Box-Benhnken设计优化植物乳杆菌培养基

Box-Benhnken设计优化植物乳杆菌培养基
张瑶;李啸;潘冬瑞
【摘要】通过单因素试验筛选出植物乳杆菌的最适碳源、氮源以及各缓冲盐、无机盐等物质的种类及优化浓度.再通过Plackett-Burman试验设计筛选出显著影响因子.然后用最陡爬坡试验逼近关键因素的最大响应区域.最后在此基础上,采用Box-Benhnken试验设计法对培养基组分进行进一步优化,得出其最佳浓度.结果表明,优化得到3种显著因子糖蜜、MgSO4、吐温-80通过响应面优化后的结果分别为23.79％(v/v),0.16％ (w/v),1.35％ (w/v).采用优化培养基后活菌数可达到
4.45×109cfu·mL-1,较在MRS中培养的活菌数提高12倍左右.
【期刊名称】《天津农业科学》
【年(卷),期】2013(019)007
【总页数】5页(P1-5)
【关键词】培养基优化;高密度培养;响应面设计;植物乳杆菌;糖蜜
【作者】张瑶;李啸;潘冬瑞
【作者单位】三峡大学化学与生命科学学院,湖北宜昌443003;三峡大学化学与生命科学学院,湖北宜昌443003;安琪酵母股份有限公司,湖北宜昌443003;三峡大学化学与生命科学学院,湖北宜昌443003
【正文语种】中文
【中图分类】S816.7
植物乳杆菌是乳酸菌的一种，与人类的生活关系非常密切，常见于奶油、肉类及许多蔬菜发酵制品中，能通过胃并定植于肠道发挥有益作用[1]。

植物乳杆菌可以将
食品原料中的糖转变为乳酸,同时产生抗菌肽、胞外多糖和其他代谢产物，供人体
吸收利用[2]。

目前在植物乳杆菌培养基优化方面，国内的研究中大多采用葡萄糖、蔗糖等作为碳源，而葡萄糖、蔗糖的价格较高，增大了生产的成本。

另外，在国内外的诸多研究中培养基大多使用动植物蛋白胨作为氮源，由于动植物蛋白胨对人体可能带来致病性、敏感性等一系列安全问题，经此发酵的植物乳杆菌运用到食品和医疗保健等方面就具有一定的风险性。

所以，寻求低成本且在安全性上有保证的植物乳杆菌培养基势在必行。

本研究旨在选择低成本、安全性高、能显著促进菌体生长的培养基，为工业生产提供参考依据。

在充分考虑培养基成分选择的前提下，通过Plackett-Burman设计、Box-Behnken设计等对植物乳杆菌培养基成分进行了系统的优化，最终显著提升了植物乳杆菌的活菌数。

1 材料和方法
1.1 菌种
植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum），由安琪酵母股份有限公司提供。

1.2 培养基
1.2.1 基础培养基 MRS培养基[3]：葡萄糖2%，牛肉膏 1%，蛋白胨1%，酵母浸粉0.5%，柠檬酸三铵0.1%，磷酸酸氢二钾 0.2%，醋酸钠 0.5%，硫酸镁0.2%，吐温-80 0.058%，硫酸锰0.025%，pH值6.2。

1.2.2 活菌计数培养基葡萄糖2%，牛肉膏1%，蛋白胨1%，酵母浸粉0.5%，柠檬酸三铵0.1%，磷酸氢二钾 0.2%，醋酸钠 0.5%，硫酸镁0.2%，吐温-80
0.058%，硫酸锰 0.025%，琼脂粉2%，pH值 6.2。

1.3 培养方法
1.3.1 菌种的活化将甘油管保存的菌种取1mL，放入装有50mL液体MRS培养基的250mL三角瓶中，瓶口加棉塞并用保鲜膜密封，于180 rpm摇床在30℃的条件下培养13 h。

1.3.2 发酵培养将培养好的种子液以4%的接种量接入装有50mL发酵培养基的250mL三角瓶中，瓶口加棉塞并用保鲜膜密封，于180r·min-1摇床在30℃的条件下培养15 h。

1.4 检测方法
1.4.1 活菌计数方法见参考文献[5]。

1.4.2 OD值测定发酵液用蒸馏水稀释适当倍数并震荡混匀后，用可见分光光度计测定600 nm 处的吸收值（OD600）。

1.5 试验设计方法
1.5.1 Plackett-Burman设计 [6]通过Plackett-Burman设计，对经过单因素试验挑选出的几种物质（糖蜜、YE、硫酸镁、硫酸锰、吐温-80）进一步优化，选出对植物乳杆菌生长的最显著因子。

Plackett-Burman设计采用5因子2水平的试验
设计，每个因素取高（+1）低（-1）两个水平（以单因素试验得出的最佳浓度作
为参考），其中响应值为活菌数。

通过对效应值的计算，同时进行t检验，置信度高的因子为最显著因子。

1.5.2 最陡爬坡试验响应面拟合方程只有在考察的整个领域里才能充分拟合近似的真实情形。

最陡爬坡试验能根据各因素效应值的大小，经济、快速地逼近最佳值区域。

根据Plackett-Burman实验设计的结果，选择对植物乳杆菌增殖影响显著的
因子（糖蜜、硫酸镁、吐温-80），根据t值的大小确定合适的步长和正确的方向，快速逼近最大响应区域。

1.5.3 Box-Behnken设计[7]根据Box-Benhnken的中心组合试验设计原理，进一步进行3因素3水平的响应面分析试验，设计17个试验点，17个试验点可以分
为两类，其一是析因点，自变量取值在X1、X2、X3所构成的三维顶点，共有12个析因点；其二是零点，为区域的中心点，零点试验重复5次，用以估计试验误差。

2 结果与分析
2.1 单因素试验
通过单因素试验对植物乳杆菌培养基成分进行筛选，初步优化的配方如下：糖蜜（v/v）28%、YE(w/v)14%、硫酸镁 (w/v)0.2%、硫酸锰(w/v)0.04%、吐温-80 (w/v)0.7%、磷酸氢二钾(w/v)0.8%、柠檬酸三铵(w/v)0.4%，选择其中显著的5
种物质糖蜜、YE、硫酸镁、硫酸锰、吐温-80进行进一步优化。

2.2 Plackett-Burman设计
对糖蜜、YE、硫酸镁、硫酸锰、吐温-80 5种物质进行Plackett-Burman设计，
设计结果和分析如表1、表2所示。

表1 Plackett-Burman设计及结果注：其中X1为糖蜜；X2为YE；X3为硫酸镁；X4为硫酸锰；X5为吐温-80；X6～X11为空项，用于方差分析。

序号糖蜜 YE 硫酸镁硫酸锰吐温-80空项1 空项2 空项3 空项4空项5空项6 活菌数
/(×108cfu·mL-1）1 1 1 1 -1 -1 -1 1 -1 1 1 -1 20.0 2 1 1 -1 -1 -1 1 -1 1 1 -1 1 24.5 3 -1 1 1 1 -1 -1 -1 1 -1 1 1 28.0 4 -1 1 -1 1 1 -1 1 1 1 -1 -1 43.0 5 -1 -1 1 -1 1 1 -1 1 1 1 -1 34.0 6 1 -1 1 1 1 -1 -1 -1 1 -1 1 27.5 7 1 -1 -1 -1 1 -1 1 1 -1 1 1 24.0 8 -1 -1 -1 1 -1 1 1 -1 1 1 1 32.0 9 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 33.5 10 1 -1 1 1 -1 1 1 1 -1 -1 -1 18.5 11 1 1 -1 1 1 1 -1 -1 -1 1 -1 29.5 12 -
1 1 1 -1 1 1 1 -1 -1 -1 1 33.0
表2 Plackett-Burman设计各因素参数的分析结果来源均方和均方 F值 P值
Prob＞F 显著性模型 461.94 92.39 12.52 0.004 0 显著糖蜜 295.02 295.02
39.97 0.000 7 显著YE 6.02 6.02 0.82 0.401 3硫酸镁 54.19 54.19 7.34 0.035 1 显著硫酸锰 7.52 7.52 1.02 0.351 8吐温-80 99.19 99.19 13.44 0.010 5 显著
按表1进行Plackett-Burman试验，用12种不同质量浓度的培养基进行植物乳
杆菌培养。

经过方差分析，列出了Plackett-Burman试验各因素参数的分析结果，由表2可见，糖蜜对植物乳杆菌活菌数的影响非常显著(P=0.000 7)，吐温-
80(P=0.010 5)和硫酸镁(P=0.035 1)对植物乳杆菌活菌数影响显著，5种成分的显著性依次为：糖蜜＞吐温-80＞硫酸镁＞硫酸锰＞YE。

模型的复相关系数
R2=0.912 5，相关性较好。

2.3 最陡爬坡试验
由Plackett-Burman设计的试验结果，确定主要因素的最陡爬坡路径，其中糖蜜、硫酸镁为负效应，应该减少；吐温-80为正效应，应该增加。

其他物质取单因素试验得到的最优化的浓度。

试验设计及结果如表3所示。

由表3可见，第2组所得到的活菌数最高，故以糖蜜（v/v）24%、硫酸镁（w/v）0.16%、吐温-80（w/v）0.8%为Box-Behnken设计的中心点，进行进一步的Box-Behnken设计。

表3 最陡爬坡试验设计及结果编号糖蜜（v/v）/%活菌数/（×108cfu·mL-1）1
28 0.20 0.6 29.7 2 24 0.16 0.8 39.7 3 20 0.12 1.0 38.3 4 16 0.08 1.2 36.7 5 12 0.04 1.4 30.7硫酸镁（w/v）/%吐温80（w/v）/%
2.4 Box-Behnken设计
Box-Behnken设计的结果和方差分析如表4、表5所示。

以试验结果表4中的活菌数作为响应量，其二阶多项式回归方程常数项和系数的
分析如表5所示。

然后根据这些新的统计数据，可以得到回归方程：
活菌数（cfu·mL-1）=41.46-1.17A-1.25 B+3.25C-0.83AB+0.32AC-0.18BC-
7.24A2-8.39B2-0.89C2
经方差分析结果表明，该方程的决定系数为R2=0.984 0，Adj R2=0.963 4，说明该模型预测值与实测值之间拟合度好，能解释96.34%的响应值的变化，只有总变异的3.66%不能用此模型解释，说明该方程拟合度好，模型精度高。

表4 Box-Behnken设计的结果序号糖蜜（v/v）活菌数/（×108cfu·mL-1）1 -1 -1 0 28.0 2 1 0 1 36.3 3 0 -1 1 36.7 4 0 0 0 39.3 5 0 0 0 41.3 6 0 1 -1 28.0 7 0 0 0 41.0 8 0 -1 -1 30.0 9 0 0 0 43.0 10 -1 0 -1 31.0 11 0 0 0 42.7 12 -1 1 0 27.0 13 0 1 1 34.0 14 1 -1 0 26.3 15 -1 0 1 37.0 16 1 0 -1 29.0 17 1 1 0 22.0硫酸镁（w/v）吐温80（w/v）
表5 Box-Behnken设计方差分析表度均方 F值 P值Prob＞F模型 670.32 9 74.48 47.82 ＜0.000 1 A-糖蜜 11.04 1 11.04 7.09 0.032 3 B-硫酸镁 12.5 1 12.5 8.03 0.025 3 C-吐温80 84.5 1 84.5 54.26 0.000 2 AB 2.72 1 2.72 1.75
0.227 7 AC 0.42 1 0.42 0.27 0.618 5 BC 0.12 1 0.12 0.079 0.787 2 A2 220.86
1 220.86 141.81 ＜0.000 1 B
2 296.56 1 296.56 190.42 ＜0.000 1 C2 3.35 1 3.35 2.15 0.185 7来源平方和自由
通过Design Expert 8.0.6对表5中的数据进行二次多元回归拟合得到二次回归方程的响应面及其等高线（图1～图3）。

图1 响应面法(A糖蜜、B硫酸镁)立体分析图和相应等高线图
图2 响应面法(A糖蜜、C吐温-80)立体分析图和相应等高线图
图3 响应面法(C吐温-80、B硫酸镁)立体分析图和相应等高线图
由图1、图2、图3可知，3种成分的交互作用明显。

此回归模型得出Box-Benhnken设计的最优结果为糖蜜 23.7%（v/v）、硫酸镁 0.16%（w/v）、吐温-80 1.35%（w/v），在此优化条件下的活菌数为4.45×109cfu·mL-1。

2.5 验证试验
为了检测模型优化结果的准确性，按优化的结果配制培养基进行发酵试验，设置平行组，3次试验结果的平均活菌数为4.67×109cfu·mL-1，和模型预测值接近，验证了此模型的准确性。

3 结论与讨论
通过Plackett-Burman设计确定影响植物乳杆菌活菌数的3个显著因子糖蜜、硫酸镁、吐温-80。

然后用最陡爬坡试验对显著因素进行优化，从而确定影响植物乳杆菌活菌数的最佳值区域。

通过Box-Behnken设计确定培养植物乳杆菌优化培养基的3个显著因素的浓度分别为糖蜜23.7%（v/v）、硫酸镁 0.16%（w/v）、吐温-80 1.35%（w/v）。

在此优化条件下的活菌数为4.45×109cfu·mL-1，验证实验中用优化后的培养基对植物乳杆菌培养，得到的活菌数为4.67×109cfu·mL-1，说明了模型的可靠性。

优化后得到的活菌数相对于优化前在MRS中培养得到的植物乳杆菌活菌数
3.87×108cfu·mL-1，提高了 12 倍左右。

用响应面法(RSM)建立了植物乳杆菌高密度培养工艺的模型。

从模型的曲面图就能获得工艺参数大概的取值范围，有利于工艺参数的选择和工艺条件的优化[7]。

优化后较优化前活菌数目提高了12倍，说明响应面法的试验统计方法能快速、有效地对影响植物乳杆菌发酵的培养基成分实现优化，得到最佳配比。

工业生产需要考虑生产成本问题，生产废料的再利用和提高发酵工艺是现在工业生产的必经之路。

糖蜜是制糖工业的副产品，价格相对而言比较低廉[8]，但其含有丰富的营养成份，除了含有大量的发酵糖以外，还含有少量的蛋白质、氨基酸和矿物质[9]，能够很好促进植物乳杆菌的生长。

本研究选择食糖加工过程中的副产品蔗糖糖蜜作为植物乳杆菌培养基的碳源，这是因为蔗糖糖蜜不仅成本较低，而且含有丰富的发酵糖和少量的蛋白质、氨基酸，其
中天门冬氨酸、谷氨酸含量较多，除此之外，矿物质的含量也较高，如钾、氯、钠、镁等。

培养基的氮源选择酵母浸出物FM888，酵母浸出物是以蛋白质含量丰富的
酵母为原料，采用生物技术将酵母细胞内的蛋白质、核酸等进行降解而成，含有丰富的多肽和氨基酸[10]，作为植物乳杆菌培养基的氮源非常安全，不会对人体造成致病性及一些过敏现象等。

所以采用糖蜜作为培养基成分不但可以解决高成本问题，而且在营养成分方面表现出“多面手”的角色，所以选择糖蜜来发酵可以起到一举多得的效果。

【相关文献】
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