中空纤维液相微萃取-高效液相色谱法测定荆芥及其复方制剂中胡薄荷酮的含量

中空纤维液相微萃取-高效液相色谱法测定荆芥及其复方制剂中胡薄荷酮的含量
作者：李萍胡爽白小红毕小平
来源：《中国药房》2021年第12期
摘要目的：建立荆芥饮片及其复方制剂中胡薄荷酮的含量测定方法。

方法：采用中空纤维液相微萃取-高效液相色谱法（HF-LPME-HPLC）。

在单因素实验基础上，以胡薄荷酮富集倍数为考察指标，样品相溶液盐（NaCl）浓度、萃取时间、搅拌速度为考察因素，采用中心组合设计-响应面法优化荆芥饮片及其复方制剂（以复方荆芥颗粒为例）的HF-LPME条件，并进行验证。

采用HPLC法测定胡薄荷酮的含量，色谱柱为Hypersil C18，流动相为甲醇-0.3%磷酸溶液（梯度洗脱），流速为1.0 mL/min，检测波长为252 nm，柱温为25 ℃，进样量为20
μL。

以2020年版《中国药典》（一部）荆芥饮片项下HPLC法为参照，验证本研究所建HF-LPME-HPLC法的可行性。

结果：HF-LPME最优条件为以正壬醇为萃取溶剂，在pH为7、NaCl浓度为11%的样品相溶液中，以800 r/min搅拌萃取36 min。

HPLC方法学考察结果显示，胡薄荷酮检测质量浓度的线性范围为0.05～5 μg/mL（r=0.999 0）;检测限和定量限分别为0.4、1.3 ng/mL;日内、日间精密度的RSD分别为1.8%～4.0%、1.5%～4.1%（n=3）;重复性、稳定性（24 h）试验的RSD均小于8%（n=6）;荆芥饮片和复方荆芥颗粒中胡薄荷酮的平均回收率分别为102.6%～105.1%、97.2%～102.3%，RSD分别不高于4.1%和6.2%（n=3）。

采用药典方法和本研究建立方法测得荆芥饮片中胡薄荷酮的平均含量分别为0.84 mg/g
（RSD=4.3%，n=3）和0.87 mg/g（RSD=5.5%，n=3），差异无统计学意义（P>0.05）。

结
论：建立的HF-LPME-HPLC法实现了对胡薄荷酮的富集与浓缩，具有较强的纯化能力与较高的灵敏度，可用于荆芥饮片及其复方制剂中胡薄荷酮的含量测定。

关键词中空纤维液相微萃取;高效液相色谱法;中心组合设计-响应面法;胡薄荷酮;荆芥饮片;复方制剂
ABSTRACT OBJECTIVE： To establish the method for the content determination of pulegone in Schizonepetae tenuifolia decoction pieces and its compound preparation. METHODS： Hollow fiber liquid-phase microextraction coupled with HPLC （HF-LPME-HPLC） was adopted. Based on single factor tests， HF-LPME condition of S. tenuifolia decoction pieces and its compound preparation （taking Compound S. tenuifolia granule as an expample） was optimized by central composite design-response surface methodology using pulegone enrichment multiple as index， with the concentration of sample phase solution （NaCl）， extraction time and stirring speed as factors. Validation test was conducted. HPLC method was adopted to determine the content of pulegone. The determination was performed on Hypersil C18 column with mobile phase consisted of methanol-0.3% phosphoric acid （gradient elution） at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was set at 252 nm， the column temperature was 25 ℃. The sample size was 20 μL. The feasibility of HF-LPME-HPLC method established in this study was validated by using HPLC method stated in the item of S. tenuifolia decoction pieces in 2020 edition of Chinese Pharmacopoeia （part Ⅰ） as reference. RESULTS： The optimum HF-LPME conditions included n-nonanol as the extraction solvent， sample phase solution with 11% NaCl and pH value of 7， stirring speed of 800 r/min，extraction time of 36 min. Results of HPLC methodology investigation showed that linear range of pulegone were 0.05-5 μg/mL （r=0.999 0）. The limits of detection and quantitation were 0.4 and 1.3 ng/mL， respectively. RSDs of intra-day and inter-day precision were 1.8%-4.0% and 1.5%-4.1% （n=3）， respectively. RSDs of reproducibility and stability tests （24 h） were all lower than 8%（n=6）. Average recoveries of S. tenuifolia decoction pieces and Compound S. tenuifolia granule were 102.6%-105.1% and 97.2%-102.3%， respectively; RSDs were not higher than 4.1% and 6.2% （n=3）. The average contents of pulegone in S. tenuifolia decoction pieces determined by pharmacopoeia method and established method were 0.84 mg/g （RSD=4.3%， n=3） and 0.87
mg/g （RSD=5.5%， n=3）， respectively， with no significant difference （P>0.05）. CONCLUSIONS： The established HF-LPME-HPLC method can enrich and concentrate pulegone，shows strong purification ability and high sensitivity， and can be used to determine the contents of pulegone in S. tenuifolia decoction pieces and its compound preparation.
KEYWORDS Hollow fiber liquid-phase microextraction; HPLC; Central composite design-response surface methodology; Pulegone; Schizonepetae tenuifolia decoction piece; Compound pregaration
荆芥为唇形科植物荆芥Schizonepeta tenuifolia Briq.的干燥地上部分，性微温、味辛[1]。

现代药理研究表明，荆芥主要具有抗病毒、抗炎、镇痛、抗肿瘤、调节免疫、抗菌、止血等作
用，且常被加入到具有清热解毒功效的中药复方制剂中[2]。

荆芥的主要有效成分为胡薄荷酮，其可降低白细胞介素1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、γ干扰素（IFN-γ）等炎性细胞因子水平，具有较强的抗炎作用[3-4]。

目前，胡薄荷酮常用的定量分析方法为高效液相色谱法（HPLC）和气相色谱法[5-6]。

对于荆芥饮片及成分更为复杂的复方制剂而言，测定其中胡薄荷酮的含量时，需先进行样品的前处理，而采用传统的液液萃取法进行前处理存在有机溶剂用量大、提取耗时长、操作繁琐、对仪器灵敏度要求相对较高等不足[6-7]。

因此，建立一种操作简便、纯化与富集能力强的样品前处理方法是很有必要的。

近年来，中空纤维液相微萃取（HF-LPME）技术因适用于复杂样品的萃取、浓缩、纯化而得以广泛应用[8-9]。

中空纤维是一种中空、多孔的高分子材料，无毒且具有很好的生物相容性，其微米级壁孔可使小分子化合物自由通过。

中空纤维不仅可以作为保护萃取相的载体和纯化样品的过滤器，克服单滴液相微萃取液滴不稳定、分散液相微萃取纯化效果差和重现性差等缺点，而且还有助于分析物的富集[10-13]。

目前，尚未有研究采用HF-LPME技术结合HPLC 法对荆芥饮片及其复方制剂中胡薄荷酮进行分离、富集和定量分析。

鉴于此，本研究以荆芥饮片和本实验室自制的复方荆芥颗粒为检测样品，在单因素实验的基础上，结合中心组合设计-响应面法优化胡薄荷酮的HF-LPME条件，并建立含量测定的HPLC方法，以期为荆芥饮片及其复方制剂的分析提供一种纯化能力强、操作简便的样品前处理方法和灵敏度高的含量测定方法。

1 材料
1.1 主要仪器
1200 Series型HPLC仪购自美国Agilent公司;SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵购自郑州长城科工贸有限公司;KQ-50DE型超声波清洗机购自宁波新芝生物科技股份有限公司;XS205DU型电子天平购自瑞士Mettler Toledo公司;HJ-6B型数显多头磁力恒温搅拌器购自金坛市白塔金昌实验仪器厂。

1.2 主要药品与试剂
荆芥饮片（批号分别为20170524、20180721、20190521）购自运城市神农中药材有限公司，经山西医科大学白云娥教授鉴定为唇形科植物荆芥S. tenuifolia Briq.的干燥地上部分;胡薄荷酮对照品（批号Z05J9H63054，纯度≥95%）购自上海源叶生物科技有限公司;复方荆芥颗粒（批号分别为20200908、20200909、20200910，规格为每袋10 g）由山西医科大学药学院实验室自制;聚偏氟乙烯中空纤维（内径0.5 mm，孔径0.2 μm）购自天津膜天膜科技股份有限公司;甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯或实验室常用规格，水为蒸馏水。

2 方法与结果
2.1 溶液的制备
2.1.1 对照品溶液称取胡薄荷酮对照品适量，置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，制得质量浓度为1.12 mg/mL的对照品贮备液，4 ℃下保存，备用。

临用时，按照实验所需用甲醇稀释成相应质量浓度的对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液取荆芥饮片粉末（过二号筛）约0.5 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加甲醇10 mL，超声（功率为400 W）处理20 min，然后以8 000 r/min离心10 min，取上清液。

沉淀物再加甲醇10 mL，同法超声处理并离心1次。

合并2次上清液并转移至25 mL量瓶中，加甲醇定容，摇匀，即得供试品溶液①。

精密称定复方荆芥颗粒5.0 g，研磨后，置于具塞锥形瓶中，其余与荆芥饮片同法操作，即得供试品溶液②。

2.1.3 基质溶液按处方比例称取复方荆芥颗粒的辅料（糊精和糖粉），同“2.1.2”项下“供试品溶液②”方法操作，即得基质溶液。

2.2 色谱条件
色谱柱为Hypersil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流动相为甲醇（A）-0.3%磷酸溶液（B），梯度洗脱（0～8 min，60%A→65%A，8～18 min，65%A→70%A，18～19 min，70%A→60%A）;流速为1.0 mL/min;检测波长为252 nm;柱温为25 ℃;进样量为20 μL。

2.3 HF-LPME样品前处理方法
先将中空纤维剪成长约7 cm的小段，依次用丙酮、甲醇、水超声（功率为400 W）清洗10 min，去除纤维表面及管腔内的杂质后，于室温下自然晾干，备用。

按照各项实验要求取规定质量浓度的对照品溶液或供試品溶液70 μL，以一定浓度的盐溶液稀释至7 mL，得到一定pH的样品相溶液。

把处理好的中空纤维浸泡于萃取剂中，至纤维壁孔充满萃取剂后，取出，擦去纤维外表面多余的萃取剂，并用萃取剂将管腔注满，两端封口，弯成“U”型，然后浸入上述样品相溶液中，于室温下以一定转速搅拌萃取一定时间。

萃取结束后，将纤维管内的萃取剂转移到EP管中，用甲醇40 μL冲洗纤维内壁，将冲洗液与EP管中的萃取剂合并，涡旋30 s，混匀后，按“2.2”项下色谱条件进样分析。

HF-LPME-HPLC法测定胡薄荷酮含量的操作流程示意图见图1。

KEYWORDS Hollow fiber liquid-phase microextraction; HPLC; Central composite design-response surface methodology; Pulegone; Schizonepetae tenuifolia decoction piece; Compound pregaration
荆芥为唇形科植物荆芥Schizonepeta tenuifolia Briq.的干燥地上部分，性微温、味辛[1]。

现代药理研究表明，荆芥主要具有抗病毒、抗炎、镇痛、抗肿瘤、调节免疫、抗菌、止血等作
用，且常被加入到具有清热解毒功效的中药复方制剂中[2]。

荆芥的主要有效成分为胡薄荷酮，其可降低白细胞介素1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、γ干扰素（IFN-γ）等炎性细胞因子水平，具有较强的抗炎作用[3-4]。

目前，胡薄荷酮常用的定量分析方法为高效液相色谱法（HPLC）和气相色谱法[5-6]。

对于荆芥饮片及成分更为复杂的复方制剂而言，测定其中胡薄荷酮的含量时，需先进行样品的前处理，而采用传统的液液萃取法进行前处理存在有机溶剂用量大、提取耗时长、操作繁琐、对仪器灵敏度要求相对较高等不足[6-7]。

因此，建立一种操作简便、纯化与富集能力强的样品前处理方法是很有必要的。

近年来，中空纤维液相微萃取（HF-LPME）技术因适用于复杂样品的萃取、浓缩、纯化而得以广泛应用[8-9]。

中空纤维是一种中空、多孔的高分子材料，无毒且具有很好的生物相容性，其微米级壁孔可使小分子化合物自由通过。

中空纤维不仅可以作为保护萃取相的载体和纯化样品的过滤器，克服单滴液相微萃取液滴不稳定、分散液相微萃取纯化效果差和重现性差等缺点，而且还有助于分析物的富集[10-13]。

目前，尚未有研究采用HF-LPME技术结合HPLC 法对荆芥饮片及其复方制剂中胡薄荷酮进行分离、富集和定量分析。

鉴于此，本研究以荆芥饮片和本实验室自制的复方荆芥颗粒为检测样品，在单因素实验的基础上，结合中心组合设计-响应面法优化胡薄荷酮的HF-LPME条件，并建立含量测定的HPLC方法，以期为荆芥饮片及其复方制剂的分析提供一种纯化能力强、操作简便的样品前处理方法和灵敏度高的含量测定方法。

1 材料
1.1 主要仪器
1200 Series型HPLC仪购自美国Agilent公司;SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵购自郑州长城科工贸有限公司;KQ-50DE型超声波清洗机购自宁波新芝生物科技股份有限公司;XS205DU型电子天平购自瑞士Mettler Toledo公司;HJ-6B型数显多头磁力恒温搅拌器购自金坛市白塔金昌实验仪器厂。

1.2 主要药品与试剂
荆芥饮片（批号分别为20170524、20180721、20190521）购自运城市神农中药材有限公司，经山西医科大学白云娥教授鉴定为唇形科植物荆芥S. tenuifolia Briq.的干燥地上部分;胡薄荷酮对照品（批号Z05J9H63054，纯度≥95%）购自上海源叶生物科技有限公司;复方荆芥颗粒（批号分别为20200908、20200909、20200910，规格为每袋10 g）由山西医科大学药学院实验室自制;聚偏氟乙烯中空纤维（内径0.5 mm，孔径0.2 μm）购自天津膜天膜科技股份有限公司;甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯或实验室常用规格，水为蒸馏水。

2 方法与结果
2.1 溶液的制备
2.1.1 对照品溶液称取胡薄荷酮对照品适量，置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，制得质量浓度为1.12 mg/mL的对照品贮备液，4 ℃下保存，备用。

临用时，按照实验所需用甲醇稀释成相应质量浓度的对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液取荆芥饮片粉末（过二号筛）约0.5 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加甲醇10 mL，超声（功率为400 W）处理20 min，然后以8 000 r/min离心10 min，取上清液。

沉淀物再加甲醇10 mL，同法超声处理并离心1次。

合并2次上清液并转移至25 mL量瓶中，加甲醇定容，摇匀，即得供试品溶液①。

精密称定复方荆芥颗粒5.0 g，研磨后，置于具塞锥形瓶中，其余与荆芥饮片同法操作，即得供试品溶液②。

2.1.3 基质溶液按处方比例称取复方荆芥颗粒的辅料（糊精和糖粉），同“2.1.2”项下“供试品溶液②”方法操作，即得基质溶液。

2.2 色谱条件
色谱柱为Hypersil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動相为甲醇（A）-0.3%磷酸溶液（B），梯度洗脱（0～8 min，60%A→65%A，8～18 min，65%A→70%A，18～19 min，70%A→60%A）;流速为1.0 mL/min;检测波长为252 nm;柱温为25 ℃;进样量为20 μL。

2.3 HF-LPME样品前处理方法
先将中空纤维剪成长约7 cm的小段，依次用丙酮、甲醇、水超声（功率为400 W）清洗10 min，去除纤维表面及管腔内的杂质后，于室温下自然晾干，备用。

按照各项实验要求取规定质量浓度的对照品溶液或供试品溶液70 μL，以一定浓度的盐溶液稀释至7 mL，得到一定pH的样品相溶液。

把处理好的中空纤维浸泡于萃取剂中，至纤维壁孔充满萃取剂后，取出，擦去纤维外表面多余的萃取剂，并用萃取剂将管腔注满，两端封口，弯成“U”型，然后浸入上述样品相溶液中，于室温下以一定转速搅拌萃取一定时间。

萃取结束后，将纤维管内的萃取剂转移到EP管中，用甲醇40 μL冲洗纤维内壁，将冲洗液与EP管中的萃取剂合并，涡旋30 s，混匀后，按“2.2”项下色谱条件进样分析。

HF-LPME-HPLC法测定胡薄荷酮含量的操作流程示意图见图1。

KEYWORDS Hollow fiber liquid-phase microextraction; HPLC; Central composite design-response surface methodology; Pulegone; Schizonepetae tenuifolia decoction piece; Compound pregaration
荆芥为唇形科植物荆芥Schizonepeta tenuifolia Briq.的干燥地上部分，性微温、味辛[1]。

现代药理研究表明，荆芥主要具有抗病毒、抗炎、镇痛、抗肿瘤、调节免疫、抗菌、止血等作
用，且常被加入到具有清热解毒功效的中药复方制剂中[2]。

荆芥的主要有效成分为胡薄荷酮，其可降低白细胞介素1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、γ干扰素（IFN-γ）等炎性细胞因子水平，具有较强的抗炎作用[3-4]。

目前，胡薄荷酮常用的定量分析方法为高效液相色谱法（HPLC）和气相色谱法[5-6]。

对于荆芥饮片及成分更为复杂的复方制剂而言，测定其中胡薄荷酮的含量时，需先进行样品的前处理，而采用传统的液液萃取法进行前處理存在有机溶剂用量大、提取耗时长、操作繁琐、对仪器灵敏度要求相对较高等不足[6-7]。

因此，建立一种操作简便、纯化与富集能力强的样品前处理方法是很有必要的。

近年来，中空纤维液相微萃取（HF-LPME）技术因适用于复杂样品的萃取、浓缩、纯化而得以广泛应用[8-9]。

中空纤维是一种中空、多孔的高分子材料，无毒且具有很好的生物相容性，其微米级壁孔可使小分子化合物自由通过。

中空纤维不仅可以作为保护萃取相的载体和纯化样品的过滤器，克服单滴液相微萃取液滴不稳定、分散液相微萃取纯化效果差和重现性差等缺点，而且还有助于分析物的富集[10-13]。

目前，尚未有研究采用HF-LPME技术结合HPLC 法对荆芥饮片及其复方制剂中胡薄荷酮进行分离、富集和定量分析。

鉴于此，本研究以荆芥饮片和本实验室自制的复方荆芥颗粒为检测样品，在单因素实验的基础上，结合中心组合设计-响应面法优化胡薄荷酮的HF-LPME条件，并建立含量测定的HPLC方法，以期为荆芥饮片及其复方制剂的分析提供一种纯化能力强、操作简便的样品前处理方法和灵敏度高的含量测定方法。

1 材料
1.1 主要仪器
1200 Series型HPLC仪购自美国Agilent公司;SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵购自郑州长城科工贸有限公司;KQ-50DE型超声波清洗机购自宁波新芝生物科技股份有限公司;XS205DU型电子天平购自瑞士Mettler Toledo公司;HJ-6B型数显多头磁力恒温搅拌器购自金坛市白塔金昌实验仪器厂。

1.2 主要药品与试剂
荆芥饮片（批号分别为20170524、20180721、20190521）购自运城市神农中药材有限公司，经山西医科大学白云娥教授鉴定为唇形科植物荆芥S. tenuifolia Briq.的干燥地上部分;胡薄荷酮对照品（批号Z05J9H63054，纯度≥95%）购自上海源叶生物科技有限公司;复方荆芥颗粒（批号分别为20200908、20200909、20200910，规格为每袋10 g）由山西医科大学药学院实验室自制;聚偏氟乙烯中空纤维（内径0.5 mm，孔径0.2 μm）购自天津膜天膜科技股份有限公司;甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯或实验室常用规格，水为蒸馏水。

2 方法与结果
2.1 溶液的制备
2.1.1 对照品溶液称取胡薄荷酮对照品适量，置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，制得质量浓度为1.12 mg/mL的对照品贮备液，4 ℃下保存，备用。

临用时，按照实验所需用甲醇稀释成相应质量浓度的对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液取荆芥饮片粉末（过二号筛）约0.5 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加甲醇10 mL，超声（功率为400 W）处理20 min，然后以8 000 r/min离心10 min，取上清液。

沉淀物再加甲醇10 mL，同法超声处理并离心1次。

合并2次上清液并转移至25 mL量瓶中，加甲醇定容，摇匀，即得供试品溶液①。

精密称定复方荆芥颗粒5.0 g，研磨后，置于具塞锥形瓶中，其余与荆芥饮片同法操作，即得供试品溶液②。

2.1.3 基质溶液按处方比例称取复方荆芥颗粒的辅料（糊精和糖粉），同“2.1.2”项下“供试品溶液②”方法操作，即得基质溶液。

2.2 色谱条件
色谱柱为Hypersil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流动相为甲醇（A）-0.3%磷酸溶液（B），梯度洗脱（0～8 min，60%A→65%A，8～18 min，65%A→70%A，18～19 min，70%A→60%A）;流速为1.0 mL/min;检测波长为252 nm;柱温为25 ℃;进样量为20 μL。

2.3 HF-LPME样品前处理方法
先将中空纤维剪成长约7 cm的小段，依次用丙酮、甲醇、水超声（功率为400 W）清洗10 min，去除纤维表面及管腔内的杂质后，于室温下自然晾干，备用。

按照各项实验要求取规定质量浓度的对照品溶液或供试品溶液70 μL，以一定浓度的盐溶液稀释至7 mL，得到一定pH的样品相溶液。

把处理好的中空纤维浸泡于萃取剂中，至纤维壁孔充满萃取剂后，取出，擦去纤维外表面多余的萃取剂，并用萃取剂将管腔注满，两端封口，弯成“U”型，然后浸入上述样品相溶液中，于室温下以一定转速搅拌萃取一定时间。

萃取结束后，将纤维管内的萃取剂转移到EP管中，用甲醇40 μL冲洗纤维内壁，将冲洗液与EP管中的萃取剂合并，涡旋30 s，混匀后，按“2.2”项下色谱条件进样分析。

HF-LPME-HPLC法测定胡薄荷酮含量的操作流程示意图见图1。

KEYWORDS Hollow fiber liquid-phase microextraction; HPLC; Central composite design-response surface methodology; Pulegone; Schizonepetae tenuifolia decoction piece; Compound pregaration
荆芥为唇形科植物荆芥Schizonepeta tenuifolia Briq.的干燥地上部分，性微温、味辛[1]。

现代药理研究表明，荆芥主要具有抗病毒、抗炎、镇痛、抗肿瘤、调节免疫、抗菌、止血等作
用，且常被加入到具有清热解毒功效的中药复方制剂中[2]。

荆芥的主要有效成分为胡薄荷酮，其可降低白细胞介素1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、γ干扰素（IFN-γ）等炎性细胞因子水平，具有较强的抗炎作用[3-4]。

目前，胡薄荷酮常用的定量分析方法为高效液相色谱法（HPLC）和气相色谱法[5-6]。

对于荆芥饮片及成分更为复杂的复方制剂而言，测定其中胡薄荷酮的含量时，需先进行样品的前处理，而采用传统的液液萃取法进行前处理存在有机溶剂用量大、提取耗时长、操作繁琐、对仪器灵敏度要求相对较高等不足[6-7]。

因此，建立一种操作简便、纯化与富集能力强的样品前处理方法是很有必要的。

近年来，中空纤维液相微萃取（HF-LPME）技术因适用于复杂样品的萃取、浓缩、纯化而得以广泛应用[8-9]。

中空纤维是一种中空、多孔的高分子材料，无毒且具有很好的生物相容性，其微米级壁孔可使小分子化合物自由通过。

中空纤维不仅可以作为保护萃取相的载体和纯化样品的过滤器，克服单滴液相微萃取液滴不稳定、分散液相微萃取纯化效果差和重现性差等缺点，而且还有助于分析物的富集[10-13]。

目前，尚未有研究采用HF-LPME技术结合HPLC 法对荆芥饮片及其复方制剂中胡薄荷酮进行分离、富集和定量分析。

鉴于此，本研究以荆芥饮片和本实验室自制的复方荆芥颗粒为检测样品，在单因素实验的基础上，结合中心组合设计-响应面法优化胡薄荷酮的HF-LPME条件，并建立含量测定的HPLC方法，以期为荆芥饮片及其复方制剂的分析提供一种纯化能力强、操作简便的样品前处理方法和灵敏度高的含量测定方法。

1 材料
1.1 主要仪器
1200 Series型HPLC仪购自美国Agilent公司;SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵购自郑州长城科工贸有限公司;KQ-50DE型超声波清洗机购自宁波新芝生物科技股份有限公司;XS205DU型电子天平购自瑞士Mettler Toledo公司;HJ-6B型數显多头磁力恒温搅拌器购自金坛市白塔金昌实验仪器厂。

1.2 主要药品与试剂
荆芥饮片（批号分别为20170524、20180721、20190521）购自运城市神农中药材有限公司，经山西医科大学白云娥教授鉴定为唇形科植物荆芥S. tenuifolia Briq.的干燥地上部分;胡薄荷酮对照品（批号Z05J9H63054，纯度≥95%）购自上海源叶生物科技有限公司;复方荆芥颗粒（批号分别为20200908、20200909、20200910，规格为每袋10 g）由山西医科大学药学院实验室自制;聚偏氟乙烯中空纤维（内径0.5 mm，孔径0.2 μm）购自天津膜天膜科技股份有限公司;甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯或实验室常用规格，水为蒸馏水。

2 方法与结果
2.1 溶液的制备
2.1.1 对照品溶液称取胡薄荷酮对照品适量，置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，制得质量浓度为1.12 mg/mL的对照品贮备液，4 ℃下保存，备用。

临用时，按照实验所需用甲醇稀释成相应质量浓度的对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液取荆芥饮片粉末（过二号筛）约0.5 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加甲醇10 mL，超声（功率为400 W）处理20 min，然后以8 000 r/min离心10 min，取上清液。

沉淀物再加甲醇10 mL，同法超声处理并离心1次。

合并2次上清液并转移至25 mL量瓶中，加甲醇定容，摇匀，即得供试品溶液①。

精密称定复方荆芥颗粒5.0 g，研磨后，置于具塞锥形瓶中，其余与荆芥饮片同法操作，即得供试品溶液②。

2.1.3 基质溶液按处方比例称取复方荆芥颗粒的辅料（糊精和糖粉），同“2.1.2”项下“供试品溶液②”方法操作，即得基质溶液。

2.2 色谱条件
色谱柱为Hypersil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流动相为甲醇（A）-0.3%磷酸溶液（B），梯度洗脱（0～8 min，60%A→65%A，8～18 min，65%A→70%A，18～19 min，70%A→60%A）;流速为1.0 mL/min;检测波长为252 nm;柱温为25 ℃;进样量为20 μL。

2.3 HF-LPME样品前处理方法
先将中空纤维剪成长约7 cm的小段，依次用丙酮、甲醇、水超声（功率为400 W）清洗10 min，去除纤维表面及管腔内的杂质后，于室温下自然晾干，备用。

按照各项实验要求取规定质量浓度的对照品溶液或供试品溶液70 μL，以一定浓度的盐溶液稀释至7 mL，得到一定pH的样品相溶液。

把处理好的中空纤维浸泡于萃取剂中，至纤维壁孔充满萃取剂后，取出，擦去纤维外表面多余的萃取剂，并用萃取剂将管腔注满，两端封口，弯成“U”型，然后浸入上述样品相溶液中，于室温下以一定转速搅拌萃取一定时间。

萃取结束后，将纤维管内的萃取剂转移到EP管中，用甲醇40 μL冲洗纤维内壁，将冲洗液与EP管中的萃取剂合并，涡旋30 s，混匀后，按“2.2”项下色谱条件进样分析。

HF-LPME-HPLC法测定胡薄荷酮含量的操作流程示意图见图1。

KEYWORDS Hollow fiber liquid-phase microextraction; HPLC; Central composite design-response surface methodology; Pulegone; Schizonepetae tenuifolia decoction piece; Compound pregaration
荆芥为唇形科植物荆芥Schizonepeta tenuifolia Briq.的干燥地上部分，性微温、味辛[1]。

现代药理研究表明，荆芥主要具有抗病毒、抗炎、镇痛、抗肿瘤、调节免疫、抗菌、止血等作
用，且常被加入到具有清热解毒功效的中药复方制剂中[2]。

荆芥的主要有效成分为胡薄荷酮，其可降低白细胞介素1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、γ干扰素（IFN-γ）等炎性细胞因子水平，具有较强的抗炎作用[3-4]。

目前，胡薄荷酮常用的定量分析方法为高效液相色谱法（HPLC）和气相色谱法[5-6]。

对于荆芥饮片及成分更为复杂的复方制剂而言，测定其中胡薄荷酮的含量时，需先进行样品的前处理，而采用传统的液液萃取法进行前处理存在有机溶剂用量大、提取耗时长、操作繁琐、对仪器灵敏度要求相对较高等不足[6-7]。

因此，建立一种操作简便、纯化与富集能力强的样品前处理方法是很有必要的。

近年来，中空纤维液相微萃取（HF-LPME）技术因适用于复杂样品的萃取、浓缩、纯化而得以广泛应用[8-9]。

中空纤维是一种中空、多孔的高分子材料，无毒且具有很好的生物相容性，其微米级壁孔可使小分子化合物自由通过。

中空纤维不仅可以作为保护萃取相的载体和纯化样品的过滤器，克服单滴液相微萃取液滴不稳定、分散液相微萃取纯化效果差和重现性差等缺点，而且还有助于分析物的富集[10-13]。

目前，尚未有研究采用HF-LPME技术结合HPLC 法对荆芥饮片及其复方制剂中胡薄荷酮进行分离、富集和定量分析。

鉴于此，本研究以荆芥饮片和本实验室自制的复方荆芥颗粒为检测樣品，在单因素实验的基础上，结合中心组合设计-响应面法优化胡薄荷酮的HF-LPME条件，并建立含量测定的HPLC方法，以期为荆芥饮片及其复方制剂的分析提供一种纯化能力强、操作简便的样品前处理方法和灵敏度高的含量测定方法。

1 材料
1.1 主要仪器
1200 Series型HPLC仪购自美国Agilent公司;SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵购自郑州长城科工贸有限公司;KQ-50DE型超声波清洗机购自宁波新芝生物科技股份有限公司;XS205DU型电子天平购自瑞士Mettler Toledo公司;HJ-6B型数显多头磁力恒温搅拌器购自金坛市白塔金昌实验仪器厂。

1.2 主要药品与试剂
荆芥饮片（批号分别为20170524、20180721、20190521）购自运城市神农中药材有限公司，经山西医科大学白云娥教授鉴定为唇形科植物荆芥S. tenuifolia Briq.的干燥地上部分;胡薄荷酮对照品（批号Z05J9H63054，纯度≥95%）购自上海源叶生物科技有限公司;复方荆芥颗粒（批号分别为20200908、20200909、20200910，规格为每袋10 g）由山西医科大学药学院实验室自制;聚偏氟乙烯中空纤维（内径0.5 mm，孔径0.2 μm）购自天津膜天膜科技股份有限公司;甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯或实验室常用规格，水为蒸馏水。

2 方法与结果。