非洲猪瘟病毒诊断方法研究进展

摘要：非洲猪瘟属于我国的一类动物疫病，它是由非洲猪瘟病毒感染引起的导致猪伴发高死亡率的烈性动物传染病之一。

2018年8月，首次在我国的辽宁省沈阳市发现了ASF 疫情。

由于目前无有效疫苗，控制该病必须基于早期预防、检测以及严格的生物安全措施。

本文介绍了目前常用的非洲猪瘟病毒检测方法，为快速和准确诊断非洲猪瘟提供了一定技术参考。

关键词：非洲猪瘟；诊断方法；研究进展
非洲猪瘟病毒诊断方法研究进展
张小敏
（如皋市畜牧兽医站江苏南通226500）
doi:10.3969/j.issn.1008-4754.2023.08.049
收稿日期：2022-12-02
非洲猪瘟（ASF ）是由非洲猪瘟病毒（ASFV ）引起的一种死亡率接近100%的烈性动物传染病。

由于高发病率和死亡率以及缺乏有效的疫苗，该病原体对全球养猪业与国民经济构成了严重威胁[1]。

ASF 是全球公认的一旦发现需立即上报世界动物卫生组织的烈性
动物传染病，我国将ASF 划分为一类动物疫病。

ASFV 能代表整个病毒家族，且现阶段发现的DNA 虫媒病毒
只有ASFV ，它是由基因组、核壳、内层衣壳和外层衣壳共同组成的二十面体病毒[1]。

ASFV 的基因组表观是一个呈线性结构的DNA 双螺旋分子，其长度范围在170~194kbp 之间，该病毒基因组包含150多个开放阅读框。

ASFV 复杂的病毒粒子组成、生命周期和免疫逃避机制给疫苗的开发带来了巨大的困难。

ASF 最早在1921年发生于肯尼亚[1]，ASFV 最严重的传播发生
在2007年的格鲁吉亚，从东非引进的国际餐饮垃圾中含有ASFV 污染的肉类，导致ASF 在整个欧洲和亚洲蔓延，对全球的养猪业造成了巨大损失。

感染ASFV 的猪及其制品、受污染的饲料、泔水、设施设备及工具等（包括运输车辆、人员装备、器具）均可成为传染源。

2018年，首次在我国的辽宁省沈阳市发现了ASF 疫情[2]
，随后全国多地陆续发生了多起感染事件。

1病毒分离法
Malmquist 等科研人员于1960年用红细胞吸附试验检测AS -
FV 。

该方法的设计理念是由于感染ASFV 猪的带毒红细胞可吸附
在猪的单核或者巨噬细胞的细胞膜表面，而这些携带感染的细胞
能从体内含血液量较大的组织器官中大量获得并分离，如脾脏、肝脏和淋巴结等。

红细胞吸附试验作为检查ASFV 的有效手段，其检测结果可作为具有决定性的诊断依据，但同时该方法也有一定的局限性，比如该试验对实验人员所需的技术手段要求甚高，耗费时间长，并且有一定可能出现呈假阴性的试验结果，故该方法并未用作检测ASFV 的首选方法，通常作为其他ASFV 检测方法的补充[3]。

2免疫学方法
根据被科研人员检测的靶向目标的不同，免疫学方法检测实际上分为两大方向：其一针对ASFV 抗原本身，其二针对机体对ASFV 免疫应答后产生的抗体，因为在猪感染ASFV 后的几个月甚至几年内，都能在感染ASFV 的病猪的血液中检测到ASFV 的抗体，故可借助对抗体的检测发现在ASF 感染中幸存下来的猪。

现阶段科研人员已筛选出了ASFV 结构蛋白中的19个区域作为免疫学方法检测的目标靶点。

2.1免疫荧光试验
免疫荧光试验可以细分为两种，其一为荧光抗体试验，其二为
间接荧光抗体试验，这两种方法的不同主要在于被检测的靶向目标是ASFV 本身还是感染ASFV 后产生的相应抗体。

荧光抗体检测方法的试验原理是“携带”荧光标记的抗体能与相应抗原结合后形成发荧光的抗原抗体复合物，感染ASF 猪的组织病理切片在显微镜下进行观察可看到发荧光的复合物。

间接荧光抗体试验的研发原理是利用荧光标记抗ASFV 抗体的抗体，而非直接荧光标记AS -FV 的抗体。

2.2免疫印迹试验
疑似带毒的样本经处理后经过凝胶电泳的分离，能使目标蛋
白保留在印迹纸上，后续再结合类似免疫荧光抗体或间接荧光抗体后，可完成对ASFV 的检测或者针对其产生的相应抗体的检测，即为免疫印迹试验[4]。

该方法检测ASFV 的特点主要表现为较高的敏感度和特异性，但免疫印迹试验因其过程繁杂且对试验的反应条件、试验所需的设备和试验人员的技术均要求甚高，使得该方法在实际检测ASFV 的过程中局限性强，限制了检测的地点。

2.3酶联免疫吸附试验
酶联免疫吸附试验（ELISA ），其试验原理是让“携带”了酶分子
的抗体与对应的抗原或抗体发生特异性反应，并且在底物溶液存在的情况下促使“携带”的酶发生化学反应，并产生不同颜色且深浅不一的液体。

WOAH （世界动物卫生组织）将ELISA 作为诊断ASF 的首选血清学方法[5]。

研究人员将在培养ASFV 感染的细胞过程中产生的特异性高的胞质可溶性抗原筛选了出来，并作为用ELISA 抗体检测法检测ASFV 需要的包被抗原，该方法已被广泛地应用于ASFV 感染的早期阶段检测。

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中国动物保健2023.08
科研动态
2.4免疫层析试纸方法
胶体金免疫层析技术的原理是把胶体金作为示踪的标志物，并利用抗原抗体反应来显示标志物的技术。

胶体金免疫层析法操作不仅简单而且不需要任何仪器设备，很适合我国基层畜牧兽医用来检测排查ASF [6]。

随着相关科学技术的进步，免疫层析试纸方法检测手段进一步优化，传统的胶体金试纸法已不再具有优势，夹心法应运而生。

其原理是因为带有显色物质的抗体-抗原复合物在检测线处被捕获并在检测线处显色。

检测线在阳性时能捕获带有显色物质的抗原-抗体复合物从而呈现出颜色，在阴性结果时是无法显色的，也就是人们常见的“红色双杠即为阳性，红色单杠即为阴性”。

质控线可直接捕获显色粒子标记的抗体而显色，若质控线不显色则该试纸检测结果为无效结果。

3分子学方法检测非洲猪瘟病毒
研究发现ASFV 的全基因组大小在170~194kbp 范围间，拥有
151~167个开放的阅读框架，利用分子学方法对ASF 进行检测的
第一步应优先确定在ASF 全基因组中保持稳定但又能与其他相似进化关系相区别的基因序列，以该序列作为扩增检查的母模板。

故
该方法需要反复进行验证，保证可以检测到所有的ASFV ，且不会将结果误判为其他关系较近的病毒[7]。

3.1聚合酶链式反应检测法
ASFV 的实验室诊断最常采用的方法即为聚合酶链式反应
（PCR ），其技术核心为针对检测样本找到特异性引物，并根据DNA 或RNA 的生成过程来进行目标基因片段的扩增。

我国科研人员早在2009年就根据ASFV 的结构蛋白基因vp73设计出了PCR 诊断ASFV 的特殊引物，而vp73基因也是世界动物卫生组织推荐的用
来设计特殊引物的目标基因片段。

PCR 具有检测灵敏和耗时短等
优点，被广泛地应用于ASFV 的实验室诊断，但该技术也存在一定的局限性，比如PCR 在开盖加引物时可能会引入微生物，造成试验样本的污染，出现假阳性结果。

另外，用于试验的样本中若存在酶，可能也会影响ASFV 的检测结果，出现假阴性的结果。

3.2荧光定量PCR 检测法
荧光定量PCR 检测法不光可以进行定性检测还能进行定量，
并且提高了PCR 检测的敏感性和特异性，优化了检测的效率。

荧光定量PCR 的检测推荐使用ASFV 的B646L 基因序列来进行扩增。

荧光定量PCR 技术在诊断ASFV 时会比PCR 技术更准确，2009年以后，我国也建立了ASFV 的荧光PCR 检测方法，其灵敏度得到了极大的提升，最低能检测出每微升含15个拷贝数的样品，对样本的采样量进行了优化。

2019年我国已开发出用荧光定量PCR 检测非洲猪瘟病毒的试剂盒，并成功注册成为国家二类新兽药。

2020年12月发表的《非洲猪瘟诊断技术》将ASFV 的vp72基因作为目标扩增基因，优化了荧光定量PCR 方法检测ASFV 的技术[7]。

3.3环介导等温扩增技术
环介导等温扩增技术是在普通PCR 技术上进行了优化，试验
过程均在60~65℃的温度下进行，并在短时间内完成目标基因的扩增，通常在1h 内，是一种更为简便、快速、精确和花费成本更低的检测方法。

2019年，利用环介导等温扩增技术检测ASFV 的试剂盒成功面市，并成为第一个成功用该技术注册ASFV 检测的试剂盒[7]。

3.4重组酶介导等温核酸扩增技术
重组酶介导等温核酸扩增技术在近年来愈发受欢迎，该方法
利用了细菌或真菌产生的重组酶，这些酶相比噬菌体产生的重组酶更易获得且对试验温度的变化具有更强的适应性。

如今，我国在运用该技术检测ASFV 时，推荐选用B646L 作为目标基因序列，并采取荧光标记的探针追踪该目标基因序列进行ASFV 的检测。

3.5微流控芯片检测法
微流控芯片技术是于1990年左右提出的一种借助微米级通
道来操控微液滴流动的技术，但随着科学技术的发展，目前被科研人员用来与光学传感技术相融合，达到检测病原微生物的目的。

该方法被推荐用于ASFV 的检测，并在2021年7月被纳入了出入境检疫行业标准，推荐选用的目标基因序列为Vp72基因，特异性的引物被固定后装在芯片反应室，后续会与核酸模板和荧光染料充分混合，利用具有离心功能和恒温功能的微流控芯片检测仪来达到检测ASFV 的目的[7]。

4结语
非洲猪瘟疫情自2018年在我国肆虐以来，对我国的养猪业造
成了巨大损失，但ASFV 的检测技术由此发生了巨大改变，取得了非常大的进展。

本文提及的检测非洲猪瘟病毒的方法都具有其优势，但同时也都具有一定的局限性，故具体的检查手段应结合实际的需要来进行选择。

此外，科研人员在保证准确性和灵敏度的情况下应尽可能地研发出更高效的检测方式，提高检测限度，做到即时诊断。

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参考文献：[1]Li Z,Chen W,Qiu Z,et al.African Swine Fever Virus:A Review.Life
(Basel),2022(8):1255.
[2]陈腾,张守峰,周鑫韬,等.我国首次非洲猪瘟疫情的发现和流行分析[J].中国兽医学报,2018,38(9):1831-1832.
[3]杨湛森,蒋雅楠,程楠,等.非洲猪瘟病毒检测方法的研究进展[J].分析测试学报,2021,40(5):628-638.
[4]
Pastor MJ,Laviada M D,Sanchez-vizcal-nojm,et al.Detection of African swine fever virus antibodies by immunoblotting assay [J].Can J Vet Res,1989,53(1):105-107.
[5]
张路捷,高雁怩,夏婷婷,等．非洲猪瘟病毒p72蛋白阻断ELISA 检测方法的建立[J].畜牧兽医学报,2022,53(5):1509-1516.
[6]刘涛,李永秀,康亚男,等.非洲猪瘟病毒检测技术研究进展[J].猪病防控,2021(5):57-62.
[7]庄金秋,梅建国,谢金文,等.非洲猪瘟病毒实验室检测方法研究进展[J].饲料与畜牧,2017(22):32-36.
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