DNA和RNA提取方法及原理 ppt课件
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• TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase • pH值为8.0，可防止DNA发生酸解
DNA和RNA提取方法及原理
➢ 提取的基因组DNA片段在20kb－30kb之间
➢高质量的基因组DNA带型 单一无拖尾现象 ➢DNA浓度及纯度的检测 A260=1 约 50 μg/ mL 双链DNA；
• “太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早……”
取方法 及原理
DNA是遗传信息的载体，是最重要的生物 信息分子，是分子生物学研究的主要对象。为 了进行测序、杂交和基因的表达，获得高分子 量和高纯度的DNA是非常重要的前提。
DNA和RNA提取 方法及原理
保证DNA结构的完整性 纯化后不应存在对酶有抑制作用的物质 排除有机溶剂和金属离子的污染 蛋白质、多糖、脂类等降低到最低程度 排除其他核酸分子的污染
DNA和RNA提取方法 及原理
染色体DNA的提取
➢ CTAB法 ➢ SDS法 ➢ 其它
DNA和RNA提取方法 及原理
非染色体DNA的提取
➢ 质粒DNA的提取 • 碱裂解法 • 煮沸法
➢ 线粒体、叶绿体DNA的提取 • 差速离心结合SDS裂解法
DNA和RNA提取方法及 原理
CTAB法原理（植物DNA提取经典方法）
DNA和RNA提取方法 及原理
基因组DNA的提取
质粒DNA的提取
➢ 材料应适量，过多会影响裂解， 导致DNA量少，纯度低
➢ 针对不同材料，选择适当的裂 解预处理方式：
• 植物材料－－液氮研磨 • 动物组织－－匀浆或液氮研磨 • 组培细胞－－蛋白酶K • 细菌－－溶菌酶破壁 • 酵母－－破壁酶或玻璃珠
DNA和RNA提取方法 及原理
多酚的去除：
➢ 在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：β-巯基乙醇、 抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等
➢ 加入易与酚类结合的试剂：如PVP、PEG(聚乙二醇)，它 们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与DNA的结合
盐离子的去除：
➢ 70％的乙醇洗涤
DNA和RNA提取方法 及原理
1. 尽量取新鲜材料，低温保存材料避 免反复冻融
2. 液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻 前加入裂解缓冲液
3. 在提取内源核酸酶含量丰富的材料 的DNA时，可增加裂解液中螯合剂 的含量，细胞裂解后的后续操作应 尽量轻柔
4. 所有试剂用无菌水配制，耗材经高 温灭菌
5. 将DNA分装保存于缓冲液中，避免 反复冻融
注：CTAB溶液在低于15℃ 时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的 植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。
DNA和RNA提取方法及原 理
CTAB提取缓冲液的经典配方
➢ Tris-HCl （pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏； ➢ EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性； ➢ NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中； ➢ CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离； ➢ β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除
3. 增加吸附的时间，或低温沉 淀
4. 小心操作
DNA和RNA提取方法及原理
第一部分：RNA提取方法简介 第二部分：RNA提取及常见问题分析
DNA和RNA提取方法及原理
➢ 分析不同发育时期基因的表达状况 ➢ 获得新基因 ➢ 研究基因的拼接 ➢ 分析相应的蛋白产物
DNA和RNA提取方法及原理
➢ 由于核糖残基的2’和3’位置带有羟基，RNA易 于被RNA酶切割水解
DNA和RNA提取方 法及原理
问题三：DNA提取量少。
原 因
1. 实验材料不佳或量少
2. 破壁或裂解不充分 对 策
3. 吸附或沉淀不完全
4. 洗涤时DNA丢失
1. 尽量选用新鲜（幼嫩）的材 料
2. 动植物要匀浆研磨充分；G＋ 菌、酵母裂解前先用生物酶 或机械方式破壁。高温裂解 时，时间适当延长（对于动 物细胞、细菌可增加PK的用法流程图 （以动物组织为例）
动物组织
抽提
离心洗涤
组织匀浆
上层溶液
干燥溶解
细胞裂解
酒精沉淀
DNA溶液
DNA和RNA提取方法及原理
根据细胞裂解方式的不同有：
➢ 物理方式：玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法 ➢ 化学方式：异硫氰酸胍法、碱裂解法 ➢ 生物方式：酶法
对数期菌体
上清液
沉淀
溶液I充分重悬
抽提
干燥溶解
溶液II裂解 溶液III中和
酒精沉淀 离心洗涤
质粒DNA溶液
DNA和RNA提取方法 及原理
煮沸法原理
➢ 染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分 子，而质粒DNA为共价闭合环状分子；
➢ 当加热处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共 价闭环的质粒DNA在冷却时即恢复其天然构象；
➢ 变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉 淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相 中，从而可通过离心将两者分开。
DNA和RNA提取方法及原理
线粒体和叶绿体是生物体内半自主性细胞器，自身可编码蛋 白，它们的比重和大小一定，因而在同一离心场内的沉降速度 也一定，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各 种组分分级分离出来。
差速离心法原理
➢ 是利用物质比重的不同分离混合物的一种方法。
➢ 将待分离物质置于均匀介质（蔗糖）中，以一定的转速进 行离心，比重大的物质优先沉降，比重小的却处于上层， 从而得以分离。
RNA提取 方法及原理
第一部分：DNA提取方法简介
第二部分：DNA提取及常见问题分析
DNA和RNA提取方法 及原理
➢ CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基 溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合 物。
➢ 该复合物在高盐溶液中（>0.7mol/L NaCl）是可溶的，通过有机溶剂 抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离 出来。
➢ RNA酶含量丰富，加热后仍能够正确折叠恢复 活性，不易失活
DNA和RNA提取方法及原理
➢ 经常更换新手套。因为皮肤和实验室用品上可能有 RNase，会导致RNase污染。
➢ 使用灭过菌的塑料制品和枪头避免交叉污染。 ➢ 应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在
150℃烘烤4小时，塑料器皿可在0.5M NaOH中浸泡10 分钟，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除RNase。
CTAB提取缓冲液的改进配方
➢ PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合
物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合， 有效去除多糖。
DNA和RNA提取方法及原 理
CTAB法流程图
植物材料
裂解液
酒精沉淀
液氮研磨
抽提
离心洗涤
DNA溶液
细胞裂解
上层溶液
干燥溶解
基因组DNA的提取
质粒DNA的提取
➢ 当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀， 沉淀会更充分
➢ 沉淀时加入1/10体积的NaOAc（pH5.2，3M），有 利于充分沉淀
➢ 沉淀后应用70％的乙醇洗涤，以除去盐离子等
➢ 晾干DNA，让乙醇充分挥发（不要过分干燥）
➢ 若长期储存建议使用TE缓冲液溶解
➢ 组培细胞培养时间不能过长， 否则会造成DNA降解
➢ 含病毒的液体材料DNA含量较 少，提取前先富集
➢ 使用处于对数期的新鲜菌体 （老化菌体导致开环质粒增加）
➢ 培养时应加入筛选压力，否则 菌体易污染，质粒易丢失
➢ 尽量选择高拷贝的质粒，如为 低拷贝或大质粒，则应加大菌 体用量
➢ 菌株不要频繁转接（质粒丢失）
➢ 浓盐法：
利用RNP和DNP在盐溶液中溶解度不同，将二者分离
➢ 有机溶剂抽提法：
有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用
➢ 密度梯度离心法：
利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物
DNA和RNA提取方法 及原理
碱裂解法原理
➢ 染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分 子，而质粒DNA为共价闭合环状分子；
➢ 当用碱处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共 价闭环的质粒DNA在回到中性pH时即恢复其天然构象；
➢ 变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉 淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相 中，从而可通过离心将两者分开。
DNA和RNA提取方法 及原理
碱裂解法流程图
DNA和RNA提取方法及原理
DNA和RNA提取方法及原理
第一部分：DNA提取方法简介 第二部分：DNA提取常见问题分析及对策
精品资料
• 你怎么称呼老师？
• 如果老师最后没有总结一节课的重点的难点，你 是否会认为老师的教学方法需要改进？
• 你所经历的课堂，是讲座式还是讨论式？ • 教师的教鞭
• “不怕太阳晒，也不怕那风雨狂，只怕先生骂我 笨，没有学问无颜见爹娘 ……”
A260/280 约为1.8
DNA和RNA提取方 法及原理
问题一：DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应。
原因
1. DNA中含有蛋白、多
糖、多酚类杂质
2. DNA在溶解前，有酒 精残留，酒精抑制
对
后续酶解反应
策
3. DNA中残留有金属离
子
4. 有RNA的存留
1. 重新纯化DNA，过吸附 柱去除蛋白、多糖、 多酚等杂质
DNA和RNA提取方法及原 理
SDS法原理
➢ SDS是一种阴离子去垢剂，在高温（55～65℃）条件下能裂解细 胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；
➢ 提高盐(KAc或NH4Ac)浓度并降低温度（冰浴），使蛋白质及多糖 杂质沉淀，离心后除去沉淀；
➢ 上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的 DNA。
I.材料准备
II.破碎细胞或包膜－内容物释放 III.核酸分离、纯化
IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质
V.核酸溶解在适量缓冲液或水中
DNA和RNA提取方法 及原理
基因组DNA的提取
质粒DNA的提取
➢ 最好使用新鲜材料，低温保 存的样品材料不要反复冻融
➢ 提取血液基因组DNA时，要 选择有核细胞（白细胞）
➢ 高温温浴时，定时轻柔振荡
➢ 菌体量适当
➢ 培养基去除干净，同时保证菌 体在悬浮液中充分悬浮
➢ 变性的时间不要过长（5分钟）， 否则质粒易被打断
➢ 复性时间也不宜过长，否则会 有基因组DNA的污染
➢ G＋菌、酵母质粒的提取，应先 用酶法或机械法处理，以破壁
DNA和RNA提取方法 及原理
基因组DNA的提取
DNA和RNA提取方法及原理
根据核酸分离纯化方式的不同有：
➢ 吸附材料结合法：
• 硅质材料
高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值洗脱。 快捷高效。
• 阴离子交换树脂 低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。
适用于纯度要求高的实验。
• 磁珠
磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的 物，从而达到分离目的。
DNA和RNA提取方法及原理
质粒DNA的提取
➢ 采用吸附材料吸附的方式分离DNA时，应提 供相应的缓冲体系
➢ 采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，但 动作要轻柔
➢ 离心分离两相时，应保证一定的转速和时间
➢ 针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相 应的去杂质的方法
DNA和RNA提取方法 及原理
蛋白质的去除：
➢ 酚/氯仿抽提 ➢ 使用变性剂变性（SDS、异硫氰酸胍等） ➢ 高盐洗涤 ➢ 蛋白酶处理
DNA和RNA提取方法及原理
➢ 焦磷酸二乙酯（DEPC）： 与RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结 合使蛋白质变性，强烈但不彻底的RNA酶抑制剂 。
➢ 异硫氰酸胍：目前是最有效的RNA酶抑制剂，裂解组织的同时也使 RNA酶失活。既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对 RNA酶有强烈的变性作用。
2. 重新沉淀DNA，让酒精 充分挥发
3. 增加70％乙醇洗涤的 次数（2-3次）
4. 加入RNase降解RNA
DNA和RNA提取方 法及原理
问题二：DNA降解。
原 因
1. 材料不新鲜或反复冻
融
2. 未很好抑制内源核酸
酶的活性
对
3. 提取过程操作过于剧 策
烈，DNA被机械打断
4. 外源核酸酶污染
5. 反复冻融
DNA和RNA提取方法 及原理
多糖的去除：
➢ 高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体 积的5M NaCl，高盐可溶解多糖。
➢ 用多糖水解酶将多糖降解。
➢ 在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积)，氯苯可 以与多糖的羟基作用，从而去除多糖 。
➢ 用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500μL DNA液中加入 200μl 20% PEG8000 (含1.2 M NaCl) ，冰浴20min。
DNA和RNA提取方法及原理
➢ 提取的基因组DNA片段在20kb－30kb之间
➢高质量的基因组DNA带型 单一无拖尾现象 ➢DNA浓度及纯度的检测 A260=1 约 50 μg/ mL 双链DNA；
• “太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早……”
取方法 及原理
DNA是遗传信息的载体，是最重要的生物 信息分子，是分子生物学研究的主要对象。为 了进行测序、杂交和基因的表达，获得高分子 量和高纯度的DNA是非常重要的前提。
DNA和RNA提取 方法及原理
保证DNA结构的完整性 纯化后不应存在对酶有抑制作用的物质 排除有机溶剂和金属离子的污染 蛋白质、多糖、脂类等降低到最低程度 排除其他核酸分子的污染
DNA和RNA提取方法 及原理
染色体DNA的提取
➢ CTAB法 ➢ SDS法 ➢ 其它
DNA和RNA提取方法 及原理
非染色体DNA的提取
➢ 质粒DNA的提取 • 碱裂解法 • 煮沸法
➢ 线粒体、叶绿体DNA的提取 • 差速离心结合SDS裂解法
DNA和RNA提取方法及 原理
CTAB法原理（植物DNA提取经典方法）
DNA和RNA提取方法 及原理
基因组DNA的提取
质粒DNA的提取
➢ 材料应适量，过多会影响裂解， 导致DNA量少，纯度低
➢ 针对不同材料，选择适当的裂 解预处理方式：
• 植物材料－－液氮研磨 • 动物组织－－匀浆或液氮研磨 • 组培细胞－－蛋白酶K • 细菌－－溶菌酶破壁 • 酵母－－破壁酶或玻璃珠
DNA和RNA提取方法 及原理
多酚的去除：
➢ 在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：β-巯基乙醇、 抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等
➢ 加入易与酚类结合的试剂：如PVP、PEG(聚乙二醇)，它 们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与DNA的结合
盐离子的去除：
➢ 70％的乙醇洗涤
DNA和RNA提取方法 及原理
1. 尽量取新鲜材料，低温保存材料避 免反复冻融
2. 液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻 前加入裂解缓冲液
3. 在提取内源核酸酶含量丰富的材料 的DNA时，可增加裂解液中螯合剂 的含量，细胞裂解后的后续操作应 尽量轻柔
4. 所有试剂用无菌水配制，耗材经高 温灭菌
5. 将DNA分装保存于缓冲液中，避免 反复冻融
注：CTAB溶液在低于15℃ 时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的 植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。
DNA和RNA提取方法及原 理
CTAB提取缓冲液的经典配方
➢ Tris-HCl （pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏； ➢ EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性； ➢ NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中； ➢ CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离； ➢ β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除
3. 增加吸附的时间，或低温沉 淀
4. 小心操作
DNA和RNA提取方法及原理
第一部分：RNA提取方法简介 第二部分：RNA提取及常见问题分析
DNA和RNA提取方法及原理
➢ 分析不同发育时期基因的表达状况 ➢ 获得新基因 ➢ 研究基因的拼接 ➢ 分析相应的蛋白产物
DNA和RNA提取方法及原理
➢ 由于核糖残基的2’和3’位置带有羟基，RNA易 于被RNA酶切割水解
DNA和RNA提取方 法及原理
问题三：DNA提取量少。
原 因
1. 实验材料不佳或量少
2. 破壁或裂解不充分 对 策
3. 吸附或沉淀不完全
4. 洗涤时DNA丢失
1. 尽量选用新鲜（幼嫩）的材 料
2. 动植物要匀浆研磨充分；G＋ 菌、酵母裂解前先用生物酶 或机械方式破壁。高温裂解 时，时间适当延长（对于动 物细胞、细菌可增加PK的用法流程图 （以动物组织为例）
动物组织
抽提
离心洗涤
组织匀浆
上层溶液
干燥溶解
细胞裂解
酒精沉淀
DNA溶液
DNA和RNA提取方法及原理
根据细胞裂解方式的不同有：
➢ 物理方式：玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法 ➢ 化学方式：异硫氰酸胍法、碱裂解法 ➢ 生物方式：酶法
对数期菌体
上清液
沉淀
溶液I充分重悬
抽提
干燥溶解
溶液II裂解 溶液III中和
酒精沉淀 离心洗涤
质粒DNA溶液
DNA和RNA提取方法 及原理
煮沸法原理
➢ 染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分 子，而质粒DNA为共价闭合环状分子；
➢ 当加热处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共 价闭环的质粒DNA在冷却时即恢复其天然构象；
➢ 变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉 淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相 中，从而可通过离心将两者分开。
DNA和RNA提取方法及原理
线粒体和叶绿体是生物体内半自主性细胞器，自身可编码蛋 白，它们的比重和大小一定，因而在同一离心场内的沉降速度 也一定，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各 种组分分级分离出来。
差速离心法原理
➢ 是利用物质比重的不同分离混合物的一种方法。
➢ 将待分离物质置于均匀介质（蔗糖）中，以一定的转速进 行离心，比重大的物质优先沉降，比重小的却处于上层， 从而得以分离。
RNA提取 方法及原理
第一部分：DNA提取方法简介
第二部分：DNA提取及常见问题分析
DNA和RNA提取方法 及原理
➢ CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基 溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合 物。
➢ 该复合物在高盐溶液中（>0.7mol/L NaCl）是可溶的，通过有机溶剂 抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离 出来。
➢ RNA酶含量丰富，加热后仍能够正确折叠恢复 活性，不易失活
DNA和RNA提取方法及原理
➢ 经常更换新手套。因为皮肤和实验室用品上可能有 RNase，会导致RNase污染。
➢ 使用灭过菌的塑料制品和枪头避免交叉污染。 ➢ 应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在
150℃烘烤4小时，塑料器皿可在0.5M NaOH中浸泡10 分钟，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除RNase。
CTAB提取缓冲液的改进配方
➢ PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合
物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合， 有效去除多糖。
DNA和RNA提取方法及原 理
CTAB法流程图
植物材料
裂解液
酒精沉淀
液氮研磨
抽提
离心洗涤
DNA溶液
细胞裂解
上层溶液
干燥溶解
基因组DNA的提取
质粒DNA的提取
➢ 当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀， 沉淀会更充分
➢ 沉淀时加入1/10体积的NaOAc（pH5.2，3M），有 利于充分沉淀
➢ 沉淀后应用70％的乙醇洗涤，以除去盐离子等
➢ 晾干DNA，让乙醇充分挥发（不要过分干燥）
➢ 若长期储存建议使用TE缓冲液溶解
➢ 组培细胞培养时间不能过长， 否则会造成DNA降解
➢ 含病毒的液体材料DNA含量较 少，提取前先富集
➢ 使用处于对数期的新鲜菌体 （老化菌体导致开环质粒增加）
➢ 培养时应加入筛选压力，否则 菌体易污染，质粒易丢失
➢ 尽量选择高拷贝的质粒，如为 低拷贝或大质粒，则应加大菌 体用量
➢ 菌株不要频繁转接（质粒丢失）
➢ 浓盐法：
利用RNP和DNP在盐溶液中溶解度不同，将二者分离
➢ 有机溶剂抽提法：
有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用
➢ 密度梯度离心法：
利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物
DNA和RNA提取方法 及原理
碱裂解法原理
➢ 染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分 子，而质粒DNA为共价闭合环状分子；
➢ 当用碱处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共 价闭环的质粒DNA在回到中性pH时即恢复其天然构象；
➢ 变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉 淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相 中，从而可通过离心将两者分开。
DNA和RNA提取方法 及原理
碱裂解法流程图
DNA和RNA提取方法及原理
DNA和RNA提取方法及原理
第一部分：DNA提取方法简介 第二部分：DNA提取常见问题分析及对策
精品资料
• 你怎么称呼老师？
• 如果老师最后没有总结一节课的重点的难点，你 是否会认为老师的教学方法需要改进？
• 你所经历的课堂，是讲座式还是讨论式？ • 教师的教鞭
• “不怕太阳晒，也不怕那风雨狂，只怕先生骂我 笨，没有学问无颜见爹娘 ……”
A260/280 约为1.8
DNA和RNA提取方 法及原理
问题一：DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应。
原因
1. DNA中含有蛋白、多
糖、多酚类杂质
2. DNA在溶解前，有酒 精残留，酒精抑制
对
后续酶解反应
策
3. DNA中残留有金属离
子
4. 有RNA的存留
1. 重新纯化DNA，过吸附 柱去除蛋白、多糖、 多酚等杂质
DNA和RNA提取方法及原 理
SDS法原理
➢ SDS是一种阴离子去垢剂，在高温（55～65℃）条件下能裂解细 胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；
➢ 提高盐(KAc或NH4Ac)浓度并降低温度（冰浴），使蛋白质及多糖 杂质沉淀，离心后除去沉淀；
➢ 上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的 DNA。
I.材料准备
II.破碎细胞或包膜－内容物释放 III.核酸分离、纯化
IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质
V.核酸溶解在适量缓冲液或水中
DNA和RNA提取方法 及原理
基因组DNA的提取
质粒DNA的提取
➢ 最好使用新鲜材料，低温保 存的样品材料不要反复冻融
➢ 提取血液基因组DNA时，要 选择有核细胞（白细胞）
➢ 高温温浴时，定时轻柔振荡
➢ 菌体量适当
➢ 培养基去除干净，同时保证菌 体在悬浮液中充分悬浮
➢ 变性的时间不要过长（5分钟）， 否则质粒易被打断
➢ 复性时间也不宜过长，否则会 有基因组DNA的污染
➢ G＋菌、酵母质粒的提取，应先 用酶法或机械法处理，以破壁
DNA和RNA提取方法 及原理
基因组DNA的提取
DNA和RNA提取方法及原理
根据核酸分离纯化方式的不同有：
➢ 吸附材料结合法：
• 硅质材料
高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值洗脱。 快捷高效。
• 阴离子交换树脂 低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。
适用于纯度要求高的实验。
• 磁珠
磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的 物，从而达到分离目的。
DNA和RNA提取方法及原理
质粒DNA的提取
➢ 采用吸附材料吸附的方式分离DNA时，应提 供相应的缓冲体系
➢ 采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，但 动作要轻柔
➢ 离心分离两相时，应保证一定的转速和时间
➢ 针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相 应的去杂质的方法
DNA和RNA提取方法 及原理
蛋白质的去除：
➢ 酚/氯仿抽提 ➢ 使用变性剂变性（SDS、异硫氰酸胍等） ➢ 高盐洗涤 ➢ 蛋白酶处理
DNA和RNA提取方法及原理
➢ 焦磷酸二乙酯（DEPC）： 与RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结 合使蛋白质变性，强烈但不彻底的RNA酶抑制剂 。
➢ 异硫氰酸胍：目前是最有效的RNA酶抑制剂，裂解组织的同时也使 RNA酶失活。既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对 RNA酶有强烈的变性作用。
2. 重新沉淀DNA，让酒精 充分挥发
3. 增加70％乙醇洗涤的 次数（2-3次）
4. 加入RNase降解RNA
DNA和RNA提取方 法及原理
问题二：DNA降解。
原 因
1. 材料不新鲜或反复冻
融
2. 未很好抑制内源核酸
酶的活性
对
3. 提取过程操作过于剧 策
烈，DNA被机械打断
4. 外源核酸酶污染
5. 反复冻融
DNA和RNA提取方法 及原理
多糖的去除：
➢ 高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体 积的5M NaCl，高盐可溶解多糖。
➢ 用多糖水解酶将多糖降解。
➢ 在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积)，氯苯可 以与多糖的羟基作用，从而去除多糖 。
➢ 用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500μL DNA液中加入 200μl 20% PEG8000 (含1.2 M NaCl) ，冰浴20min。