猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因的克隆、表达与免疫印迹

新疆农业大学学报 2008,31(4):83~86
Journal of Xinj iang Agricultural U niversity
文章编号:1007 8614(2008)04 0083 04
猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因的
克隆、表达与免疫印迹
刘 焕1,2,冉多良1,王一成2,袁秀芳2,徐丽华2
(1.新疆农业大学动物医学学院,乌鲁木齐 830025; 2.浙江省农业科学院畜牧兽医研究所,杭州 320021)
摘 要: 将猪繁殖与呼吸综合征病毒O RF5基因克隆入原核表达载体pET 28a(+)的多克隆位点中,经鉴定后得到重组质粒pET O RF5,将此重组质粒分别转化到受体菌E.coli BL21(DE3)中,并用诱导剂I PT G进行诱导表达, 2h后表达达到高峰。

经15%SDS P AG E电泳检测,表达得到的蛋白大小约为13.75kD。

经W est ern Blott ing分析,表达蛋白能与P RRSV阳性猪血清发生特异性反应,而与阴性血清不反应,具有较好的免疫原性,为研究PRRSV亚单位疫苗奠定了基础。

关键词: 猪繁殖与呼吸综合征病毒;OR F5;克隆;表达
中图分类号:Q786 文献标识码:A
Cloning,Expression and Immunity Blot of ORF5of PRRSV LIU H uan1,2,RAN Duo liang1,WAN G Yi cheng2,YU AN Xiu fang2,XU Li hua2
(1.Co lleg e of Animal M edicine,Xinjiang Agricultural University,U rumqi830025;2.Zhejiang A
cademy of Ag ricultural Sciences,H angzho u320021)
Abstract: T he ORF5g ene of PRRSV w as amplified by PCR w ith a size of375bp.The amplified DNA frag ment w as cloned into pM D18 T,and sequenced.T he result of sequencing show ed that the consistency w as98%compared w ith that of standard strains.Inserted in pET 28a(+),and transform ed in Escher ichia coli BL21(DE3),the frag ment w as ex pressed after induced w ith IPT G.The results of SDS PA GE and Wester n Blotting show ed that the protein w as13.75kD in size and specifically reacted w ith PRRSV posi tive sera from pigs,not neg ative sera.T hese r esults become the base o f researching and producing no vel vaccine and developing effectiv e diagnostic method.
Key words: PRRSV;ORF5;cloning;ex pr ession
猪繁殖与呼吸综合征(Por cine r eproductive and respiratory sy ndrome,PRRS)以母猪繁殖障碍、仔猪的呼吸道症状和高死亡率为特征,特别是感染本病后容易导致免疫抑制而继发其他疾病[1,2]。

PRRSV的ORF5基因编码的糖基化的囊膜蛋白(gp5蛋白)具有较好的免疫原性,能够诱导产生中和抗体,且中和抗体出现之后,抗血清主要识别PRRSV的g p5蛋白。

此外,gp5蛋白还具有诱导细胞凋亡[3]、参与病毒粒子结合病毒受体的过程[4]等作用。

因此,gp5蛋白在PRRSV的致病性、诊断、预防与控制等方面具有重要意义,是研制基因工程疫苗的最有力的候选基因[7]。

本研究对PRRSV从T ORF5基因中扩增出去除信号肽和3个跨膜区的ORF5基因进行了克隆表达,以期获得具有免疫活性的g p5蛋白,为研究PRRSV亚单位疫苗奠定了基础。

1 材料与方法
1.1 质粒和菌株
原核表达载体pET 28a(+)由浙江大学动物科
收稿日期:2007-12-24
通讯作者:冉多良,E mail:x jrdl7@
新 疆 农 业 大 学 学 报2008年
学学院余旭平副教授惠赠。

受体菌E.coli BL21 (DE3)由浙江省农业科学院病毒与生物技术研究所郑滔副研究员惠赠。

猪繁殖与呼吸综合症病毒由本实验室分离并保存。

1.2 工具酶及主要试剂
限制性内切酶Nco ,EcoR ,T4连接酶, Taq DNA聚合酶购于上海生工;100bp DNA Marker,低分子量标准蛋白M ar ker,胶回收试剂盒(Lot0307)购于上海申能博彩生物科技有限公司;
0.45 m硝酸纤维素薄膜购于Pall Co rpor ation;冻干酶联葡萄球菌A蛋白纯品购自Chlbiochem。

1.3 引物设计
据GenBank的gp5基因全基因序列,设计并合成了两对特异性引物,从T ORF5基因中扩增出去除信号肽和3个跨膜区的ORF5基因,且分别在P1与P4引物加上N co 和EcoR 酶切位点:
P1:5 GGTCCATGGACAGCAT CA ACA GC CCT C 3
P2:5 CGCGTAGATGCTACTCAGAACTCTAG GAGGAGGAGGCCAGTCAAATTCACCAG 3
P3:5 TAGCAT CATCGCGGGATCTGGATCTT GCATGT CCTGGCGCTACTC 3
P4:3 CTTGTTACCCCAGCAGAGGTAGTAG TAGTAGTAGTAATTCTTAAGAAT 5
P1为ORF5基因5端去掉其信号肽后的起始22个碱基序列,5端含Nco 酶切位点,并以酶切位点中的AT G为起始密码子;P2的3端为ORF5基因N端膜外区的17个碱基,5端为C端膜外区的13个碱基,中间为柔性氨基酸连接肽的编码序列。

P3含ORF5基因C端膜外区的13个碱基,3端为编码膜内区的20个碱基,中间为4个柔性氨基酸连接肽的碱基序列,其中P2的5端13个碱基与P3的5端13个碱基反向互补,为重叠引物互补序列。

P4为ORF5C端13个碱基,后接6个组氨酸尾巴以及EcoR 酶切位点和终止密码子。

linker序列:linker为一编码柔性氨基酸的碱基序列,且尽量选用大肠杆菌偏爱的密码子。

该引物委托上海英俊生物技术有限公司合成。

1.4 病毒RNA的提取及基因的扩增
从浙江株PRRSV弱毒疫苗中提取病毒RNA, RT PCR扩增出ORF5基因全序列。

并以该序列为模板,P1、P2为引物扩增删除N端跨膜区的部分, P3、P4为引物扩增删除C端双跨膜区的部分,最后P1、P4为引物连接两个部分。

1.5 PC R产物扩增及鉴定
在PCR反应管中加入5 L10!buffer,4 L 2.5mol/L dNT P,上下游引物各2 L,模板DNA 5 L,加灭菌H2O至50 L。

PCR反应条件95∀, 5min;94∀变性30s,55∀,30s,72∀延伸1min, 30个循环,最后一个循环后再延伸10min。

PCR 完成后,将PCR产物用胶回收试剂盒纯化。

1.6 原核表达载体的构建和表达
将g p5片段,LTb g p5p片断和原核表达载体pET 28a(+)用EcoR 和Nco 双酶切,37∀作用4h,经胶回收试剂盒纯化。

然后16∀连接10h,并转化入受体菌E.coli BL21 DL3中,取得单菌落,提取质粒DNA,经双酶切鉴定后,将阳性克隆接种于LB液体培养基(含50 g/m L卡那霉素), 0.1m ol/L IPTG诱导表达4h,收集菌体,经15% SDS PAGE电泳检测表达蛋白。

1.7 表达蛋白的纯化
表达蛋白的纯化按照文献[10]操作。

以溶菌酶和去氧胆酸盐裂解细菌,DNA酶降解细菌释放出DNA,离心取沉淀,将沉淀用2%NP 40洗涤1次,再用6mol/L盐酸胍裂解,离心取上清,经H is.Bind 树脂进行初步纯化:在Ni柱中加入1m L的细菌裂解物,室温作用30min期间不断振摇,使N i NTA 充分与表达蛋白结合。

用pH值6.3的8mol/L尿素洗涤2次,用pH值4.0的洗脱1次。

收集上清及洗脱液,经15%SDS PAGE电泳检测纯化结果。

1.8 免疫转印
按照文献[10]方法利用Western技术检测表达产物的免疫反应原性。

将PAGE电泳胶及相同大小的硝酸纤维膜和滤纸按顺序放入转移电泳槽, 80mA电泳3h,取出转移膜,放入5%的脱脂奶粉(PBS)中4∀封闭过夜,0.01mo l/L的PBS洗3次,1#100稀释的血清(PBS)37∀作用1h,洗涤3次,1#10000稀释的SPA,37∀作用1h,再洗涤3次,加DAB显色。

2 结果
2.1 gp5基因的扩增及T 载体的克隆
PCR扩增的g p5基因片段为375bp(图1);T 载体克隆的酶切结果正确(图2)。

2.2 gp5基因序列测定
将测序结果放在DNAStar中分析,与Gen Bank上公布的序列比较,同源性为98%。

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第4期刘 焕,等:猪繁殖与呼吸综合征病毒OR F5基因的克隆、表达与免
疫印迹
1.O RF5基因P CR 产物;M.M ar ker 1,
2.pET O RF5基因;M.M ar ker 图1 ORF 5基因片段PCR 扩增结果图2 T 载体克隆的双酶切鉴定
Fig.1 PC R products of ORF 5gene
Fig .2 Identif ication of double restriction enzyme cloned
by T vehicle
2.3 pET gp 5基因的克隆及鉴定
将PCR 产物提纯后,克隆入pET 28a(+),随机挑取单菌落,小量法提取质粒,PCR 扩增,筛选阳性克隆。

选取阳性转化子,用EcoR 和N co 双酶切验证,电泳后可见一条约5600bp 的表达载体pET 28a(+)条带和一条约375bp 目的带(图3)。

2.4 gp 5基因表达、纯化及鉴定
将pET gp5重组菌IPTG 诱导表达2h 后,经15%SDS PAGE 电泳,表达出的融合蛋白的相对分子量为13.75kD 左右(图4),用H is.Bind 树脂进行初步纯化(图5)。

表达蛋白经电转移后,可被PRRSV 阳性血清识别(图6)。

1,2.pET ORF 5;M.100bp DN A Ladder Plus 1,3.pET O RF 5/BL 21诱导前;2,4.pET OR F5/BL 21诱导后; 5.pET /BL 21诱导后
图3 Nco 和E coR 双酶切结果
图4 表达菌体总蛋白的SDS P AG E 分析Fig.3 Double restriction enzym e results from Nco and
EcoR
Fig .4 Analysis of SDS PAGE expressing total protein in
the
thalline
1.结合上清;
2.洗涤上清;
3.洗脱液;M.蛋白M ar ker
1,2.纯化g p5蛋白;3.阴性对照
图5 重组蛋白纯化SDS PAGE 检测
图6 重组蛋白的Western blotting 检测
Fig.5 Examination of the purif ied protein recombination
by SDS PAGE
Fig .6
Examination of the recombination protein by Western blotting
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3 讨论
笔者曾经对gp5蛋白的全基因进行了表达,结果未获得表达蛋白,该蛋白5端含有一段31个氨基酸疏水性信号肽序列及3个跨膜功能区,分别位于62~83,90~106,113~130位氨基酸。

这些区域可以使翻译的gp5蛋白停留在内质网(ER)内,从而抑制gp5蛋白的表达[9]。

笔者又尝试删除蛋白信号肽序列进行克隆表达,表达量太低而不利于以后的研究。

谷红等也曾将gp5信号肽删除后在pET原核表达系统中表达gp5蛋白,但结果表明g p5蛋白难以获得表达[10]。

分析结果,3段跨膜区对gp5蛋白表达的影响很大,所以又继续删除其3个跨膜区进行克隆表达,在pET系统中获得了表达,并且表达量有了很大提高。

表达蛋白能够被PRRSV阳性血清识别,说明删除信号肽和跨膜区对蛋白的免疫原性影响不大。

蛋白之间加入柔性连接肽linker可以有效地保持两端蛋白质的构型,能够更好地发挥各自的功能。

所以在删除的跨膜区的位置用柔性氨基酸(Gly4Ser)和(GlySerGlySer)分别连接gp5蛋白的3段膜外区,获得了预想的结果。

本研究采用pET表达系统成功表达了PRRSV g p5蛋白。

在融合蛋白中人为加入6个组氨酸位点,由于6个组氨酸具有同金属离子专一结合的特性,故可采用金属离子胶亲和层析方法来简化重组蛋白的纯化步骤。

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