免疫共沉淀详细操作方法

免疫共沉淀详细操作方法
一、准备实验材料和试剂
1.细胞培养基和细胞培养酶：根据实验需要选择不同种类的培养基和酶。

2.细胞系：选择适当的细胞系，如HEK293T细胞等。

3.抗体：选择特异性强、亲和力高的单克隆或多克隆抗体。

4. 蛋白提取缓冲液：例如，含10 mM Tris-HCl（pH 7.4）、150 mM NaCl、1 mM EDTA、1 mM EGTA、1% Triton X-100、0.5% NP-40等。

5.磷酸盐缓冲液：例如，PBS（含1.5mMKH2PO4、
6.5mMNa2HPO4、
137mMNaCl、2.7mMKCl，pH7.4）。

6. 免疫共沉淀缓冲液：例如，含50 mM Tris-HCl（pH
7.4）、150 mM NaCl、1 mM EDTA、1 mM EGTA、0.5% NP-40、5%甘油。

7.带有亲和树脂的免疫沉淀缓冲液：例如，蛋白A或蛋白G亲和树脂结合的PBS。

二、细胞处理和蛋白质提取
1.培养细胞：将细胞培养在合适的培养基中，并在37℃、5%CO2的培养箱中培养至适当的细胞数。

2.细胞刺激：根据实验需要，将细胞进行刺激处理，如药物刺激、细胞因子刺激等。

3.细胞裂解：将培养的细胞用蛋白提取缓冲液裂解，放在冰上离心，使细胞溶解并得到细胞裂解液。

4.蛋白质含量测定：使用BCA或其他合适的方法测定细胞裂解液中蛋白质的含量。

三、制备免疫复合物
1.免疫数据：将所需的抗体预先装载到蛋白A或蛋白G亲和树脂上。

2.预清洗亲和树脂：将亲和树脂与免疫共沉淀缓冲液混合，使其均匀混合，然后以适当的速度离心，去除上清液。

3.免疫共沉淀：将适当量的蛋白质样品加入预清洗的亲和树脂和免疫共沉淀缓冲液中，使其充分混合，并以适当的速度旋转培养，使抗体与目标蛋白结合形成免疫复合物。

4.温和洗涤：使用免疫共沉淀缓冲液轻轻洗涤免疫复合物，以去除非特异性结合的蛋白质。

四、蛋白质沉淀
1.洗涤亲和树脂：使用洗涤缓冲液多次洗涤亲和树脂，以去除非特异性结合的蛋白质。

2. 洗涤缓冲液：例如，含50 mM Tris-HCl（pH 7.4）、150 mM NaCl、1 mM EDTA、0.1% Triton X-100。

3.蛋白质沉淀：使用洗涤缓冲液沉淀免疫共沉淀的蛋白质，离心并去除上清液。

4.洗涤过程：对于高亲和性复合物，重复洗涤步骤2~3多次，以去除任何非特异性结合。

五、热解和电泳
1.终止反应：加入SDS-样本缓冲液，对样品进行热解，以终止免疫复合物结合。

2. 电泳：将样品加载到预制的SDS-凝胶孔中，进行电泳分离。

根据实验需要，可以使用蛋白印迹（Western blotting）或其他方法检测目标蛋白的存在和相互作用。

六、结果分析
1. Western blotting：将分离的蛋白印迹到薄膜上，使用特异性的抗体检测目标蛋白的存在。

检测方法可以使用化学发光或荧光法等
2. 结果解读：根据Western blotting结果解读免疫共沉淀实验的结果，判断目标蛋白是否与其他蛋白质发生相互作用。