DC-SIGN真核表达载体的构建及其稳定转染HeLa细胞系的建立

DC-SIGN真核表达载体的构建及其稳定转染HeLa细胞系的
建立
王欣;詹媛;王琰;周恩民;丁铲;谭磊;陆凤;徐乐乐;仇旭升;宋翠萍;孙英杰;廖瑛;茅翔【摘要】为研究新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)与树突状细胞特异性粘附分子-3-结合非整合素分子(dendritic cell specifi c intercellular adhesion molecule-3-grabbing non-integrin,DC-SIGN)的相互作用对NDV感染树突状细胞(dendritic cell,DC)的影响,本研究拟构建能够稳定表达DC-SIGN蛋白的细胞系,为研究DC-SIGN蛋白与病毒蛋白互作提供基础.以小鼠DCs提取的cDNA为模板,通过PCR方法获得DC-SIGN基因,连入真核表达载体,并命名为pcDNA-DC-SIGN,利用LipofectamineTM2000转染HeLa细胞,G418进行药物压力筛选,经RT-PCR和Western blot鉴定,获得了一株可以高效表达DC-SIGN蛋白的HeLa 细胞,且经过多次传代后仍然可以稳定表达DC-SIGN,说明该细胞系构建成功.%To investigate the infl uence of the interaction between Newcastle diseases virus (NDV) protein with dendritic cells specifi c adhesion molecules - 3 - grabbing non-integrin (DC-SIGN) on NDV infection of dendritic cell (DC), we generated a Hela cell line stably expressing DC - SIGN protein for studying DC - SIGN protein and virus protein interactions. The cDNA was extracted from mouse DCs and used as template. The DC - SIGN gene was amplifi ed in polymerase chain reaction (PCR) for construction of eukaryotic expression vector pcDNA-DC-SIGN, which was then transfected into HeLa cells using LipofectamineTM 2000. A HeLa cell line effi ciently expressing DC - SIGN protein was identifi ed through RT-PCR and Western blot, and the specifi c Hela cell line was stable after many passages.
【期刊名称】《中国动物传染病学报》
【年(卷),期】2015(023)003
【总页数】5页(P12-16)
【关键词】树突状细胞特异性粘附分子-3-结合非整合素分子;新城疫病毒;树突状细胞;HeLa细胞
【作者】王欣;詹媛;王琰;周恩民;丁铲;谭磊;陆凤;徐乐乐;仇旭升;宋翠萍;孙英杰;廖瑛;茅翔
【作者单位】西北农林科技大学动物医学院,杨凌 712100;中国农业科学院上海兽医研究所,上海 200241;中国农业科学院上海兽医研究所,上海 200241;中国农业科学院上海兽医研究所,上海 200241;西北农林科技大学动物医学院,杨凌 712100;中国农业科学院上海兽医研究所,上海 200241;中国农业科学院上海兽医研究所,上海200241;中国农业科学院上海兽医研究所,上海 200241;西北农林科技大学动物医学院,杨凌 712100;中国农业科学院上海兽医研究所,上海 200241;中国农业科学院上海兽医研究所,上海 200241;中国农业科学院上海兽医研究所,上海 200241;中国农业科学院上海兽医研究所,上海 200241;中国农业科学院上海兽医研究所,上海200241
【正文语种】中文
【中图分类】S852.659.5
树突状细胞特异性粘附分子-3-结合非整合素分子（dendritic cell specific intercellular adhesion molecule-3 grabbing non integrin，DC-SIGN），又称CD209，由美国科学家在研究人类免疫缺陷病毒（Human
immunodeficiency virus，HIV）感染机制过程中发现。

DC-SIGN主要存在于树突状细胞（dendritic cell，DC）表面，属于C型凝集素受体超家族，为Ⅱ型跨膜蛋白[1]，由胞浆区、跨膜区、铰链区和胞浆外区组成，其中跨膜区含有15个氨基酸残基，主要与DC-SIGN在膜表面的定位有关[2]。

DC-SIGN通过依赖Ca2+的
碳水化合物识别区域（carbohydrate recognition domain，CRD）形成寡聚体，增强与抗原的结合能力。

DC-SIGN主要可以与ICAM-2、ICAM-3等细胞间黏附
分子相互作用，介导细胞间的相互作用，且在感染性和炎症性正负免疫调节过程中发挥重要作用[2]。

DC-SIGN参与DCs对病原体的识别与摄入，在DCs的黏附调停，迁移，炎症反应，激活初级T细胞，触发免疫反应以及病毒的感染过程中都
扮演着关键的角色[3,4]。

近年来，随着对DC-SIGN的研究不断深入，陆续发现了其在黏附、信号转导、抗原摄取方面的作用。

目前研究已发现多种病原微生物，如HIV-1、真菌、埃博拉
病毒、登革热病毒、SARS冠状病毒的免疫抑制或免疫逃逸都与DC-SIGN有关[5-7]。

本实验室前期在研究新城疫病毒（Newcastle virus disease，NDV）感染DCs引起淋巴细胞增殖发生抑制的过程中，发现NDV感染DCs可能受到DCSIGN蛋白的调节作用，进而影响NDV感染DCs的效力。

本研究拟构建能够
稳定表达DC-SIGN蛋白的细胞系，为研究DC-SIGN蛋白与NDV病毒蛋白互作
提供基础。

1.1 材料和试剂实验动物C57BL/6小鼠购自上海斯莱克实验动物有限责任公司；HeLa细胞和真核表达载体pcDNA3.1(-)/myc-His为本实验室保存；RPMI 1640培养基、PBS购自Hyclone公司； Fetal bovine serum购自Gibco公司；GM-CSF、IL-4购
自eBioscience公司；转染用质粒小量提取试剂盒购自QIAGEN公司；LipofectamineTM2000和G418购自life technologies公司；T4 DNA连接酶、
DNA限制性内切酶XhoⅠ、NheⅠ购自TaKaRa公司；小鼠抗DC-SIGN抗体和山羊抗小鼠IgG抗体均购自Abcam公司。

1.2 方法
1.2.1 引物设计根据GenBank中的DC-SIGN的基因序列，用软件Primer 5.0设计了相应的引物。

上游引物：5'- GCGCTAGCGCCACCATGAGT G A T T C T A A G G A A A T G G G G A-3'；下游引物：5'- GCGCTAGCGCCACCATGAGT，GATTCTAAGGAAATGGGGA-3'。

其中在上游引物添加了NheⅠ酶切位点及保护碱基，在下游引物添加了XhoⅠ酶切位点和保护碱基。

1.2.2 分离和培养小鼠骨髓源树突状细胞无菌条件下取小鼠的胫骨和股骨，用含1%双抗的PBS吹洗骨髓直至髓腔发白，收集液用40目细胞筛过滤，300×g 离心
8～10 min；弃上清，用6 mL红细胞裂解液重悬沉淀，37℃放置3 min后补加PBS上下颠倒混匀，300×g 离心10 min；弃上清，沉淀PBS重悬，300×g离心10 min洗涤1次；弃上清，收集沉淀，并用1 mL含10% FBS、1%双抗的RPMI 1640完全培养基重悬细胞并计数。

将分离得到的骨髓细胞接种于12孔细
胞培养板中，每孔加1 mL含有GM-CSF（10 ng/mL）和IL-4（10 ng /mL）的RPMI 1640完全培养基，细胞终浓度为2×106个/ mL，然后置37℃、5% CO2的培养箱中培养，培养至d3和d5时，半量换液1次，同时补充GM-CSF和IL-4。

1.2.3 DC-SIGN分子克隆将培养7 d的DCs从12孔细胞板中吹下来，300×g离心10 min，弃上清，1 mL Trizol 重悬沉淀，室温放置5 min，每1 mL Trizol液加入200 μL氯仿，剧烈震荡15 s，10 800×g、4℃离心5min，弃上清，按每1 mL Trizol 液加500 μL的比例加入异丙醇，－20℃放置30 min，10 800×g离心10 min，弃上清，加入70%乙醇1 mL，混匀后4℃，10 800×g离心5 min，弃上清，干燥3～5 min，最后用30～50 μL DEPC水溶解沉淀。

反转录体系：RNA
模板30 μL、随机引物1 μL、DEPC水6 μL、10 mmol/L dNTP 1μL、5×M-MLV buffer 10 μL，在70℃水浴中加热10 min后迅速放置在冰浴上冷却，加入RNA酶抑制剂1 μL、反转录酶1 μL（反转录体系为50 μL），在37℃反应2 h
后置于75℃反应5 min，合成的cDNA于-80℃保存备用。

PCR反应体系为50 μL，其中模板DC-SIGN 1 μL、上下引物各1 μL、2×PCR mix 25 μL、灭菌ddH2O 22 μL，反应程序为：94℃预变性 1 min；94℃变性40 s，55℃退火30 s，72℃延伸 45 s，30个循环后；72℃延伸7 min。

1.2.4 DC-SIGN重组载体的构建与鉴定 PCR产物通过琼脂糖凝胶回收大小为717 bp左右的条带，连接pGEM-T easy载体，NheⅠ和XhoⅠ双酶切后连接到同样
酶切位点的真核表达载体pcDNA3.1(-)/myc-His，转化DH5α，挑取单个阳性菌落扩增后进行质粒提取，双酶切鉴定，将鉴定为阳性的质粒送上海生工公司测序，正确序列命名为pcDNA-DCSIGN。

1.2.5 细胞转染及筛选将长满单层的HeLa细胞以3×105个/孔接种于6孔板中，用含10% FBS的DMEM培养基在细胞培养箱中培养，待细胞长满至60%时，按转染试剂LipofectamineTM2000说明书转染构建好的pcDNA-DC-SIGN载体，同时设未加药物组和空白对照组。

根据预实验结果确定G418最佳药物筛选浓度
为800 mg/L，转染24 h后开始加入药物，约7 d后，细胞开始出现大量死亡，
此时开始隔天换液。

当存活细胞形成小簇时，将其消化，经有限稀释法传代至96
孔板中，进行阳性克隆细胞的筛选，此时G418浓度仍为800 mg/L[8]。

将生长
良好的单细胞克隆传代至24孔板, 当细胞生长良好时，再将细胞传代至6孔板，
逐步扩大培养，继续加压培养传代1个月, 经2次冻存复苏，期间对阳性克隆细胞进行DC-SIGN蛋白表达情况的检测。

1.2.6 Western blot鉴定DC-SIN蛋白表达将筛选获得的稳定表达DC-SIGN的HeLa细胞上清吸弃，收集细胞，常规方法处理细胞样品，进行SDS-PAGE电泳，
80 V恒压电泳150 min，电泳后将凝胶取出，250 mA恒流转印90 min。

转印
好的NC膜置于含5%脱脂乳的TBST中4℃封闭1 h，TBST漂洗3次，每次10 min；加入1:1000的Anti-DC-SIGN antibody一抗，4℃作用过夜；再加入辣根过氧化物酶标羊抗鼠二抗（1: 8000稀释），作用1 h， ECL增强显色试剂盒显色。

将NC膜用一抗二抗去除液处理后，重新封闭，以小鼠β-actin抗体为一抗
（1:5000稀释）和HRP标记羊抗小鼠二抗（1:8000稀释）重新孵育，ECL增强
试剂盒显色，Western blot分析β-actin蛋白。

2.1 RT-PCR扩增DC-SIGN基因片段结果PCR扩增DC-SIGN目的片段，通过琼脂糖凝胶电泳分析，获得大小约717 bp的明亮条带，与预期大小一致（图1）。

2.2 DC-SIGN重组质粒双酶切鉴定及测序结果将构建好的重组质粒pcDNA-DC-SIGN，经NheⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定后，能切下清晰的717 bp大小的目的条带，如图2。

同时，将测序结果与预测序列对比，与原序列同源性100%，表明成功构建pcDNA-DCSIGN真核表达质粒。

2.3 RT-PCR检测稳定转染HeLa细胞中DC-SIGN经RT-PCR检测，在成功转染DC-SIGN基因的HeLa细胞中扩增到717 bp的特异性条带。

2.4 Western blot检测稳定转染HeLa细胞DC-SIGN蛋白表达结果Western
blot检测DC-SIGN蛋白在HeLa细胞中的表达情况，结果显示DC-SIGN在HeLa细胞系中成功表达，同时，在未转染的HeLa细胞中不表达；细胞内参蛋白β-actin在两组细胞中均有表达，说明稳定转染DC-SIGN细胞系构建成功。

已有的研究结果显示，DC-SIGN与病原体结合后对DCs细胞功能的影响，决定了病原体侵入动物体的最终结局[2]，因而定向研究DC-SIGN与感染性疾病的关系，可以帮助我们从免疫水平找到治疗和预防病原体的有效途径。

新城疫病毒（NDV）是副粘病毒科（paramyxoviridae）、副粘病毒亚科（paramyxovirinae）、腮腺炎病毒属（rubulavirus）的一种单股负链RNA病毒，编码核衣壳蛋白（NP）、
磷蛋白（P）、基质蛋白（M）、融合蛋白（F）、血凝素-神经氨酸酶蛋白（HN）及大蛋白（L）6种结构蛋白，其中HN蛋白和F蛋白与病毒的毒力和致病性密切
相关。

ND主要引起侵害禽类的呼吸系统和神经系统，每年给全世界养禽业带来了巨大的经济损失。

现有的研究发现NDV可能通过感染DCs，使T淋巴细胞增殖抑制，从而使机体产生免疫抑制的效果[10]，目前对于其具体作用机理还不清楚。

我们在前期研究中发现，由于DC-SIGN的CRD可以识别糖蛋白的N-link糖基化位点，而NDV的HN蛋白在119、341、433、481位氨基酸可以发生N-糖基化，因此推测NDV感染DCs可能是依赖与DC-SIGN的相互作用。

为了进一步确证这种推断，本研究构建了pcDNA-DC-SIGN真核表达载体，并转染至HeLa细胞，通过G418加压筛选及有限稀释法获得了稳定表达DC-SIGN分子的细
胞系。

经PCR和Western blot方法验证，该细胞系能够正确并且稳定表达DC-SIGN蛋白，反复冻存和复苏以及连续传代培养数代后的细胞仍然能够稳定表达
DC-SIGN蛋白，说明细胞系构建成功，这为后续研究NDV病毒蛋白与DC-SIGN 的相互作用奠定了基础，进而为研制预防NDV疫苗提供新的方法和思路。

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