病毒载体概述

病毒载体概述
引言
基因导入体系（gene delivery system）是基因治疗的焦点技巧,可分为病毒载体系统和非病毒载体系统.本章重要阐述用于人类基因治疗的病毒载体系统.
用于基因治疗的病毒载体应具备以下根本前提：
1.携带外源基因并能包装成病毒颗粒;
2.介导外源基因的转移和表达;
3.对机体不致病.
然而,大多半野生型病毒对机体都具有致病性.是以须要对其进行改革后才干用于人体.原则上,各类类型的病毒都能被改革成病毒载体.但是因为病毒的多样性及与机体庞杂的依存关系,人们至今对很多病毒的生涯周期.分子生物学.与疾病产生及成长的关系等的熟悉还很不周全,从而限制了很多病毒成长成为具有实用性的载体.近20年来,只有少数几种病毒如反转录病毒（包含HIV病毒）.腺病毒.腺病毒陪同病毒.疱疹病毒（包含单纯疱疹病毒.痘苗病毒及EB病毒）.甲病毒等被成功地改革成为基因转移载体并开展了不合程度的运用.
第一节病毒载体产生的道理
病毒载体的产生树立在对病毒的生涯周期和分子生物学熟悉的基本之上.研讨病毒载体起首要对病毒的基因组构造和功效有充分的懂得,最好能获得病毒基因组全序列信息.病毒基因组可分为编码区和非编码区.编码区基因产生病毒的构造蛋白和非构造蛋白;根据其对病毒沾染性复制的影响,又可分为必
须基因和非必须基因.非编码区中含有病毒进行复制和包装等功效所必须的顺式感化元件.
各类野生型病毒颗粒都具有必定的包装容量,即对所包装的病毒基因组的长度有必定的限制.一般来说,病毒包装容量不超出自身基因组大小的105～110％.
基因重组技巧的成长使病毒载体的产生成为可能.最简略的做法是,将恰当长度的外源DNA拔出病毒基因组的非必须区,包装成重组病毒颗粒.比方,本实验室曾将4.5kb的lacZ基因表达盒（CMV-lacZ-polyA）拔出HSV1病毒的UL44（糖蛋白C）基因的XbaI位点中,病毒基因组的其余部分不转变,构建成重组病毒HSV1-lacZ100（吴小兵等,1998）.因为UL44基因产品对于HSV病毒在造就细胞中产毒性沾染长短必须的,是以,该重组病毒可以在细胞中增殖传代.用这种重组病毒沾染细胞,能将lacZ基因带入细胞并高效表达.用同样的办法,将AAV-2病毒的rep和cap基因片断（4.3kb）拔出HSV1病毒的UL2（编码尿嘧啶DNA糖基化酶）或UL44（编码糖蛋白C）基因中,构建成具有供给重组AAV载体复制和包装所需的全体帮助功效的帮助病毒rHSV-rc（伍志坚等,1999）.
然而,如许的重组病毒作为基因转移载体有很多缺点.起首,很多野生型病毒经由过程在细胞中产毒性复制而导致细胞裂解逝世亡;或带有病毒癌基因而使细胞产生转化.是以必须经由改革使其成为复制缺点性病毒并且删除致癌基因后才干用于基因治疗.其次,拔出外源DNA的长度受到很大限制,尤其对于基因组本身较小的病毒如腺病毒陪同病毒（AAV,4.7kb）.反转录病毒（8～
10kb）.腺病毒（36kb）,假如不去除病毒基因,可供外源DNA拔出的容量就十
分小.是以,必须删除更多的病毒基因以腾出地位拔出较大的外源DNA. 为了
增长病毒载体拔出外源DNA的容量,除了可以删除病毒的非必须基因外,还可以进一步删去部分或全体必须基因,这些必须基因的功效由帮助病毒或包装细胞系反式供给.
病毒载体大体上可分为两种类型：
重组型病毒载体：这类载体是以完全的病毒基因组为改革对象.一般的步调是选择性地删除病毒的某些必须基因尤其是立早基因或早期基因,或掌握其表达;缺掉的必须基因的功效由互补细胞反式供给;用外源基因表达单位替代病毒非必须基因区;病毒复制和包装所需的顺式感化元件不变.这类载体一般经由过程同源重组办法将外源基因表达单位拔出病毒基因组中.如在传统的重组腺病毒构建办法中,将外源基因表达盒（exogenous gene expression cassette）拔出穿梭质粒（如pXCX2或pFGdX1）的腺病毒同源序列中,与帮
助质粒（含有腺病毒基因组的质粒如JM17或pBHG）共转染293细胞,通细致胞内的同源重组获得含有外源基因的重组腺病毒（Graham FL and Prevec L 1995）.
无病毒基因的病毒载体（gutless vectors）：这类载体在不合的病毒载体系统中的称谓不合.对于腺病毒,一般称为mini-Ad;在HSV载体系统,一般
称为扩增子（amplicon）载体或质粒型载体.重组AAV载体也属于无病毒基因的病毒载体.这类载体系统往往由载体质粒和帮助体系构成.重组载体质粒重要由外源基因表达盒.病毒复制和包装所必须的顺式感化元件及质粒骨架构成.帮助体系包含病毒复制和包装所必须的所有反式感化元件.在帮助体系的感化下,重组载体质粒（包含或不包含质粒骨架）以特定情势（单链或双链,DNA
第二节病毒载体的包装体系
将外源基因包装到病毒壳粒中,是病毒载体临盆的焦点技巧.一般地,病毒载体的制备包含以下要素：
宿主细胞
固然如今已有可能对有些病毒载体（如AAV载体）进行体外（无细胞）包装（Zhou XH et al . 1998; Ding L et al. 1997）,但是这种包装体系仍然须要细胞提取物,并且包装效力相当低,远远达不到可临盆程度.至今为止,病毒载体的包装主如果在对该病毒迟钝的宿主细胞中进行的.宿主细胞不单供
给了病毒复制和包装的情形前提,很多细胞成分还直接介入了病毒复制和包装的进程.
病毒复制和包装所必须的顺式感化元件和外源基因的表达盒
一般地,病毒复制和包装所必须的顺式感化元件和外源基因的表达盒由细菌质粒携带,构成病毒载体质粒,是被包装的对象.因为病毒复制方法的不合,有些病毒载体如单纯疱疹病毒扩增子（HSV amplicon）载体在包装时,全部载体质粒都被包装进入病毒颗粒中;而有些病毒载体如反转录病毒.腺病毒陪同病毒载体的质粒骨架部分其实不被包装到病毒颗粒中,只有病毒复制和包装所必须的顺式感化元件和外源基因表达盒被包装到病毒颗粒中.
构建重组型病毒载体时,病毒复制和包装所需的顺式感化元件消失于病毒基因组中（病毒基因组可以由具有沾染性的病毒颗粒供给,也可以质粒情势供给）.先将外源基因表达盒拔出穿梭质粒携带的病毒同源序列中;将重组穿梭质粒转染至细胞中,再用帮助病毒超沾染;或将重组穿梭质粒与病毒基因组质粒共转染细胞;重组质粒与病毒基因组在细胞中进行同源重组而产生表达外源基因的重组病毒. 重组腺病毒（Graham FL and Prevec L 1995）和重组单纯疱疹病毒（Pyles RB et al. 1997;Kramm CM et al. 1997）的传统制备办法都是采取这种方法.
为了使病毒载体的临盆更为便利,病毒复制和包装所必须的顺式感化元件和外源基因的表达盒除了可以用质粒携带以外,也可以用另一种病毒（往往是帮助病毒）或临盆细胞来携带.
帮助元件
包含病毒复制和包装所必须的所有反式感化元件.这些元件一般包含病毒基因转录调控基因.病毒DNA合成和包装所需的各类酶类的基因.病毒的外壳蛋白基因等.帮助元件的表示情势可以多种多样.经常运用的情势有：
①帮助质粒（helper plasmid）,如用于产生重组腺病毒的质粒JM17,用于重组AAV包装的帮助质粒pAAV/Ad（Rolling F and Samulski J 1995）等;
②帮助病毒（helper virus）,如用于HSV 扩增子载体包装的帮助病毒HSV1 tsK株;
③包装细胞系如用于反转录病毒载体包装的PA317细胞.
这些表示情势之间可以互相转化或归并.例如,帮助病毒可以转化为帮助质粒：传统的AAV载体临盆体系经常运用腺病毒作为帮助病毒.研讨发明,并不是腺病毒的所有基因对AAV病毒的产生都是必须的,只须要腺病毒E1a,
E1b, E2a, E4和VA RNA 5种基因就行了.是以,将这5种基因置于同一个质粒中,构建成的这种新的帮助质粒就完全可以替代本来的帮助病毒（Xiao X et al. 1998; Grimm D et al. 1998 ）,不单进步了包装效力,并且防止了产品中腺病毒污染的问题.
上述几种要素的不合组合,便产生了各类各样的病毒载体包装计谋.根据病毒载体临盆体系的构成身分的若干,可将其分成以下几种：
单构成身分临盆体系（one-component system）：
所有的构成成分都分散在临盆细胞中.经典的反转录病毒临盆体系就是由产病毒细胞（VPC）构成,重组反转录病毒由VPC细胞不竭排泄至造就上清中.这种临盆体系操纵最为简略,但是往往产量不高或不稳固.采取这种计谋,须要
将重组病毒产生所须要的所有元件都稳固地置于临盆细胞中.因为很多病毒基因产品本身对细胞有损坏感化或不克不及在细胞中稳固表达,是以这种计谋在很多病毒载体的临盆中难以实行.
双构成身分临盆体系（two-component system）
这种临盆系同一般由"一株病毒/一株细胞"构成.典范的例子是重组腺病毒临盆体系.先用共转染的办法获得重组腺病毒毒种,再由该毒种和临盆细胞（如293细胞）构成一个双构成身分的临盆体系使病毒大量扩增.
多构成身分临盆体系（multi-component system）
是由两种以上的构成身分构成的临盆体系.传统的AAV载体临盆体系就是由载体质粒,帮助质粒,帮助病毒和临盆细胞4种身分构成.这种计谋的缺点是影响身分多,操纵庞杂,产量不轻易稳固,晦气于大范围临盆. 以上各类临盆体系也可以互相转化.我们实验室经由过程将上述AAV载体临盆体系的4种身分进行两两归并,即将帮助质粒和帮助病毒归并成一种重组的帮助病毒,将载体质粒和临盆细胞归并成AAV前病毒细胞株,成功地将其转化成一种双构成身分的新型高效临盆体系（伍志坚等,1999）.
一般来说,成长新的包装计谋主如果为了以下几种目标：
（1）削减临盆体系中的构成身分,简化操纵进程;
（2）进步临盆效力,下降临盆成本;
（3）防止或下降野生型病毒的产生;
（4）防止运用难以与产品病毒分别的帮助病毒.
第三节病毒载体的纯化办法
重组病毒的纯化与基因工程产品的纯化既有很多共性,又有明显的不合之处.病毒可以看作是一个具有特定构造的生物大分子,一般都由位于中间的核酸和包裹于其外的蛋白外壳构成.有些病毒还具有脂质膜和糖蛋白或糖脂.很多分别纯化蛋白质的办法如离心和梯度离心.盐析.柱层析.超滤.透析等办法都可用于病毒的纯化.然而,因为病毒构造的庞杂性,纯化时不克不及采取蛋白质变性和复性的办法,因为一旦病毒蛋鹤产生变性,或病毒构造产生损坏,在体外就很难再重建成有沾染性的病毒颗粒.是以,在病毒的纯化进程中必须保持病毒的构造不受损坏,并且监测其沾染活性.
病毒的纯化一般分为以下几个步调：
初始物（start material）的收集或制备
根据病毒产生方法的不合而采纳不合的方法.对于不导致细胞病变和逝世亡的病毒如反转录病毒,可不竭收集产毒细胞（VPC细胞）的造就上清作为初始物;对于在临盆病毒进程中宿主细胞产生病变和逝世亡的病毒如腺病毒,在病毒产生达到岑岭时,收集造就上清,并裂解细胞以释放细胞内的病毒.
造就上清和细胞裂解液都可作为纯化的初始物.在实验室的小范围制备中,往往采取将造就上清与细胞一路反复冻融3～4次的办法制备细胞裂解液作为初始物.对于初始物体积大于500ml的较大范围的制备,则须要斟酌采取不合初始物的损益率.假如收集时大部分（90％以上）目标病毒仍消失于细胞中,为了削减操纵大体积初始物带来的便利,可以斟酌废弃上清中含有的目标病毒,而经由过程低速离心收集细胞,重悬于较小体积的缓冲液中进行细胞裂解制备细胞裂解液.对于腺病毒和AAV病毒的大范围制备都可以采取这种方法.假如
经由过程延伸造就时光可以使大部分的目标病毒释放到造就液中,也可以只收集造就上清而弃去细胞,从而省去反复冻融的步调.
除了用反复冻融办法裂解细胞外,还可以根据目标病毒的生物学性质采取其它不影响其沾染性的办法,如超声法.化学法（如在AAV病毒制备顶用脱氧胆酸或氯仿）等.
初始物的浓缩
当初始物体积较大时,要斟酌对其进行浓缩后再分别纯化.浓缩时最好同时能获得初步纯化对于后果. 在不影响目标病毒的沾染性的前提下,可选用盐析.超滤.透析等办法进行浓缩.盐析法不但可以用来浓缩初始物,同时也能达到必定的分别纯化后果.最经常运用的盐是硫酸铵;很多病毒如腺病毒.AAV病毒和单纯疱疹病毒用聚乙二醇/氯化钠体系沉淀可获得很好的后果并且不影响病毒的沾染性.
目标病毒的分别纯化
氯化铯密度梯度离心法至今仍是分别纯化各类病毒的最经常运用办法.主如果根据不合病毒具有特点性的浮力密度,使其与细胞裂解液中的其它成分分别开来.收集到目标病毒特异的组分后,用透析法除去个中的氯化铯,获得纯化的病毒.用这种办法有时可获得极高纯度的病毒.今朝在临床实验中运用的重组腺病毒大都是用这种办法进行纯化的.然而,这种办法也消失明显的弊病,主如果费时且操纵难度较大,反复性较差;并且氯化铯对人体有毒性.是以跟着基因治疗研讨和运用的成长,用这种办法纯化的重组病毒可能不克不及顺应人体内运用的请求.
第五节安然性检测
总的来说,病毒载体系体例剂的安然性检测重要涉及以下几个方面（Aderson RW 1996）：
有复制才能的病毒（replication competent virus, RCV）
RCV一般产生于重组病毒临盆进程中基因重组事宜.因为RCV具有复制才能,在临盆进程中一旦消失,就可能呈现优势发展,从而影响载体病毒的产量;别的,含有RCV的成品用于人体内可能导致轻微的病毒沾染或急性/慢性病毒血症.
RCV是对用于基因治疗的病毒载体系体例剂安然性检测的特有项目.检测RCV的办法因不合的病毒载体而异.对于反转录病毒载体,检测有复制才能的反转录病毒（RCR）的办法主如果PG4 S+L- 剖析法;也可采取其它的变通办法.对于腺病毒载体,检测有复制才能的腺病毒（RCA）重要采取空斑剖析办法及PCR办法.
帮助病毒
对于临盆进程须要帮助病毒介入的病毒载体如AAV病毒载体,因为这些帮助病毒本身具有复制才能并对机体细胞有损坏性,是以检测病毒制剂中的帮助病毒如腺病毒或单纯疱疹病毒的残存量十分重要.
其它成分的污染
检测指标包含细菌.霉菌.支原体.内毒素等及在纯化进程中所用试剂如氯化铯等的残存量.
第六节病毒载体的成长偏向
基因治疗研讨的快速成长对基因导入体系提出了越来越高的请求.病毒载体的成长也日新月异,包含对已有病毒载体的不竭改良和完美,和越来越多的其它病毒被改革成为新的病毒载体.病毒载体的成长偏向可归纳成以下几个方面：
轻便.高效的病毒载体包装体系：斟酌到包装的高效性和操纵的轻便性,越来越多的病毒载体临盆体系将采取双构成身分体系.这种体系轻易用于病毒载体的大范围临盆（Liu XL et al.1999; Conway JE et al. 1999 ）.
无病毒基因的病毒载体（gutless viral vector）：去除病毒载体中所有的病毒基因,只保存其复制和包装所必须的顺式感化元件,是病毒载体的重要成长偏向.这种计谋可最大限度地扩展载体的容量和削减病毒对细胞的直接毒性和病毒蛋白表达引起的免疫毒性. 腺病毒的微载体（mini-Ad）.AAV载体.HSV扩增子载体都是无病毒基因的病毒载体.这一成长偏向须要解决的重要问题是树立高效.安然（无帮助病毒污染）的包装体系.
可调控表达外源基因的病毒载体：在很多疾病的基因治疗中,实现外源基因的可调控表达十分重要.如糖尿病的基因治疗,外源的胰岛素基因的表达最好能受血糖程度的调控;肾性贫血的基因治疗,EPO基因的表达最好能受血氧含量的调控等.今朝所研讨的表达调控体系重要包含各类药物引诱的表达"开关".个中四环素掌握体系（Tet-on和Tet-off）是人工设计的一种基因表达调控模式.这个体系在体外和动物体内实验中都表示出优越的表达调控感化（Fotaki ME et al.1997; Miller N and Whelan J 1997）.然而,因为个中
的反式感化蛋白（tTA或rtTA）是异种蛋白,在机体内可能引起毒性感化和免疫反响,是以用于人体前还需斟酌其安然性和长期有用性.
比来Binley K等（1999）报导了用缺氧反响元件（hypoxia response element ,HRE）腺病毒载体中外源基因的表达.缺氧可激活bHLH/PAS 家族转录因子的表达,它们可结合HRE焦点序列上,诱发其下流基因的表达.
自我扩增型载体（self-amplifying vector）（Herweijer H and Wolff JA 1997）：今朝的基因转移办法基因转移的效力仍相对较低,尤其是在体内.为了进步外源基因表达总程度,除了进步基因转移效力外,另一种办法是尽量进步外源DNA在细胞中的表达程度.用自我扩增型的表达载体是达到此目标的办法之一.这些载体是以正链RNA病毒Sindbis病毒和Semliki Forest 病毒为基本的.用目标基因代替病毒的外壳蛋白编码序列,导入靶细胞中,病毒的复制蛋白大量复制重组的基因组,mRNA程度的大量增长导致高程度的转导基因
表达.自我扩增型载体的表示情势可所以RNA,DNA和重组病毒.
特异性复制型性病毒载体（specifically replicating vector）：指可在某种特点的组织中产毒性复制,而在其它组织中不增殖的病毒载体.这类病毒载体重要用于特异性裂解肿瘤细胞.如腺病毒突变株Onyx-015是55Kdal
E1B基因功效缺掉的腺病毒突变株,可以选择性地在p53基因突变的肿瘤细胞中增殖,而在正常组织细胞中不增殖.用这种突变株结合化疗治疗恶性肿瘤II 期临床成果令人鼓舞（Kirn D et al. 1998）,已进入III期临床实验,从此,很多人工改革的腺病毒突变体被用于肿瘤治疗研讨中.如将腺病毒E1基因的表达用甲胎蛋白（AFP）启动子掌握,使得该病毒只能在甲胎蛋白阳性的肝癌细胞中增殖导致细胞逝世亡.也可以将这种病毒的基因组分开装在两个互补的
缺点性腺病毒载体上（Alemany R et al. 1999）,个中一个载体除了腺病毒复制和包装所必须的顺式感化元件外,只含有E1区基因,个中E1A基因的表达受AFP启动子的掌握;另一个载体为E1区缺掉的重组腺病毒.这两个载体同时沾染AFP阳性的肝癌细胞时,病毒可不竭增殖而引起细胞逝世亡;对于AFP阴性的细胞,E1A基因不表达,因而病毒不克不及增殖.相似的设计在HSV载体系统也有报导.除了用甲胎蛋白作为反式激活因子外,各类其它组织特异性表达的蛋白和调控序列都可被用来掌握病毒的增殖.
嵌合型病毒载体（hybrid viral vector）：是指将不合病毒的基因元件进行组合,形成的重组杂合病毒.如腺病毒与AAV病毒的杂合体病毒,既具有腺病毒的沾染性和基因组特点（双链线状DNA）,又具有AAV病毒的染色体整合性（Lieber A et al. 1999）.各类病毒基因元件组合形成新的杂合载体的报导层见叠出,如单纯疱疹病毒扩增子与AAV病毒杂合载体（Johnston KM et al. 1997）.腺病毒与EB病毒复制子杂合载体（Tan BT et al. 1999）腺病毒与反转录病毒杂合载体（Caplen NJ et al. 1999）等,不一而足.这些杂合载体使重组病毒的特点多样化,以顺应不合基因转移目标的须要.
靶向性病毒载体（targeted viral vector）：是指能特异性地结归并沾染某种细胞的病毒载体.靶向性病毒载体的产生重要有两种办法.一种办法是将病毒颗粒与某一靶向分子（Harari OA et al.1999 ）或特异性抗体（Bartlett JS et al. 1999）偶联;另一种办法是经由过程转变病毒外壳蛋白的构造,使其对细胞的亲嗜性产生转变（Reynolds P et al.
1999;Krasnykh VN et al. 1996 ）.
用各类其它病毒构成新型病毒载体：略.
参考文献
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