碱裂解发制备质粒DNA原理

碱裂解发制备质粒DNA原理
碱裂解发制备质粒DNA原理
试验原理：
碱裂解法是较常用的提取的方法。

其优点是收获率高，适于多数的菌株，所得产物经纯化后可满足多数的DNA重组操作。

十二烷基磺酸钠进行质粒的小量制备。

十二烷基磺酸钠（SDS）是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性（NaOH 对细胞的裂解作用强于SDS）。

用SDS处理细菌后，会导致细菌细胞破裂，释放出质粒DNA和染色体DNA，两种DNA在强碱环境都会变性。

由于质粒和主染色体的拓扑结构不同，变性时前者虽然两条链分离，却仍然缠绕在一起不分开；但后者完全变性分甚至出现断裂，因此，当加入pH4.8的酸性乙酸钾降低溶液pH值，使溶液pH值恢复较低的近中性水平时，质粒的两条小分子单链可迅速复性恢复双链结构，但是主染色体DNA则难以复性。

在离心时，大部分主染色体与细胞碎片，杂质等缠绕一起被沉淀，而可溶性的质粒DNA留在上清夜中。

再由异丙醇沉淀、乙醇洗涤，可得到纯化的质粒DNA。

碱裂解法提取的质粒DNA可直接用于酶切、pcr扩增、银染序列分析等。

各试剂的作用：
1、溶液Ｉ:pH8.0 GET缓冲液（50mmol葡萄糖，10mmol/LEDTA，25mmol/L Tris－HCl）；溶液Ｉ可成批配制，在10 lbf/in2(6.895x104Pa)高压下蒸气灭菌15min，贮存于４℃。

葡萄糖的作用是使悬浮后的大肠杆菌不会很快沉积到管子的底部，增加溶液的粘度，维持渗透压及防止DNA受机械剪切力作用而降解。

EDTA 是Ca2＋和Mg2＋等二价金属离子的螯合剂，在溶液I中加入EDTA，是要把大肠杆菌细胞中的二价金属离子都螯合掉。

从而起到抑制DNase对DNA的降解和抑制微生物生长的作用。

2、溶液Ⅱ：0.2mol/LNaOH(内含1%的SDS)，这个用的时候需现配。

要新配置溶液Ⅱ是为了避免NaOH接触空气中的CO2而减弱了碱性。

NaOH是最佳溶解细胞的试剂。

不管是大肠杆菌还是哺乳动物
细胞，碰到了碱都会在瞬间溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer （双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化。

用不新鲜的0.4 N NaOH，即便有SDS也无法有效溶解大肠杆菌。

SDS是离子型表面活性剂。

它主要作用是：a溶解细胞膜上的脂质与蛋白，从而破坏细胞膜。

b解聚细胞中的核蛋白。

c能与蛋白质结合成为R-O-SO3-…R＋-蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。

SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在接下来的提取过程必须把它去除干净，以便下一步试验的更好进行。

3、溶液Ⅲ：pH4.8乙酸钾溶液（60ml 5mol/L KAc，11.5ml冰醋酸，28.5mlH2O）；该溶液钾离子浓度为3mol/L，醋酸根离子浓度为5mol/L.pH4.8的乙酸钾溶液是为了把抽提液的pH调至中性，从而使变性的质粒DNA复性，且稳定存在。

溶液III加入后的沉淀实际上是K+置换了SDS中的Na+形成了不溶性的PDS，而高浓度的盐有利于变性的大分子染色体DNA、RNA 以及SDS-蛋白复合物凝聚，使得沉淀更完全。

前者是因为中和核酸上的电荷，减少相斥力而互相聚合，后者是因为盐与SDS－蛋白复合物作用后，能形成较小的盐形式复合物。

4、异丙醇；采用PEG（6000）沉淀DNA，大小不同的DNA分子所用的PEG的浓度也不同，PEG的浓度低，选择性沉淀DNA分子量大，大分子所需PEG的浓度只需1%左右，小分子所需PEG浓度高达20%。

5、无水乙醇：乙醇可以以任意比和水相混溶，而DNA溶液是DNA 以水合状态稳定存在，同时乙醇与核酸不起化学反应，因此是理想的沉淀剂。

加入的乙醇后，乙醇会夺去DNA周围的水分子，DNA 失水聚合。

一般实验中，是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混合，其乙醇的最终含量占67%左右。

也可改用95%乙醇来替代无水乙醇。

但是加95%的乙醇使总体积增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA损失也增大，尤其用多次乙醇沉淀时，就会影响收得率。

折中的做法是初次沉淀DNA时可用95%乙醇代替无水乙酵，最后的沉淀步骤要使用无水乙醇。

也可以用0.6倍体积的异丙醇选择性沉淀
DNA。

一般在室温下放置15－30min即可。

但因为使用异丙醇时常把盐沉淀下来，所以较多的还是使用乙醇。

6、pH8.0TE缓冲液；10mmol/LTris－HCl，1mmol/L EDTA，其中含RNA酶20μg/ml。

在基因操作实验中，选择缓冲液的主要原则是考虑DNA的稳定性及缓冲液成分干扰作用。

磷酸盐缓冲系统（pKa ＝7.2）和硼酸系统（pKa=9.24)等虽然也都符合细胞内环境的生理范围(pH)，可作DNA的保存液，但在转化实验时，磷酸根离子的种类及数量将与Ca2+产生Ca3(PO4)2沉淀；在DNA反应时，不同的酶对辅助因子的种类及数量要求不同，有的要求高离子浓度，有的则要求低盐浓度，采用Tris-HCl（pKa=8.0）的缓冲系统，由于缓冲液是TrisH+/Tris，不存在金属离子的干扰作用，故在提取或保存DNA时，大都采用Tris-HCl系统，而TE缓冲液中的EDTA更能稳定DNA的活性。

酚与水有一定的互溶，苯酚用水饱和的目的是使其抽提DNA过程中，不致吸收样品中含有DNA的水分，减少DNA的损失。

用Tris调节至pH为8是因为DNA在此条件下比较稳定。

在中性或碱性条件下（pH5～7），RNA比DNA更容易游离到水相，所以可获得RNA含量较少的DNA样品。

7、70%乙醇
试验步骤:
1、无菌操作台上,取1.5ml培养菌体置于离心管（Eppendorf管）中，微量离心机上以10000rpm 离心1min，或者以4000rpm离心5－10min，弃上清液，离心管倒扣于干净的吸水纸上吸干。

2、沉淀中加100μl用冰预冷的溶液I，加或不加入少量溶菌酶粉末，充分混合（需要剧烈振荡）。

室温下放置10min。

3、加入200μl溶液II(新鲜配置)，加盖后轻轻快速颠倒离心管数次混匀（千万不要振荡），冰浴5 min 。

4、加入150μl预冷溶液III，轻轻颠倒数次混匀（10s），置于冰浴15 min 。

5、微量离心机上以4℃，12000rpm离心15min，取上清液于另
一新Eppendorf管中。

6、上清夜中加入等体积酚/氯仿（1：1）混匀，微量离心机上以4℃，12000rpm,离心5min。

{经验之谈：如果选用宿主合适的话（如DH5a、XL1-red等，HB101和BL21则不行），可以不用酚氯仿抽提这一步。

用1倍体积的乙醇沉淀，沉淀中所含的盐和RNA就很少了，完全去除上清液后就可以直接加TE溶解质粒，后续的限制性酶切、转化完全没有问题。

仅供参考}
7、小心转上层至一新的离心管弃去中层的蛋白质和下层的有机相。

8、小心移出上清于一新Eppendorf管中,加入2 /3倍体积异丙醇,混匀,4℃离心12000g×5min。

9、上清夜中加入2倍体积的无水乙醇混匀，室温下放置5min－10min，以12000rpm,离心5min-15min。

10、1.0ml预冷的70%乙醇洗涤沉淀1 ～2次,沉淀在室温下晾干。

11、小心吸去上清夜，将离心管倒置于一张纸上，使所有的液体流出。

再将附着在管壁上的液滴除去。

在除去管壁上的液滴时，可以用一次性吸头与真空管相连，用吸头接触液面。

但在液体吸出时应当尽量使吸头远离核酸沉淀。

自然干燥或者真空抽干到看不到液滴最好。

12、加入50μlTE缓冲液（PH 8.0 含20μg/mlRNaseA）溶解质粒粗提物，在-20℃保存。

注意事项：
提取过程应尽量在低温环境中进行，蛋白质的去除以酚/氯仿混合效果最好，可以采取多次抽提尽量将蛋白质除干净，在沉淀DNA 时通常使用冰乙醇，在低温条件下放置可使DNA沉淀完全。

同时反应中加入的盐浓度一定要控制好，当加入的盐溶液浓度太低时，只有部分DNA形成DNA钾盐而聚合，这样就造成DNA沉淀不完全，当加入的钾溶液浓度太高时，其效果也不好。

在沉淀的DNA中，由于过多的盐杂质存在，影响DNA的酶切等反应，必须要进行洗涤或重沉淀。

一般情况下都是加入的最终浓度达0.1～0.25mol/L为宜。

溶液I中各成分的作用
葡萄糖是使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部，因此
有些试剂厂商的溶液I没有葡萄糖成分；EDTA是Ca2+；‘和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，其主要目的是为了螯合二价金属离子从而达到抑制DNase的活性。

溶液II中各成分的作用
NaOH主要是为了溶解细胞，释放DNA，因为在强碱性的情况下，细胞膜发生了从bilayer （双层膜）结构向micelle（微囊）结构的变化；但NaOH易和空气中的CO2发生反应，形成碳酸钠，降低了NaOH的碱性，所以必须用新鲜的NaOH。

SDS与NaOH联用，其目的是为了增强NaOH的强碱性，同时SDS能很好地结合蛋白，产生沉淀。

这一步要记住两点：第一，时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合，不然基因组DNA会断裂。

溶液III中各成分的作用
溶液III中的醋酸钾是为了使钾离子置换SDS中的纳离子而形成了PDS，因为十二烷基硫酸钠（sodiumdodecylsulfate）遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾（potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS 是不溶水的，同时一个SDS分子平均结合两个氨基酸，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了。

2 M的醋酸是为了中和NaOH，因为长时间的碱性条件会打断DNA，所以要中和。

基因组DNA一旦发生断裂，只要是50－100 kb大小的片断，就没有办法再被PDS共沉淀了，所以碱处理的时间要短，而且不得激烈振荡，不然最后得到的质粒上总会有大量的基因组DNA混入，琼脂糖电泳可以观察到一条浓浓的总DNA条带。

75%酒精主要是为了清洗盐份和抑制Dnase；同时溶液III的强酸性也是为了使DNA更好地结合在硅酸纤维膜上。

得到的质粒样品一般用含RNase（50 ug/ml）的TE缓冲液进行溶解，不然大量未降解的RNA会干扰电泳结果的。

琼脂糖电泳进行鉴定质粒DNA时，多数情况下你能看到三条带，但千万不要认为你看到的是超螺旋、线性和开环(环装质粒一条单链发生缺刻)这三条带（泳动速度:共价闭合环状>线性>开环）。

碱法抽提得到质粒样品中不含线性DNA，不信的话你用EcoRI来线性化质粒后再进行琼脂糖电泳，
就会看到线性质粒DNA的位置与这三条带的位置不一样。

其实这三条带以电泳速度的快慢而排序，分别是超螺旋、开环和复制中间体（即没有复制完全的两个质粒连在了一起）。

如果你不小心在溶液II加入后过度振荡，会有第四条带，这条带泳动得较慢，远离这三条带，是20-100 kb的大肠杆菌基因组DNA的片断。

所有的质粒抽提方法首先都要考虑如下几点：如何去除RNA，如何将质粒与细菌基因组DNA 分开，如何去除蛋白质及其它杂质。

去除RNA 相对比较简单，首先是使用RNase 消化(抽提中或者抽提后)。

经过RNase 消化后，RNA 变得比较小了，其残留对酶切反应几乎没有影响。

如果要彻底去除残留得RNA，则需要更烦琐的操作。

将质粒与细菌基因组DNA 分开，基本上是采用两种办法：一是利用酶/弱去污剂部分裂解细菌，在抽提时只让质粒从细菌中释放出来，而不让基因组DNA 从细菌中出来，从而将质粒和基因组DNA 分开；二是利用NaOH/SDS 完全裂解细菌，让质粒和细菌基因组DNA 都从细菌中出来，再利用质粒和基因组DNA 在变性/复性过程中的不同表现，将质粒与基因
组DNA 分开。

去除蛋白质及其它杂质，基本上是与去除细菌基因组同时实现的。

但是，依据不同的细菌，不同的培养条件，以及操作时的精细程度等，杂质的残留量会不同。

所以，通常需要使用苯酚做更进一步的纯化。

经过上面的处理，沉淀下来的质粒基本上可以用于酶切了。

如果要用于更高级的实验，如转染，则需要做进一步的纯化，如CsCl 超离心。

实验前方法/试剂的选择
首选方法是碱裂解法。

如果有问题，或者是大质粒(>15 kb)，则用温和的方法SDS 裂解法。

详细情况见“分子克隆”。

试剂盒几乎都使用碱裂解法，所以都有一个通病，抽提大质粒时效果不好。

关于碱裂解法
质粒抽提最常用的方法是碱裂解法，它具有得率高，适用面广，快速，纯度高等特点。

当然，碱裂解法也有缺陷：容易导致不可逆的
变性；不适合大质粒的抽提。

碱裂解法是很剧烈的方法，质粒在碱性条件下会变性，时间一长，这种变性就成为不可逆的了(电泳时在超螺旋前面一点点，如果有一条带，就是此变性的质粒。

)。

所以，要降低不可逆的变性，就要控制好碱裂解的时间。

（似乎可以做这么一个推理：在碱性条件下，质粒的两条链从一点或者几个点开始分开，随着时间的延长，直到完全分开。

理论上讲，完全分开的两条链要很快地配对复性，成功率肯定不可能是100%的，而没有完全分开的两条链却完全可能100% 配对复性）碱裂解法不适合大质粒的抽提，原因也是因为该方法太剧烈，使超螺旋比例较低。

文献推荐的抽提大质粒的方法是温和得多的方法，缺点是得率要低一些。

现在得问题是，大质粒的拷贝数本来就低，如果抽提方法得率再不高的话，抽提起来就很费力了。

如果注意到在碱裂解法中，超螺旋比例随着碱裂解时间的延长而降低，随着粘稠度的增加而减低这个现象，完全可以使用碱裂解法来抽提大质粒的：增加试剂的使用量，使加入NaOH/SDS液后，溶液在1分钟内就能变得很清澈；立即加入中和试剂。

质粒抽提的8 大窍门
1：摇菌时间。

过夜培养是一个普遍接受的概念，而且适合大部分情况。

如果出现了问题，调整培养时间会有帮助：Nick 多，则增加培养时间；酶切出现问题，则减少培养时间。

2：起始菌体量。

大家习惯说“从多少ml 菌液中抽提质粒”，但一定要养成每次都观察菌体量的习惯，因为质粒毕竟是在菌体中，而且，抽提质粒所用的试剂量，都只与菌体量有关。

3：菌体的彻底悬浮。

如果没有彻底悬浮菌体，则残留的菌体团块在溶液II 加入后，变成一个外围几乎彻底裂解，往里不完全裂解，中间没有裂解的团块。

这个团块在溶液III 加入后，会有一部分蛋白质继续存在于溶液中，成为蛋白质残留的最大根源。

4：使用相对过量的试剂。

这是适合所有核酸抽提的建议。

试剂相对过量的好处是：稳定性好，纯度高，操作更简单。

如果认为这样不经济，就少用一点菌体。

5：裂解时间。

加入溶液II 后，混匀，体系最好能立即变得清澈。

体系如果变得清澈了，马上加入溶液III 中和。

如果体系不马上变清澈，
下次少用一点菌液，或者多用一点溶液。

如今的质粒设计得越来越复杂了，奇怪的现象也越来越多，而所有的奇怪现象，多与裂解时间有关。

6：中和的操作。

在1.5ml 离心管中加入溶液III 后，先颠倒两次，使管底朝上，用指头弹击管底数次，再颠倒混匀。

效果非常好。

7：中和后的离心去蛋白。

一定要将蛋白质彻底离心下去。

如果发现离心后仍然有蛋白质漂浮在液面，继续离心的效果并不好；而将上清倒入另外一个离心管中，再离心，效果要好许
降低RNA 残留的方法
RNA 的去除，首先是使用RNase 消化。

在溶液I 中加入高浓度的RNase A (100ug/ml)，或者用含25ug RNase A/ml TE 溶解抽提好的质粒，都可以降低RNA 残留，但都不能彻底去除。

幸运的是，RNA 的残留并不影响酶切等最常用的用途。

如果想彻底去除RNA 残留，可以用试剂盒，或者使用对4 个碱基都作用的RNase。

降低gDNA 残留的方法
gDNA 的残留问题，必须在抽提过程中解决，否则，就只能用胶回收方法处理了。

gDNA 越大，越难于复性，也就越容易被去除；所以，一定要尽可能不打断gDNA。

裂解体系越粘稠，gDNA 越容易被扯断；操作手法越重，gDNA 也越容易被打断。

温和操作，使用相对过剩的试剂，是降低gDNA 残留的最好方法。

降低蛋白质残留的方法
蛋白质的去除，主要是靠不溶解的K-SDS-蛋白质复合物的形成。

虽然将中和后的体系置于4℃一段时间，可以形成更多的该不溶复合物，从而使蛋白质残留更少，但实践证明这样做并不是必须的，除非是大量抽提。

只要加入溶液I 后的悬浮，加入溶液II 后的裂解及加入溶液III 后的中和是均匀彻底的，蛋白质的残留就应该在可以满足实验要求的水平；而只有溶液的用量足够，甚至过剩，才能确保裂解和中和是彻底的。

当然，试剂盒及苯酚的使用，是可以更进一步降低蛋白质的残留的。

降低质粒Nick 的方法
细菌收获时间，菌株的选择，抽提操作的剧烈程度是影响Nick 的三个主要因素。

细菌收获过早，质粒还在复制过程中，Nick 的比例较高；过晚，细菌开始死亡，杂质会比较多。

如果使用胞内酶含量很高的宿主菌，会出现较高比例的Nick。

加入溶液II 及加入溶液III 的混匀操作，也可以导致一些Nick，但影响不会比前两者大。

降低变性超螺旋的方法
理论上，用碱裂解法抽提质粒，变性超螺旋的出现是不可避免的。

之所以大家没有非常在意，一是因为它的存在似乎对酶反应没有任何影响，二是因为它的含量并不一定高到被用电泳观察到。

抽提使用相对过剩的溶液，在加入溶液II 后，体系能在1 分钟内变澄清，再快速加入溶液III，这样基本上能将变性超螺旋的出现控制在电泳看不见的水平。

(变性超螺旋电泳时比正常超螺旋跑得快一点点。

)
关于质粒多聚体
QIAGEN 提供了一个没有进一步解释的观察：从有些宿主菌中抽提质粒(pTZ19)，电泳能发现很多条带；但使用单酶切后，仍然变成一条带，大小正好是线性单质粒的大小。

根据这一观察，可以推理如下：那些大的条带(质粒多聚体)是由完整的单质粒“粘”在一起形成的，而不是我的一条链与你的一条链复性在一起；第二，这种“粘”只是部分的，否则酶切会有问题；第三，这种“粘”是脆弱的，线性后的刚性足以打破它。

如果是这样，质粒多聚体的出现与质粒的结构及序列有关，可以不管它(也管不了)，因为它不影响酶切，或者说，即使质粒多聚体切不动，也不会影响太大。

总之，碰到这种情况，不要简单地认为有问题，而是应该一步一步往下做，但一定要做完一步，检测一次，看一看结果与预期的吻合程度。

提高得率的方法
利用氯霉素抑制染色体的复制，而不抑制质粒的复制这一特点，在低拷贝质粒的培养过程中添加氯霉素可以大大提高得率。

为什么酶切后质粒总是降解？
酶切后质粒降解的原因很多，但如果用实验方法排除了质粒的质量及酶的质量因素后(用A 酶能成功，用B 酶失败，但B 酶能成功用于
其它质粒。

)，仍然不能解决此问题，就只能从质粒的构造上去找原因了。

为什么质粒抽提得率低？
伴随有RNA 污染：菌体过量、RNase A 失效。

起始菌体过量是导致抽提失败的最主要素。

菌体过量将导致的问题有：得率低(RNA 与质粒DNA 竞争吸附)，RNA 污染(RNase A 相对量不足，不能在规定时间内降解所有的RNA)，超螺旋比例低(菌体过量使溶液非常粘稠，为混匀溶液所需要的外力很容易破坏超螺旋)。

确保成功的关键是：如果从1.5 ml 菌液中抽提出来的质粒足够实验所需，绝对不要使用3.0 ml 起始菌液。

在实验操作过程中，下列现象提示菌体过量：
加入P2 混匀，静置2 分钟后，如果溶液没有变成透明，或者溶液看起来虽然已经变成透明，但转动离心管时发现溶液太粘稠或者不均匀。

加入P3 后，不能完全混匀，有大块物形成。

离心时很难使之离至管底。

没有RNA 污染：将上清移入吸附柱时，吸入了絮状蛋白质。

如果在步骤4“将上清移入吸附柱”操作中，吸入了絮状蛋白质，那么，离心时絮状蛋白质将覆盖在吸附膜的表面，离心时难将液体离下。

在加入T1 洗脱时，将发现T1 不能很快渗入吸附膜中，而是一直处在吸附膜表面。

此时用一个干净的吸嘴轻轻在吸附膜的表面来回划几次可以使T1 进入吸附膜中，这时可能出现两种情况：最终获得DNA，但伴随蛋白质的污染；仍然没有多少DNA。

蛋白质污染的可能后果是酶切时DNA 出现非特异降解。

质量低
基因组DNA 污染：可能的原因有三：加入P2 后室温放置时间超过4分钟、加入P2 和P3 后混匀动作不温和，菌体过量。

RNA 污染：菌体过量、RNase A 失效。

超螺旋比例太低：加入P2后室温放置时间超过5分钟、加入P2和P3后混匀动作不温和，宿主菌含内源核酶，菌体过量。

酶切产物弥散：抽提所得的质粒被蛋白质污染，内切酶被污染。

样品上柱后离心不下去
样品中有大量蛋白质污染。