国境口岸肠出血性大肠埃希菌O104H4检验方法编制说明

国境口岸肠出血性大肠杆菌 O104H4检测方法编制说明
1.工作概述
任务来源
本行业标准由国家质量监督检验检疫总局计划。

本行业标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。

《关于下达2012年第一批出入境检验检疫行业标准制（修）订计划项目的通知》国认科[2012]36号文。

计划编号：2012B160
类别：卫生检疫
标准名称：国境口岸肠出血性大肠杆菌 O104H4检测方法
本标准由珠海出入境检验检疫局负责起草。

本标准主要起草人：涂承宁、赵俊华、冯子力、熊衍文、杨泽、莫秋华、谭华、叶立青。

目的、意义及国内外标准简要说明
2011年5月以来，德国暴发了肠出血性大肠杆菌O104:H4（EHEC O104:H4）感染疫情，至7月26日德国负责流行病研究的权威机构罗伯特•科赫研究所宣布疫情结束为止，本次肠出血性大肠杆菌在德国造成50人死亡，3469人感染。

此外，本次疫情还波及欧洲其他国家及美国、加拿大等16国家，并造成1人死亡和近千人感染。

珠海腹泻病检测重点实验室根据国家局指示，于6月初紧急派出工作人员到国家CDC传染病所传染病预防控制国家重点实验室与熊衍文研究员等专家探讨EHEC O104:H4的检验方法。

与O157不同，O104具有难以从培养物中分离的特殊性，造成一定的检测困难，经讨论决定从其产生的vero毒素入手进行筛查，以提高检出率，并初步制定出相关检验流程。

其后，实验室人员依据口岸工作特点，将此流程进一步完善。

随后，实验室根据国家局安排于6月份接连举办了三期EHEC O104:H4检测技术培训班，为各直属局和部分分支局培训了近百技术人员。

我们很欣喜地看到,刚从珠海培训回去,部分局马上就接到了样品,立即按照培训的方法开展了相关检验工作。

虽然本次疫情已经结束，但根据O157的流行趋势看，O104的流行与O157具有一定的相似性，存在着造成全球扩散
的可能性，因此制定本规程是必要的。

本行业标准如能制定并颁布实施，将具有适用范围广、实用性强的特点，全国保健中心微生物实验室均可采用，并切合当前国境口岸工作实际。

相关检测流程和方法由本实验室联合国家CDC共同制定,更切合口岸实际，并已对全国各直局进行了相应培训。

与国家CDC发布的《肠出血性大肠杆菌O104：H4检测技术流程》、《肠出血性大肠杆菌O104：H4感染防控方案（试行）》、《肠出血性大肠杆菌O104：H4感染诊疗指导原则（试行）》有一定区别。

GB 《食品卫生微生物学检验致泻大肠埃希氏菌检验》、WS 271《感染性腹泻诊断标准》未针对肠出血性大肠杆菌O104：H4的特点开展检测工作，但本标准利用了美国CDC相关技术文件、德国出血性大肠埃希菌检测最新进展、国内外相关检测文献等。

标准的研制过程
本标准自2012年6月被批准立项后，由珠海检验检疫局涂承宁执笔，形成草案稿形成草案稿和讨论稿，在珠海国际旅行卫生保健中心杨泽主任、莫秋华博士等标准编写参与人员的指导和讨论下于2013年9月形成了征求意见稿的内容。

2.技术依据
文本编辑依据GB/标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写规则》和SN/T1256-2003《国境卫生检疫标准编写基本规则总则》进行。

3.技术内容
参照的国家卫生标准及行业标准
本行业标准参考了以下相关标准中的部分内容：
GB/《食品卫生微生物学检验总则》
GB/《食品卫生微生物学检验小肠结肠炎耶尔森氏菌检验》
SN/T1297-2003《国境口岸霍乱疫情监测规程》
SN/T1560-2005《入出境船舶医学媒介生物监测规程》
》
SN/T 1720-2006《出入境口岸轮状病毒感染监测规程》
GB/《》
中华人民共和国卫生部医政司，《全国临床检验操作规程》（第3版），2006年
参照的国家法律、法规
参照了《中华人民共和国卫生检疫法》、《中华人民共和国卫生检疫法实施细则》、《中华人民共和国传染病防治法》和《中华人民共和国传染病防治法实施细则》的有关规定。

参照的其他相关业务参考资料
3.3.1 《What is Diarrheagenic Escherichia coli?》(美国RightDiagnostics)
3.3.2《肠出血性大肠杆菌O104:H4检测技术流程》(中国CDC)
3.3.3 Recommendations for Collection of Laboratory Specimens Associated with Outbreaks of Gastroenteritis（MMWR October 26, 1990 / 39(RR-14);1-13）
Generic protocols for(i) hospital-based surveillance to estimate the burden of rotavirus gastroenteritis in children and (ii) a community-based survey on utilization of health care services for gastroenteritis in children（WHO/V&B/）《流行病学》第二版（耿贯一.人民卫生出版社.高等医药院校教材）
3.3.6《小肠结肠炎耶尔森菌》(汪华主编)
《FOOD SAFETY INSIDER：Solutions in Rapid Microbiology——Pathogenic Non-O157 Escherichia coli》(加拿大 Diarrheagenic Escherichia coli （美国CIDRAP）
Zoonotic Non-o157 Shiga Toxin Producing Escherichia Coli（STEC）（Report of a WHO Scientific Working Group Meeting）
PCR zum spezifischen Nachweis von HUSEC041（O104：H4）（德国）
Simultaneous identification of strains of Escherichia coli serotype O157:H7 and their Shiga-like toxin type by mismatch amplification mutation assay-multiplex PCR.（Cebula,T,A, ）
《肠出血性大肠杆菌O104H4感染防控方案（试行）》(中国CDC)
几点技术说明
3.4.1术语和定义
致泻性大肠埃希菌定义主要译自美国RightDiagnostics发布的《What is
Diarrheagenic Escherichia coli?》。

产志贺样毒素大肠埃希菌、产维罗毒素大肠埃希菌和肠出血性大肠埃希菌主要译自加拿大食品安全杂志网站发布的《FOOD SAFETY INSIDER：Solutions in Rapid Microbiology——Pathogenic Non-O157 Escherichia coli》
检测流程图
2011年5月26日，世界卫生组织通报德国发生一起EHEC感染暴发疫情，珠海局卫生检疫实验室按照国家质检总局卫生司的指示，与国家CDC传染病预防控制国家重点实验室紧急沟通，并根据各直属局的实际检测能力，共同制定了应急检测技术方案（应急检测流程）。

样本采集与运送
根据致泻性大肠埃希菌感染的流行病学特点和临床表现，根据实验室检验和疾病诊断的需要，确定样本采集的范围为粪便、直肠拭子、水样、可疑食品和环境样本。

粪便、直肠拭子的采集和运送方法依据Recommendations for Collection of Laboratory Specimens Associated with Outbreaks of Gastroenteritis（MMWR October 26, 1990 / 39(RR-14);1-13）推荐的方法并参考Generic protocols for(i) hospital-based surveillance to estimate the burden of rotavirus gastroenteritis in children and (ii) a community-based survey on utilization of health care services for gastroenteritis in children（WHO/V&B/）制定，其中穿尿布儿童粪便的采样又参考了Rotavirus antigen test（MedlinePlus Medical Encyclopedia，last updated: 22 June 2004）。

考虑到有些口岸可能只有蹲厕，借鉴了》和SNT 1720-2006《出入境口岸轮状病毒感染监测规程》使用便盆的方法。

水样的采集和运送方法直接引用GB/《》。

环境样本的采集和运送方法借鉴了》和SNT 1720-2006《出入境口岸轮状病毒感染监测规程》。

可疑食品的采样直接引用《食品卫生微生物学检验总则》“3.样品的采集”。

分离培养鉴定
增菌液分离培养参考，磁珠富集后的分离培养参考天津生物芯片技术有限公司相关说明书。

生化试验参考。

血清学试验参考生产与提供单位天津生物芯片技术有限公司在国家局安排于2011年6
月份举办的EHEC O104:H4检测技术培训班上提供，并经本实验室实际检测操作确认。

报告
食品检测报告格式参考，粪便检测报告格式参考《全国临床检验操作规程》（第三版）。

特殊说明
3.5.1附录A
资料性附录A：“引起腹泻及肠道感染的大肠埃希菌血清型”是为了协助检验人员了解有哪些大肠埃希菌血清型可以引起人类感染，在实际工作中可以进行关注。

该表结合了美国CIDRAP“Diarrheagenic Escherichia coli”和WHO“Report of a WHO Scientific Working Group Meeting：Zoonotic Non-o157 Shiga Toxin Producing Escherichia Coli（STEC）”表格综合而成。

3.5.2附录B
目前市面上有很多种筛查vero毒素在ELISA试剂盒，其样本处理和检测操作均略有不同，此附录不做推荐，但不管选用哪种试剂盒，均应严格按操作说明书要求进行样本处理和检验。

本附录仅以加拿大GBD公司的Human E coli verotoxin ELISA Kit为例进行资料性介绍。

附录C
PCR法筛查vero毒素样品处理方法目前市面上也有一些比较好的专用试剂盒，如使用这些试剂盒应按说明书进行，此附录不做推荐。

如不采用试剂盒方法，可按本附录提供的细菌DNA提取常规方法进行。

所用引物slt-1引用于JCM文章：Simultaneous identification of strains of Escherichia coli serotype O157:H7 and their Shiga-like toxin type by mismatch amplification mutation assay-multiplex PCR，该引物为slt-1最经典引物，并由中国CDC推荐用于国内O157:H7监测。

所用引物slt-2直接引用于德国公布的PCR zum spezifischen Nachweis von HUSEC041（O104：H4），是德国科赫研究所用于检测本次暴发菌株所使用的引物，并公布于该研究所网站中。

所用扩增程序和电泳方法也同时公布于该网站，本附录一并引用。

附录D
免疫磁珠富集
磁珠富集可有效提高检出率，附录所列免疫磁珠富集方法引用于天津生物芯片技术有限公司所生产免疫磁珠法检测EHEC O104：H4试剂盒相关说明书。

聚合酶链反应（PCR）法筛查EHEC O104:H4
分别用于检测O104的引物104rfbO和检测H4在引物fliCH4增色直接引用于德国公布的PCR zum spezifischen Nachweis von HUSEC041（O104：H4），是德国科赫研究所用于检测本次暴发菌株所使用的引物，并公布于该研究所网站中。

所用扩增程序和电泳方法也同时公布于该网站，本附录一并引用。

3.5.5附录E
PCR法检测EHEC O104:H4 其它相关基因和毒力因子是为了判定所检出菌株其毒力特征，与是否检出EHEC O104:H4的判断无关系。

EHEC经典毒力基因和EaggEC毒力基因检测引物及其扩增程序来自国家CDC发布的《肠出血性大肠杆菌O104H4感染防控方案（试行）》。

4.建议
本规范针对2011年德国暴发的EHEC O104:H4疫情，并充分考虑到其后发展的需要，实用性极强，建议尽快发布。