不同来源间充质干细胞条件培养基对内源性衰老细胞作用的比较

不同来源间充质干细胞条件培养基对内源性衰老细胞作用的比
较
郑桂纯;赵姝灿;黄丽贞;张晓芳;王丙云;陈胜锋;陈志胜
【摘要】背景:随着经济的发展,人们对美的追求越来越高,抗衰老研究成为当今的
研究热点.干细胞是具有自我更新能力和多向分化能力的细胞,间充质干细胞是其中
的一种.研究表明间充质干细胞能通过旁分泌作用修复损伤衰老的细胞,但对于不同
来源间充质干细胞条件培养基的抗皮肤衰老作用研究甚少.目的:比较人脂肪、羊水、胎盘、脐带来源间充质干细胞条件培养基对自然衰老皮肤成纤维细胞的抗衰老作用.方法:制备人脂肪、羊水、胎盘、脐带4种不同来源的间充质干细胞条件培养基,添加到自然衰老皮肤成纤维细胞中,采用CCK-8法检测细胞活力、β-半乳糖苷酶染色试剂盒检测细胞衰老率、DCFH-DA探针检测活性氧含量以及qPCR检测p16、
p53、COL1、KLOTHO基因表达量.结果与结论:①4种间充质干细胞条件培养基
均能提高皮肤成纤维细胞的活力,其中脂肪间充质干细胞条件培养基的效果最好,β-半乳糖苷酶染色率最低;②4种间充质干细胞条件培养基均能降低活性氧含量,脂肪
和羊水来源间充质干细胞条件培养基组的活性氧含量最低;③p16和p53在胎盘和脐带间充质干细胞条件培养基组的表达均高于对照组,在羊水来源间充质干细胞条
件培养基组的表达较低,脂肪间充质干细胞条件培养基组p16表达显著低于对照组,但p53的表达较高;④COL1基因表达除羊水间充质干细胞条件培养基组外,其他3
组均显著高于对照组,KLOTHO基因表达除胎盘间充质干细胞条件培养基组外,其他3组均显著高于对照组,且脂肪间充质干细胞条件培养基组的表达最高;⑤结果显示,4种不同来源间充质干细胞条件培养基能在一定程度上延缓细胞衰老,但作用效
果存在差异,其作用机制还有待进一步研究.
【期刊名称】《中国组织工程研究》
【年(卷),期】2019(023)021
【总页数】7页(P3357-3363)
【关键词】皮肤成纤维细胞;内源性衰老;脂肪间充质干细胞;胎盘间充质干细胞;脐带间充质干细胞;羊水间充质干细胞;间充质干细胞条件培养基;广东省自然科学基金【作者】郑桂纯;赵姝灿;黄丽贞;张晓芳;王丙云;陈胜锋;陈志胜
【作者单位】佛山科学技术学院生命科学与工程学院,广东省佛山市 528200;佛山科学技术学院生命科学与工程学院,广东省佛山市 528200;佛山科学技术学院生命科学与工程学院,广东省佛山市 528200;佛山科学技术学院生命科学与工程学院,广东省佛山市 528200;佛山科学技术学院生命科学与工程学院,广东省佛山市528200;佛山科学技术学院生命科学与工程学院,广东省佛山市 528200;佛山科学技术学院生命科学与工程学院,广东省佛山市 528200
【正文语种】中文
【中图分类】R459.9
文章快速阅读：
文题释义：
活性氧：正常情况下细胞内活性氧的产生和清除处于平衡，但在细胞衰老进程或刺激因子存在时，其胞内清除活性氧的调节机制失衡，活性氧可诱发膜脂过氧化、蛋白质过氧化、DNA损伤等，导致细胞结构和功能受损。

KLOTHO基因：被誉为衰老抑制基因，当其表达量上调时可以延缓人体衰老，当其表达量下调时会出现类似于衰老的表现。

0 引言 Introduction
衰老是人生命的必经历程，皮肤是生物体最大的器官，衰老最先表现为皮肤衰老，其主要特征是皮肤干燥粗糙、弹性减弱、松弛、皱纹加深等。

随着生活水平的不断提高，人们比以往更加注重皮肤及身体的保养，对美的追求也越来越高，因此对于皮肤抗衰老方面的研究是顺应时代发展并具有重要的意义[1]。

皮肤老化是一个复杂、渐进的过程，涉及外在和内在因素，外源性老化是由于环境侵害，包括紫外线辐射、烟雾和常见污染物[2]，其中紫外线辐射是外在老化的主要因素，也被称为光老化[3]，而内源性老化即自然衰老，随着老龄化现象的增多，如何延缓衰老也成为研究中的焦点。

皮肤成纤维细胞是皮肤真皮中的主要细胞类型，负责调节细胞外基质、胶原蛋白产生和伤口愈合[4]。

这些细胞在维持皮肤正常结构和功能中起重要作用。

间充质干细胞是一类具有自我复制能力和多向分化潜能的细胞，在应用中存在较低的伦理负担，并具有抗炎、免疫调节和高再生特性，因此在人类临床和宠物治疗方面具有极大的吸引力[5-8]。

现阶段研究较多的间充质干细胞包括脂肪间充质干细胞、羊水间充质干细胞、脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、骨髓间充质干细胞。

研究表明，间充质干细胞可以通过旁分泌作用或细胞分化发挥免疫调节、抗凋亡、抗衰老等作用[9-11]。

Lee等[12]发现低氧处理获得的脂肪间充质干细胞条件培养基通过JAK/STAT3信号促进小鼠肝再生。

Ding等[13]研究表明人脂肪来源干细胞分泌的肝细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子可通过激活
SIRT1/FOXO1信号通路改善自然衰老过程中的卵巢功能。

Cooper等[14]发现人脂肪间充质干细胞条件培养基能促进人皮肤成纤维细胞迁移和缺血性伤口愈合。

Kwon等[15]发现人骨髓间充质干细胞条件培养基能显着降低小鼠皮肤基质金属蛋
白酶1表达并增加前胶原合成，促进无毛小鼠皮肤损伤修复和皱纹消失。

脂肪间充质干细胞来源于脂肪组织，是继骨髓间充质干细胞之后在干细胞领域展开广泛研究的一类成体干细胞，其来源丰富、易提取，是理想的种子细胞。

胎盘间充质干细胞、脐带间充质干细胞、羊水间充质干细胞获取具有非侵入性和无创伤性，且无道德、伦理问题，在细胞增殖、免疫抑制方面有明显优势[16]。

课题组在前期已经比较并证实了人胎盘间充质干细胞、脐带间充质干细胞、羊水间充质干细胞的生物学特性差异[17]，作者猜想不同来源间充质干细胞对皮肤的抗衰老作用也具有差异性。

实验以人皮肤成纤维细胞为对象，分别从细胞活力、活性氧含量、基因表达水平等方面比较4种不同来源人间充质干细胞条件培养基的抗衰老作用，为今后的临床应用提供依据。

1 材料和方法 Materials and methods
1.1 设计细胞水平体外实验。

1.2 时间及地点实验于2018年5至12月在佛山科学技术学院动物医院二楼实验室完成。

1.3 材料
1.3.1 样本羊水、脐带、胎盘组织均来自佛山妇幼保健院，捐赠者均知情并签署同意书，同意用于科研实验。

采取随机采样，选择健康孕妇的孕中期羊水以及健康产妇的胎盘、脐带组织。

脂肪组织来源于广东省佛山市曙光金子美容院整形科接受抽脂术的健康女性，年龄27-47岁，无任何其他系统性疾病，术前均签订患者知情同意书，并经佛山科学技术学院伦理委员会通过。

1.3.2 实验试剂与仪器 0.25%胰蛋白酶(Gibico公司)；胎牛血清(BI公司)；DMEM(Hyclone公司)；活性氧检测试剂盒(南京建成公司)；细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒(碧云天公司)；CCK-8试剂盒(日本同仁)；CO2培养箱(SHEL LAB 公司)；流式细胞仪(BD公司)。

1.4 实验方法
1.4.1 人皮肤成纤维细胞的培养人皮肤成纤维细胞购自上海细胞库，培养基由1%双抗、体积分数为10%胎牛血清、89%DMEM-F12组成，将其传代至自然衰老
细胞后进行实验(传至45代以上)。

1.4.2 衰老皮肤成纤维细胞β-半乳糖苷酶染色取传代至自然衰老的皮肤成纤维细胞，按每孔1×104个细胞接种于24孔板，于37 ℃、体积分数为5%CO2条件
下培养48 h。

按β-半乳糖苷酶检测试剂盒进行操作，吸除细胞培养基，PBS洗涤
1次，加入适量SA-β-gal染色固定液，室温固定15 min，吸除细胞固定液，加
入PBS洗涤3次，每次3 min，吸除PBS，加入适量细胞染色工作液，37 ℃孵育过夜，在光学显微镜下观察衰老细胞呈淡蓝至深蓝色。

1.4.3 四种人间充质干细胞的制备
人脂肪间充质干细胞的培养及鉴定细胞来源：人腹部及腿部来源脂肪组织原代培
养方法：酶消化法细胞培养基：人脂肪间充质干细胞完全培养基原代培养时间：原代细胞培养3-5 d开始换液，之后每2 d换液1次，培养5-8 d开始传代细胞
传代：细胞融合至80%-90%用胰酶消化传至下1代，按1∶2比例传代，两三天传1代，可传至15代以上细胞鉴定：经流式鉴定以及成骨、成脂诱导分化能力
鉴定为人脂肪间充质干细胞伦理学批准：该实验经过佛山科学技术学院伦理学委
员会批准
人羊水间充质干细胞的培养及鉴定细胞来源：人羊水组织原代培养方法：将羊水与含有EDTA的PBS按1∶1稀释，以1 200 r/min离心5 min后接种培养细胞
培养基：人羊水干细胞完全培养基原代培养时间：原代细胞培养5-7 d开始换液，之后3 d换液1次，培养9-11 d开始传代细胞传代：细胞融合至80%-90%用胰酶消化传至下1代，按1∶2比例传代，两三天传1代，可传至16代以上细胞鉴定：经免疫荧光染色鉴定以及成骨、成脂、成神经诱导分化能力鉴定为人羊水间
充质干细胞伦理学批准：该实验经过佛山科学技术学院伦理学委员会批准
人脐带间充质干细胞的培养及鉴定细胞来源：人脐带组织原代培养方法：酶消化法细胞培养基： OriCellTM人脐带间充质干细胞完全培养基原代培养时间：原代细胞培养3 d开始换液，之后2 d换液1次，培养5-7 d开始传代细胞传代：细
胞融合至80%-90%用胰酶消化传至下1代，按1∶2传代，2 d左右传1代，传
至22代细胞鉴定：经免疫荧光染色鉴定以及成骨、成脂、成神经诱导分化能力鉴定为人脐带间充质干细胞伦理学批准：该实验经过佛山科学技术学院伦理学委员
会批准
人胎盘间充质干细胞的培养及鉴定细胞来源：人胎盘组织原代培养方法：酶消化法细胞培养基： OriCellTM胎盘间充质干细胞完全培养基原代培养时间：原代细胞培养24 h开始换液，之后2 d换液1次，培养5-7 d开始传代细胞传代：细
胞融合至80%-90%用胰酶消化传至下1代，按1∶2传代，2 d左右传1代，传
至12代细胞鉴定：经免疫荧光染色鉴定以及成骨、成脂、成神经诱导分化能力鉴定为人胎盘间充质干细胞伦理学批准：该实验经过佛山科学技术学院伦理学委员
会批准
1.4.4 四种人间充质干细胞条件培养基的制备取传代培养中的第4代人间充质干细胞，所取细胞均活性良好，具有成脂成骨分化能力特征，按1×106个细胞接种于100 mm的培养皿中，当细胞融合度达到80%左右时更换为含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养基，继续培养48 h后收集细胞培养基上清液，对上清液进
行离心(4 000 r/min)处理20 min，用0.22 μm滤器过滤后获得条件培养基，4 ℃保存备用。

1.4.5 CCK-8法检测细胞增殖活性取传代至自然衰老的人皮肤成纤维细胞，按每
孔1×103个细胞接种于96孔板，于37 ℃、体积分数为5%CO2条件下培养24 h，弃去培养基，PBS清洗，分别加入上述4种人间充质干细胞条件培养基，加入
含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养基为对照组，培养24，48，72 h时
弃去孔内培养基，每孔加入10 μL CCK-8和10 μL无血清DMEM的混合液，细
胞培养箱中孵育2.5 h，酶标仪检测波长450 nm处的吸光度值。

1.4.6 β-半乳糖苷酶染色取传代至自然衰老的人皮肤成纤维细胞，按每孔1×104
个细胞接种于24孔板，于37 ℃、体积分数为5%CO2条件下培养24 h，弃去培养基，PBS清洗，分别加入上述4种人间充质干细胞条件培养基，加入含体积分
数为10%胎牛血清的DMEM培养基为对照组，培养72 h时按β-半乳糖苷酶检测试剂盒进行操作，吸除细胞培养基，PBS洗涤1次，加入适量SA-β-gal染色固定液，室温固定15 min，吸除细胞固定液，加入PBS洗涤3次，每次3 min，吸除PBS，加入适量细胞染色工作液，37 ℃孵育过夜，在光学显微镜下观察衰老细胞
呈淡蓝至深蓝色，标本阳性率以阳性标本占总标本数的百分率表示。

1.4.7 细胞内活性氧水平取传代至自然衰老的人皮肤成纤维细胞，按每孔1×105
个细胞接种于6孔板，于37 ℃、体积分数为5%CO2条件下培养，细胞贴壁后，弃去培养基，PBS清洗，分别加入上述4种人间充质干细胞条件培养基，加入含
体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养基为对照组，培养72 h时用活性氧检测试剂盒检测细胞内活性氧水平。

将细胞用胰酶消化后离心，弃上清，加入PBS清洗，离心弃上清，每管加入5 μmol/L DCFH-DA溶液500 μL，37 ℃孵育20 min，1 200 r/min离心5 min后去除上清液，用无血清DMEM洗涤细胞两三次，加入PBS重悬上机检测，结果以荧光强度值表示。

1.4.8 实时荧光定量PCR检测细胞相关衰老基因表达取传代至自然衰老的人皮肤成纤维细胞，按每孔1×106个细胞接种于100 mm培养皿中，于37 ℃、体积分数为5%CO2条件下培养，细胞贴壁后，弃去培养基，PBS清洗，分别加入上述4
种人间充质干细胞条件培养基，加入含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养
基为对照组，培养72 h后，将其消化离心，每孔加入RNAiso plus试剂提取细胞
总RNA，反转录获得cDNA，进行RT-PCR反应。

按照引物序列及PCR试剂盒说明书完成PCR反应体系，以β-actin作为内参，通过2-ΔΔCt法，对各组基因表
达量进行统计。

引物均根据设计原则准确设计，并在NCBI基因数据库中比对无误，由上海生工生物工程股份有限公司合成，见表1。

1.5 主要观察指标①各组细胞的生长增殖能力；②各组细胞的β-半乳糖苷酶染色
数量；③各组细胞的活性氧含量；④各组细胞的p16、p53、COL1、KLOTHO基因表达量。

1.6 统计学分析采用SPSS 19.0软件进行分析，两独立样本比较采用独立样本t
检验，不同组间比较采用单因素方差分析，计量资料用±s表示，P < 0.05为差异有显著性意义。

2 结果 Results
2.1 衰老人皮肤成纤维细胞的形态及β-半乳糖苷酶染色结果当人皮肤成纤维细胞
传至45代以上，细胞呈扁平状，逐渐排列不规则，胞核增大，细胞增殖速度明显减缓，见图1A。

经β-半乳糖苷酶染色后，人皮肤成纤维细胞被染成蓝绿色，综合人皮肤成纤维细胞形态的改变可证明细胞发生了复制性衰老，见图1B。

2.2 四种间充质干细胞条件培养基对衰老人皮肤成纤维细胞增殖的影响 CCK-8检
测结果见图2。

在24-72 h，4种间充质干细胞条件培养基组的细胞活性显著高于对照组(P < 0.01)，说明人脂肪、羊水、脐带、胎盘来源间充质干细胞条件培养基能提高衰老人皮肤成纤维细胞的活力，从结果可看出，脂肪间充质干细胞条件培养基的效果最好。

2.3 衰老人皮肤成纤维细胞β-半乳糖苷酶染色结果培养72 h后，SA-β-gal染色
结果显示，脂肪间充质干细胞条件培养基组和胎盘间充质干细胞条件培养基组蓝绿色的衰老细胞较少，与对照组比较差异有显著性意义(P < 0.01)，见图3，说明上
述2种条件培养基具有显著抗细胞衰老作用。

2.4 衰老人皮肤成纤维细胞活性氧水平 4种间充质干细胞条件培养基组细胞活性氧荧光强度均低于对照组(P <0.01)，其中胎盘间充质干细胞条件培养基组与脐带间充质干细胞条件培养基组差异无显著性意义(P > 0.05)；脂肪间充质干细胞条件培养基组和羊水间充质干细胞条件培养基组差异也无显著性意义(P > 0.05)，但这2组细胞荧光强度显著低于胎盘间充质干细胞条件培养基组和脐带间充质干细胞条件培养基组(P < 0.05)，说明脂肪、羊水来源间充质干细胞条件培养基降低衰老人皮肤成纤维细胞活性氧荧光强度的效果最好，见图4。

2.5 实时荧光定量 PCR检测衰老基因表达衰老基因p16和p53在胎盘间充质干细胞条件培养基组和脐带间充质干细胞条件培养基组表达较高，且高于对照组(P <0.01)；脂肪间充质干细胞条件培养基组p16基因表达低于对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)，但p53基因表达较高；羊水间充质干细胞条件培养基组p16表达量与对照组差异无显著性意义，p53的表达显著低于对照组(P < 0.01)，见图5A。

与对照组相比，脂肪间充质干细胞条件培养基组COL1和KLOTHO基因表达最高，见图5B。

3 讨论 Discussion
皮肤成纤维细胞是皮肤真皮中的主要细胞类型，广泛应用于皮肤衰老相关研究中。

细胞复制性衰老是用来阐述器官老化内在机制的常用实验性衰老模型[18-19]，此实验通过传代培养获得复制性衰老的人皮肤成纤维细胞构建内源性衰老模型。

图1 衰老人皮肤成纤维细胞的形态及β-半乳糖苷酶染色(×100)Figure 1 Morphology and β-galactosidase staining of senescent skin fibroblasts (×100)图注：图中A为衰老人皮肤成纤维细胞，呈扁平状，逐渐排列不规则，胞核增大；B为β-半乳糖苷酶染色，可见人皮肤成纤维细胞被染成蓝绿色。

图2 各组衰老人皮肤成纤维细胞的增殖活性比较Figure 2 Comparison of proliferative activity of senescent skin fibroblasts among groups图注：与对
照组比较，aP < 0.01。

图3 各组衰老人皮肤成纤维细胞β-半乳糖苷酶染色(×100)Figure 3 β-galactosidase sta ining of senescent skin fibroblasts in each group (×100)图注：图中A为对照组；B为胎盘间充质干细胞条件培养基组；C为羊水间充质干细胞条件培养基组；D为脐带间充质干细胞条件培养基组；E为脂肪间充质干细胞条件培养基组；F为各组细胞衰老率统计学分析，与对照组比较，aP < 0.01。

图4 各组衰老人皮肤成纤维细胞的活性氧荧光强度Figure 4 Reactive oxygen fluorescence intensity of senescent skin fibroblasts in each group图注：与对照组比较，aP < 0.01；与胎盘、脐带间充质干细胞条件培养基组比较，bP < 0.05。

表1 基因引物序列信息Table 1 Gene primer sequences引物名称引物序列(5'-3') 片段长度(bp)Actin F：CAC CCA GCA CAA TGA AGA TCA AGA T 317 R：CCA GTT TTT AAA TCC TGA GTC AAG C p16 F：ATG GAG CCT TCG GCT GAC TG 133 R：TCA TGA CCT GGA TCG GCC T COL1 F：GAC ATC CCA CCA ATC ACC TGC 233 R：TCG ACG CCG GTG GTT TCT T p53 F：GCT CTG ACT GTA CCA CCA TCC AC 150 R：CAC AAA CAC GCA CCT CAA AGC KLOTHO F：CGA CCA CTT CAG GGA TTA CGC 233 R：CCT GAG TGG GAC GGA AAG AAG T
图5 各组衰老人皮肤成纤维细胞的衰老相关基因表达Figure 5 Expression of senescence-associated genes in senescent skin fibroblasts图注：图中A为p16、p53基因表达；B为COL1、KLOTHO基因表达。

与对照组比较，aP < 0.05，bP < 0.01。

间充质干细胞已经被证明了可以通过旁分泌机制与周围细胞进行信号传导，赵传祥等[20]发现人脐带间充质干细胞培养上清液能延缓H2O2诱导的人皮肤成纤维细
胞衰老。

为使间充质干细胞保持良好活性，实验采用了含体积分数为10%胎牛血清的DMEM制备4种间充质干细胞条件培养基。

间充质干细胞条件培养基不仅含有间充质干细胞分泌的生物活性成分，而且还具有比间充质干细胞存储容易和应用安全的优势。

该研究中比较了脂肪、羊水、胎盘、脐带来源间充质干细胞条件培养基对内源性衰老皮肤成纤维细胞的影响，旨在为皮肤衰老的逆转找到最合适的间充质干细胞条件培养基。

成纤维细胞是皮肤组织中最主要的细胞，其细胞活性的降低也是皮肤衰老的重要表现[21]。

皮肤成纤维细胞的大量增殖导致皮肤真皮层增厚，实验结果表明4种间充质干细胞条件培养基均能减轻皮肤成纤维细胞内源性衰老的一些特征，其中细胞活力均显著提高。

衰老相关的标志酶之一β-半乳糖苷酶的表达随着年龄的增长而增加，实验中脂肪和胎盘来源间充质干细胞条件培养基组的SA-β-gal阳性细胞百分比显著低于对照组，说明二者能延缓皮肤成纤维细胞的衰老，但羊水和脐带来源间充质干细胞条件培养基组的SA-β-gal阳性细胞百分比与对照组没有显著差异，为了进一步证明其能否改善皮肤成纤维细胞的内源性衰老，检测了细胞活性氧含量以及衰老基因表达水平。

大部分的细胞活性氧是由线粒体产生的，当活性氧大量生成时可触发细胞内的氧化应激反应，直接作用于人体的蛋白质、脂类和DNA，干扰DNA复制，降解蛋白质等。

Xiong等[22]发现清除人皮肤成纤维细胞中的活性氧能有效促进皮肤伤口愈合和延缓衰老，流式检测结果显示4种间充质干细胞条件培养基均能显著降低活性氧含量。

皮肤老化主要表现为皮肤粗糙斑驳、肤色暗沉、色素沉着和出现皱纹[4]。

潜在的机制可能涉及细胞成分的改变和真皮中细胞外基质成分包括胶原蛋白和弹性蛋白纤维的降解[23]，胶原蛋白是真皮中最丰富的细胞外基质蛋白，人体内超过90%的胶原蛋白是Ⅰ型胶原蛋白[24]。

在自然老化的皮肤中，Ⅰ型胶原蛋白合成会减少。

实验发现4种间充质干细胞条件培养基能增加COL1的表达，其中脂肪间充质干
细胞条件培养基组的COL1表达最高，但羊水间充质干细胞条件培养基组与对照
组相比差异性不显著。

p16、p53是调节细胞衰老的重要因子，它们都是通过不同的信号通路调控细胞周期及细胞衰老，在细胞分裂停止的衰老细胞中表达增加。

Park等[25]证明了衰老
的皮肤成纤维细胞会高表达p16、p53基因，二者均是重要的抑癌基因，且在细
胞周期调节中起着重要作用。

随着组织老化、细胞分裂次数的积累，其表达上调，p16被认为是与细胞衰老相关的一种有效生物标志物，已被应用于检测人体组织
在分子水平上的衰老程度[26]。

在该实验中，胎盘和脐带间充质干细胞条件培养基组p16的表达明显高于对照组，脂肪间充质干细胞条件培养基组p16的表达较低，羊水间充质干细胞条件培养基组p16的表达与对照组相比无差异性；p53基因表
达除了羊水间充质干细胞条件培养基组显著低于对照组外，其他3组均高于对照组。

p16、p53的表达增加，这可能是细胞受到刺激所做出反应。

细胞衰老本身是抑制肿瘤发生的一个重要机制，当细胞内损伤逐渐积累，癌基因持续激活会导致肿瘤发生的可能性增加，细胞会采取衰老或凋亡的手段去除损伤的细胞，从而保持机体稳定。

KLOTHO基因也是细胞衰老的标志物之一，它还具有多种生物学活性，包括参与
钙磷稳态、抑制氧化应激和细胞凋亡等[27-28]。

除了胎盘间充质干细胞条件培养
基组的KLOTHO基因表达与对照组无显著性差异，其他3组均显著高于对照组。

Cui等[29]发现KLOTHO蛋白可以提高细胞活力，清除活性氧，减缓细胞的氧化
应激。

在该实验中，4种间充质干细胞条件培养基均显著降低了活性氧含量，与KLOTHO基因表达情况相符。

对于间充质干细胞及其条件培养基对皮肤衰老作用的研究已经广泛开展，间充质干细胞能促进皮分泌胶原蛋白，减少活性氧和基质金属酶类的含量，进而延缓衰老。

郭吉安[30]通过制备脂肪干细胞微囊泡，添加到老年皮肤成纤维细胞中，发现其能
增强衰老皮肤成纤维细胞的活性，降低活性氧的含量，促进Ⅰ型胶原蛋白的分泌，对成纤维细胞有一定的抗衰老作用。

这与作者的实验结果基本一致，综合以上的实验结果，可以认为4种间充质干细胞条件培养基在一定程度上改善了内源性衰老皮肤成纤维细胞的活性，但4种间充质干细胞条件培养基的作用效果存在差异，机制可能不同。

羊水间充质干细胞条件培养基的抗凋亡作用较好，胎盘和脐带间充质干细胞条件培养基组的p16和p53基因表达均较高，可能它们能增强皮肤成纤维细胞的活性，但不能真正使细胞年轻化，具体的机制仍需后续进行研究。

脂肪间充质干细胞条件培养基延缓皮肤成纤维细胞衰老的效果最好，且脂肪间充质干细胞取材方便、扩增迅速、生物活性确切，可以较广泛应用于抗衰老、损伤修复中。

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