生长。

表5为不同改良BWW培养基中小球藻的产油特性。

由表5可知，对照组中油脂含量为10.32%，但小球藻细胞质量浓度仅为0.35 g/L;用于生产油脂的改良的BWW培养基和用于生产生物质的改良BWW培养基中培养小球藻的油脂含量分别为8.49%、7.56%，反而低于对照组中油脂的含量，但是小球藻细胞质量浓度远高于对照组，分别为0.84、0.94 g/L。

出现上述结果的原因可能是因为对照组中氮源缺乏，抑制了小球藻生物量的合成，却有利于油脂的合成;改良的BWW培养基中添加的氮源促进了小球藻细胞的生长，但抑制了积累油脂。

从小球藻细胞的质量油脂产率分析可知，用未经处理的BWW直接培养的小球藻细胞因油脂含量较高而获得了最大的质量油脂产率(17.20 mg/ (g·d))，但是BWW 原液中的小球藻细胞质量浓度较低。

从培养液的体积油脂产率分析，两种改良的BWW培养基中均获得了较对照组(6.02 mg/ (L·d))高的体积油脂产率(11.84、11.89 mg/ (L·d))，而改良培养基中小球藻体积油脂产率的差异性不显著。

因此，用于生产生物质的改良BWW可用于小球藻生物质和油脂的生产。

(1)BWW中添加一定量的氮源有利于小球藻的生长和生物质的积累，但高氮源条件对油脂的合成有抑制作用;BWW中添加适量的磷源，对小球藻生物质的积累和
油脂合成都有一定的促进作用。

BWW培养液的pH对小球藻的生长和油脂积累影响显著。

(2)通过正交实验，综合分析优化得到适于培养小球藻生产生物质和合成油脂的改良BWW培养基为:在未经处理的BWW原液中添加KNO30.50 g/L，
MgSO40.75 g/L，Na2HPO40.75 g/L，调整pH至8.0。

在此培养基中小球藻细胞质量浓度达0.94 g/L，为对照组的2.69倍;体积油脂产率达11.84 mg/(L·d)，为对照组的1.97倍。

(3)利用改良的BWW培养微藻具有工业化应用潜力，此举可同时实现有机废水的资源化利用与微藻的低成本培养。

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