血凝块DNA提取方法探讨(1)

合集下载
  1. 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性,平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
  2. 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
  3. 3、如文档侵犯您的权益,请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间:9:00-18:30)。

no m a trea ted with c i sp l a ti n.Ora lOnco,l2003,39(2):157 9Nakaya m a K,Kanzak iA,Oga wa K,et a.l Copper2transpor2 ti ng P2type adenosi ne triphosphatase(ATP7B)as a c isplati n based che m ores i stance m arker i n ovar i an carc i no m a:co m2 parati ve analysis w it h expressi on ofMD R1,MR P1,MR P2, L R P and BCRP.Int J Cancer,2002,101(5):488
10Safae iR,H o we ll SB.Copper transporters regu l ate t he cell u2 lar phar m acolo gy and sensiti vity to P t drugs.Cr it R ev Oncol
H em ato,l2005,53(1):13
11Katano K,Ko ndo A,Sa faei R,et a.l A cqu isiti on of resi st2 ance to c i sp l a tin is acco mpan ied by changes i n the ce ll u lar phar m acolog y of copper.Cancer R es,2002,62(22):6559 12Katano K,Sa fae i R,Sa m i m i G,et a.l The copper export pu m p ATP7B modulates t he cell u l ar phar m acol ogy of carbo p l atin i n ovarian carci no m a cell s.Mol Phar m aco,l2003,64(2):466
(2005209212收稿责任编辑王曼)
血凝块DNA提取方法探讨*
何欣孙哲郭涛李韶华温巍王立东#
郑州大学医学实验中心癌症研究室,河南省食管癌重点开放实验室,郑州大学第一附属医院内科郑州450052
#通讯作者,E2ma i:l l d wang@
关键词血凝块;DN A提取;冰冻切片
中图分类号R735.1
摘要目的:探讨血凝块DNA提取的方法。

方法:利用血凝块融化液直接进行D NA提取,并通过血凝块融化液涂片、血凝块冰冻切片以及琼脂糖电泳鉴定所提DNA的质和量。

并与常规研磨法提取DN A进行比较。

结果:利用血凝块融化液直接提取D NA浓度可高达(13.9?10.4)m g/L,A(260n m)/A(280n m)为1.85?0.11;高于研磨法的(9.70?4.1)m g/L和1.74?0.08(P<0.05)。

血凝块融化液中以及血凝块冰冻切片中均含有较多的有核细胞。

结论:利用血凝块的融化液直接进行DNA提取是一种简便、实用的DN A提取方法。

A novelmethod f or DN A extraction fro m bl ood cl ot
H E X in,SU N Zhe,GU O Tao,LI Sha ohua,WE N Wei,W A NG Li d ong
Labora tory for Canc er Rese a rch,Experi m enta l Center for M e dicine;H e nan Ke y L a bora tory for E s ophagea l Cance r;D e part m e nt of M e dicine,t h e F irst A ffilia te d H os pita l,Zhengz hou University,Zhengz hou450052
K ey word s blo od c l ot;DNA extracti on;frozen secti on
Abstr ac t A m i:To i ntroduce a novel m et hod for D NA extracti on fro m blood c l ot.Me thods:DNA was extracted d i2 rectly fro m t he fl u i d at the botto m of se m i2frozen blo od clot.The frozen sectio n for the bloo d clot,s m ear for b l ood ce lls fro m the fl uid and ge l ose electrophores i s were app lied t o identify the quantit y and qua lity of t he D NA and to explore the possi b le pr i nciple for this me t hod.R e su lt s:R i ch DNA w it h h i gh qua lit y could be obta i ned d irectly fro m the b l ood c l ot fl u i d and the obta i ned DNA co ncen trati on was as hig h as(13.9?10.4)mg/L.P l enty of t he nuclear ce lls were observed on t he fl u i d s m ear and frozen sec tio n.C onc l us i on:DNA extractio n w it h se m i2frozen b l ood clot is easy and practi ca.l
近年来,采用分子标志物从机制上对疾病的病
*国家杰出青年科学基金资助项目30025016;河南省高校创新人才工程基金资助项目1999125;河南省医学科技攻关基金资助项目20058;河南省食管癌重点开放实验室基金资助项目20050227;郑州大学211工程基金资助项目因及遗传易感性进行研究已成为研究的一个热点[1]。

这种研究需要从大量的人体组织和血液等生物标本中提取D NA后进行分析。

目前,临床检验和流行病学调查所采集的血样,在分离血清后,因血凝块不能做某些分析而被弃去,若需提取D NA,则需另外采集抗凝血,既增加成本,又降低现场可行
#
56
#郑州大学学报(医学版)2006年1月第41卷第1期
性。

传统提取血凝块D NA的方法为研磨血凝块,但费时费力,且易污染[1,2]。

作者发现血凝块半融化状态时,不断渗出融化的液体,对这种液体离心后可提取出浓度较高、质量较好的D NA,且比传统的方法省时省力,污染少,介绍如下。

1材料与方法
1.1材料¹血凝块:所采集的全血来自食管癌高发区河南省林州市,共20人份。

受检对象每人采空腹外周静脉血5m,l分离血清后将血凝块分为2份,-20e保存,每份体积约为2~3m,l1份用半融血凝块法提取D NA,另1份用研磨血凝块法提取D NA。

保存时间2~18个月。

º主要试剂:红细胞裂解液、蛋白酶K、异丙醇(Si g m a2A l d rich Co.Cana2 da Ltd,Oakville,Ontari o,Canada),有核细胞裂解液、蛋白沉淀剂、D NA水化液(Puregene T M,Gentra Syste ms,M inneapolis,MN,US A)。

1.2半融血凝块DNA的提取先将冻存血凝块于冰冻切片机上,分别于上、中、下3部分切片,厚度为10L m,H E染色。

血凝块于室温下自然解冻后,提取凝块周围残留融化液体100L,l置500L l洁净Epen2 dorf管中离心,弃上清液,同时采用全自动血细胞记数仪对上清液进行细胞记数;加入3倍体积红细胞裂解液,与残留液充分颠倒混匀,于室温下静置10m in,中间至少再颠倒混匀1次;13000@g离心1m i n,弃上清;剧烈振荡试管,使底部细胞团块散开;抽取底部细胞做涂片,HE染色;每管加入有核细胞裂解液100 L l及20g/L蛋白酶K1L,l振荡、混匀;55e水浴1 h;冷却至室温下,每管加入蛋白沉淀剂35L,l于振荡器剧烈振荡20s,使之充分混合;13000@g离心3 m in,取上清,加入纯异丙醇100L,l轻轻颠倒混匀50次以上;13000@g离心2m i n,取上清,加入体积分数70%乙醇100L l洗涤,轻轻颠倒混匀100次以上; 13000@g离心1m i n,弃上清,室温下晾10~15m in;加入D N A水化液35L,l室温下静置30m i n,-20e 保存;以7g/L琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度仪检测所提取的DN A质量及浓度[3]。

D N A浓度(mg/L)=A(260nm)/0.020。

1.3研磨法提取DNA按常规方法研磨血凝块提取D NA,并测定D NA质量及浓度。

2结果
融化液中细胞记数结果:白细胞(0.22?0.10)@109L-1,淋巴细胞(0.12?0.05)@ 109L-1,单核细胞(0.03?0.01)@109L-1。

血凝块冰冻切片HE染色后镜检发现大量纤维蛋白原,而离心过的半融液体细胞涂片HE染色显示大量有核血细胞(图1A、B)。

半融血凝块组提取的DNA浓度达(13.9?10.4)mg/L,纯度(A(260nm)/A(280 nm))为1.85?0.11,高于研磨组的(9.70?4.1) mg/L和1.74?0.08(P<0.05)。

图1血凝块冰冻切片(A)和
血凝块融化液细胞涂片(B)结果(HE,@20)
3讨论
作者改进了传统血凝块提取DNA的方法,显示冰冻血凝块在室温中逐渐解冻,析出部分融化液体,把这些融化液体离心后,抽取底部部分液体,进行DN A提取,省时省力且提取的DN A数量比用传统方法提取的多。

将冰冻血凝块直接做冰冻切片,然后做H E染色,观察结果为含有大量纤维蛋白原及一些白细胞。

而把融化液体离心抽取底部液体涂片行HE染色,镜下发现大量白细胞。

提示,研磨冰冻血凝块提取DN A效果之所以不及改进后的方法,在于冰冻血凝块中含有大量纤维蛋白原,影响研磨及纯度,而血凝块融化时大量血细胞从纤维蛋白原的间隙中释放出来,经过离心融化液体,由于单位体积内细胞含量大量增加,一次提取DN A的量也因此增加。

因此作者认为血凝块融化液体可直接用于D NA提取和PCR 扩增,同时认为血凝块是进行以PCR为基础的基因功能分析的极有价值的D NA源。

参考文献
1邹建湘,王立东,洪钧言,等.利用不同D NA源进行基因多态性研究的可行性分析.河南医学研究,1999,8(4):307
2W ang LD,Zheng S,L i u B,et a.l CYP1A1,GSTs and mE H pol y morph is m s and s uscepti b ilit y to esophageal carc i2 no m a:st udy of popu l atio n fro m a h i gh2i nc i dence a rea in north Ch i na.W or l d J G astroen tero,l2003,9(7):1394
3F.奥斯伯,R.E.金斯顿,R.布伦特,等.精编分子生物学实验指南.北京:科学出版社,2001.830
(2005209212收稿责任编辑王曼)
#
57
#
Jo urna l of Zhengzhou Un i vers it y(M ed ica l Sc iences)Jan.2006Vo.l41No.1。

相关文档
最新文档