生物技术在的果树研究中的应用

·专题综述·北方园艺2008(4):82～84
第一作者简介:张晓玉(19792),女,河北省人,研究实习员,主要从事果树栽培及生物育种技术研究工作。

收稿日期:2007-10-17
生物技术在果树研究中的应用
张晓玉,杨丽芳,胡忠惠,李树海,赵宪争
(天津市林业果树研究所,天津300161)
摘　要:现代生物技术近些年来发展速度及其迅猛,显示了其巨大的潜力,尤其在果树上的
研究进展很快,它不仅可以定向改良果树遗传性状,而且扩展了育种范围,提高了育种效率。

现从微繁技术、单倍体技术、胚培养技术、原生质体培养技术及分子生物技术的优点和应用原理以及在果树上的进展方面作了简要概述。

关键词:生物技术;基因转化;果树中图分类号:S 66.03.6　文献标识码:A 文章编号:1001-0009(2008)04-0082-03
生物技术是以生命科学为基础,利用生物体系和工
程原理生产生物制品和创造新物种的综合性科学技术。

1973年发明的DNA 重组技术标志着现代生物技术的诞生。

现代生物技术包括众多领域,通常包括细胞工程、基因工程、酶工程和发酵工程四大领域。

此外,还有一些相对新的领域,例如:染色体工程、蛋白质工程、生化工程等[1]。

生物技术还可依研究材料的不同分为植物生物技术、动物生物技术和微生物生物技术。

这里探讨的是生物技术在果树方面的应用研究。

果树栽培历史悠久,长期以来,人们靠营养繁殖来保持遗传的相对稳定。

靠引种、选优、实生选种、杂交选种、芽变等手段来改良树种。

但果树生命周期长,遗传性高度杂合,自交大多不孕,给育种工作造成了许多困难。

现代生物技术的兴起,给果树育种开辟了全新的道路,突破了长期得不到解决的技术难点,显示了其巨大的生命力。

1　微繁殖(Micropropagation )技术的应用
所谓微繁殖技术,即以植物的器官、组织、细胞或原生质体为外植体,在离体培养条件下进行植株再生的技术。

应用微繁殖技术既可用于克服高度杂合物种因有性繁殖而引起的后代严重分离,如澳大利亚的番木瓜[2];又可用于名优树种或濒危树种的快速繁殖,如凤梨[3]、草莓[4]。

通过微繁殖技术已获再生植株的树种主要有番荔枝、番木瓜、柑桔、龙眼、荔枝、苹果、梨、葡萄等,草莓、香蕉等已实现了商品化生产。

此外,微繁殖技术为种质的保存提供了新方法。

很多种质资源在离体培养条件下,通过减缓生长和低温处理而达到长期保存目的,并可进行不同国家、地区间的种质资源收集、互换、
保存和应用,即建立“基因银行”
(gene bank ),实现种质资源的全球共享。

例如,在比利时的Catholic University 的Leuven 研究中心有大量离体保存香蕉的种质库。

2　单倍体(Haploid )技术的应用
单倍体育种和相关研究在农业和园艺植物中得到了广泛的应用。

单倍体有利于突变的检测和抗性细胞系的筛选,并且大大缩短了育种的时间。

此外单倍体在基因图谱、基因转移研究中同样具有重要作用。

自然形成的单倍体是极少见的,并且仅限于几种植物。

现已取得成功的果树树种主要有番荔枝、番木瓜、4个柑桔品种、龙眼、苹果、梨、葡萄等。

薛光荣等[5]对东方草莓(四倍体)的单核期花粉进行培养,成功地诱导出单倍体植株。

花药培养是单倍体形成的主要途径。

花药培养主要受基因型、花药的发育阶段、预处理和培养条件的影响,其存在的主要问题是单倍体的诱导频率低,单倍体自发加倍形成的二倍体与体细胞组织形成的二倍体很难区分。

例如,Fowler 、Nishi 和Rosati 等以八倍体草莓花药为材料诱导愈伤组织,并分化出植株,发现其再生植株仍为八倍体,这些八倍体是由无性器官发育而来,还是由单倍体自发加倍而成则难以区分。

除花药培养外,植物的卵细胞、助细胞、反足细胞等单倍体细胞通过离体培养可以分化成单倍体胚或愈伤组织。

胚珠、子房培养也曾进行了大量的尝试,但大多数情况下,在愈伤组织阶段生长停止。

3　胚培养(Embryo culture )
胚的离体培养是直接应用于植物改良最早的组织
培养技术。

胚培养可以克服杂交后胚的衰亡,保证种内或种间杂交的成功,或用于无性繁殖困难的植物的培养。

胚培养还可以克服种子的休眠和败育。

Magdalita 、Drew 等分别进行了番木瓜的种内杂交,得到合子胚后,
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进行了胚培养,以促进杂交成功。

Jordan得到了愈伤组织,但未得到再生植株。

澳大利亚国际农业技术研究中心对番木瓜和其野生种的杂交胚进行了广泛而深入的研究,前已获成功,并得到了杂交后代。

野生种的抗性、高含糖量等优良性状得到了遗传。

荔枝是最难进行离体培养的果树树种之一,K antharajah等培养了长度为3mm的荔枝幼胚。

其他通过未成熟胚培养进行再生的树种有鳄梨、番荔枝和番木瓜等;姚强等[8]对桃、油桃和蟠桃花后60d的未成熟胚进行了培养,获得了再生植株;J Button等利用甜橙种胚愈伤组织离体培养获得了果树单一细胞分化的完整植株。

4　胚乳培养(endosperm culture)
三倍体品种因其具有无籽、生长或产量的优势及观赏价值高的特点而倍受育种工作者的重视。

但用2n×4n杂交,选育时间长,4n的育性很低,因此育种难度较大。

胚乳培养获得三倍体在技术本质上是一步成苗,成功解决了这一问题。

胚乳培养首先在苹果上获得了三倍体植株,随后,相继得到了枣、锦丰梨、猕猴桃的三倍体植株。

胚乳培养一般要经愈伤组织、胚状体或直接诱导不定芽成苗[6]。

诱导愈伤组织一般选用处于旺盛生长期的胚乳。

基本培养基多用MS、B5、MT、White等,其中以MS最为常见。

在具体培养时应针对外植体来源及培养目的而筛选相应的培养基。

以下为几种常见水果的胚乳培养基:柑桔:7月下旬将幼果种子在解剖镜下剥去珠被和珠心,带胚(或不带胚)接种在MT+2,42D2.0+BA 5+CH1000+蔗糖5%+琼脂0.7%的培养基暗培养,20 d后产生少量愈伤组织,将BA降为2.5,继代2次可得到胚乳愈伤组织,在28±2℃、2000Lx、14h条件下组织分化植株,提高无机盐浓度和G A浓度,有利分化。

桃:取胚已分化、胚乳已发育成细胞组织的幼果,在无菌条件下解剖出胚和胚乳,剥去胚接种在MS+2,42D0.5+ NAA0.5+CH500培养基上,25℃,20～30d产生愈伤组织,转至MS+BA1.0+NAA0.01+CH500培养基上,15～20d产生胚状体,每隔4～5周再转一次,产生白色胚状体,同时还可以产生根和叶片,1～3mm的胚状体在MS或MS+G A2.0培养基上,长大的胚状体少数可产生根,形成再生小植株。

梨:从胚乳发育到细胞组织的果实种子中取出胚乳组织,接种在MS+2,42D 0.5+BA15+IAA0.5+3%蔗糖培养基上,在26℃,10h 光照条件下,1个月愈伤组织开始形成并分化产生芽点,转移到AS+G A10+BA2+CH250+3%蔗糖的培养基上,促进苗的生长和伸长。

将2～3cm的无根苗插在ASH+IAA1.5+1.5%蔗糖的生根培养基上诱导生根。

葡萄:6～7月将种子从果实中取出,切去合点部分,接种于White+CM10%+2,42D2.0+CH500+KT1+蔗糖3%～4%,琼脂0.8%的培养基上,1个月后,胚乳愈伤组织长大,胚解体。

5　原生质体培养(Protoplast culture)
原生质体是去掉细胞壁的单细胞,它是在离体培养条件下能够再生完整植株的最小单位。

每个原生质体都含有该个体的全部遗传信息,在适宜的培养条件下,具有再生成与其亲本相似的个体的全能性。

原生质培养的主要目的是通过原生质体的融合,克服远缘杂交障碍,实现体细胞杂交,从而产生杂交后代。

在原生质体培养过程中,往往产生大量的变异,可从中选择优良突变体[7]。

自20世纪60年代酶法分离原生质体取得成功以来,植物原生质体经培养获再生植株至今,已有12种苹果基因型原生质体的再生植株,葡萄、桃、银杏等树种的原生质体也已再生出愈伤组织或胚状体。

国内工作者从20世纪80年代开始研究,已获得了新红星苹果、中华猕猴桃、美味猕猴桃、山杏及白诗南葡萄、梅喻的原生质体的再生植株。

6　基因转化(G ene T ransformation)
通过转基因技术,可打破物种之间的杂交障碍,实现了果树遗传性状的定向改良,扩展了育种范围,为果树育种开辟了一条新途径。

果树基因工程育种尽管难度大起步晚,但已经取得了令人瞩目的成就。

目前已经分离或应用的目的基因主要有3大类:抗植物病虫害基因、抗非生物胁迫、改良作物产量品质的基因、改变植物其他性状的基因。

尽管从理论上讲任何植物的组织都能被转化,但许多植物转化后再生率很低。

目前的转化和筛选方法对离体培养有一定的抑制或破坏作用,因此对于离体培养困难的植物要建立一套有效的转化体系有一定困难。

转化频率低、转移基因的非企望异常表达、编码多基因的较大DNA片段的导入方法的建立以及重复性较强的高效再生体系的缺乏是转基因技术应用的限制因素[9]。

表1 几种常见水果转基因利用情况种 外植体 转化方法 基因
苹果白化茎段根癌农杆菌介导G VS.MB39
叶片根癌农杆菌介导G US NPTⅡ
葡萄茎段根癌农杆菌介导NPTⅡ
叶片根癌农杆菌介导G OS NPIⅡ
桃合子胚根癌农杆菌介导细胞分裂素
细胞基因枪编码EG的CDNA 欧洲李下胚轴切断根癌农杆菌介导CP-PPV
杏子叶根癌农杆菌介导CP-PPV
甜樱桃茎尖分生组织基因枪BAR.G US NPTⅡ胚性愈伤组织发根农杆菌介导
7　分子标记的应用
分子标记是以生物大分子,尤其是核酸的多态性为
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基础的遗传标记,具有迅速、准确、灵敏度高等特点。

近年来检测DNA的分子标记技术发展十分迅速,目前RFLP、RAPD、AFLP、SSR、STS、SCAR等方法在分类研究、品种鉴定、系谱分析、遗传图谱构建、基因标记等方面得到广泛应用[10]。

该技术的最突出的优点是多基因控制的复杂性状可被分析。

分子标记技术对果树育种工作有很大的影响。

例如:许多果树在开花结果前需要经过很长的幼年期,这为果树新基因型的培育和选择带来很多不便。

但是如果对某一优良性状进行遗传标记,那么在幼苗阶段即可进行选择。

因此,分子标记可加速果树的育种进程。

某些同工酶标记(isozyme makers)已应用于果树上.如香蕉、果、番木瓜、凤梨等;卫星探针已在鳄梨、芒果、番木瓜等树种的栽培种中得到应用;一些简单的重复序列和微卫星探针也已在鳄梨、荔枝、芒果、番木瓜等树种中得到应用。

Magdalita等应用RAPD技术分析了番木瓜种间杂交后代的遗传多样性。

遗传标记在果树学研究中还有其他方面的广泛应用。

例如:应用DNA指纹技术,可以准确分析、判定果树的基因型和种属特性。

DNA标记为果树群体的遗传变异提供了有效快捷的分析方法,通过标记分析,加速了抗病品种的选育。

在离体再生过程中,由于遗传变异而产生的异常类型,通过DNA标记可加以判定;例如RAPD标记可以判定香蕉的变型。

8　探讨
我国果树生物技术育种已取得了较大进展,但许多技术还处于起步阶段,还有许多问题尚待探讨研究。

8.1　生物技术转化率低
从茎尖组织培养到无毒快繁,从DNA分子标记到转基因植株,在生产上的应用还不是很多,科技转化率比较低。

8.2　基因调控对品质的影响
目前转基因植株应用到生产实践中还极少,故对转基因果品及其加工品在今后果品发展中的地位以及是否影响人体健康等问题,从研究人员数量到探讨内容都很少。

目前在国外已经出现抵制转基因食品现象,在进行基因调控研究的同时,加速对基因调控食品品质的研究,是关系人类自身正常繁衍,也是实行生物技术产业化的前提条件。

8.3　生物技术对种质资源的影响
生物技术研究中器官与组织培养以及继代过程中,激素、培养基等诸多因素对果品种质资源的基因型是否有影响,培养过程中诸多因素是否会对果品种质资源的特性发生影响仍待研究。

特别是连续继代进行种质贮存过程中,种质资源在遗传和生理上发生变化的机理及如何防止等一系列问题应作深层次的研究。

8.4　试验条件的优化研究少
生物技术的研究中关于试验条件研究的很少,导致了试验的可重复性,结果的稳定性较差。

探索不同树种、不同品种、不同材料相配套的适宜条件是生物技术发展中非常重要的一环。

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Application of Biotechnology on F ruit T rees R esearch
ZHANG X iao2yu,Y ANGLi2fang,HU Zhong2hui,L I Shu2hai,ZHAO X ian2zheng
(Tianjin Forests and Fruits Research Institute,Tianjin300161,China)
Abstract:The modern biotechnology has taken advantages in recently years.It plays a new role in modifying target genetic traits,enlarging breeding objectives and raising breedinf efficiency.The paper summarized introduce micropropagation, haploid,embryo culture,protoplast culture and the principle of application and research advantages.
K ey w ords:Biotechnology;G ene Engineering;Fruits
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