酶联免疫法检测花生样本中的黄曲霉毒素B1

酶联免疫法检测花生样本中的黄曲霉毒素B1
黄钟标;郑思珩;吴思敏;金佳佳;严家俊
【摘要】使用浓度为40％的甲醇-水对花生样本中的黄曲霉毒素B1(Aflatoxin
B1,AFB1)进行提取,再做1:5稀释,采用酶联免疫吸附法(Enzyme-linked Immunosorbent assay,ELISA)对样本中AFB1含量进行检测,并验证该方法的线性,重现性、回收率.结果表明,AFB1在2.5～75μg/kg范围内线性关系较好,线性回归方程为:y=-0.507x+0.413,相关系数R2=0.999.重现性实验所得的相对标准偏差(RSD％)为1.56％,不同加标实验的加标回收率均大于97％,相对标准偏差(RSD％)分别为2.07％、3.73％、4.85％.本方法重现性好,准确度高,适用于高效的定量检测花生样本中的AFB1含量.
【期刊名称】《广州化工》
【年(卷),期】2019(047)009
【总页数】3页(P124-125,136)
【关键词】酶联免疫法;黄曲霉毒素B1;花生样品
【作者】黄钟标;郑思珩;吴思敏;金佳佳;严家俊
【作者单位】广东产品质量监督检验研究院, 广东佛山 528300;国家酒类检测重点实验室(广东) , 广东广州 510730;广东产品质量监督检验研究院, 广东佛山528300;广东产品质量监督检验研究院, 广东佛山 528300;广东产品质量监督检验研究院, 广东佛山 528300
【正文语种】中文
【中图分类】TS201.6
黄曲霉毒素B1(AFB1)是目前已发现的黄曲霉毒素中毒性最强的一种，其具有强肝毒性、高致突变性和高致畸性。

广泛存在于农产品及饲料食品中，其中以花生、玉米污染尤为严重[1-2]。

我国作为粮食产业大国，受饮食习惯影响，对花生的需求
量远高于西方国家[3]。

日常生活中花生的使用量较大，因此建立一种高效快速检
测花生样本中AFB1的检测方法显得尤为重要。

目前，国内外检测AFB1的方法主要有：高效液相色谱法[4-5]、液相色谱-质谱联用法[6-7]、薄层层析法[8-11]和酶联免疫吸附法等[12-13]。

薄层层析法对黄曲霉毒素检测的灵敏度较低，操作过程比较繁琐，且实验过程需大量接触到有机试剂和毒素标准品，严重威胁实验员的身体健康，并不适用于检测大量的样品。

液相色谱法其缺点在于实验所使用的仪器较为昂贵，需要专业技术人员进行操作，不利于大规模的应用。

而酶联免疫法具有灵敏度高、特异性强，且无需接触标准物质，不会危害实验人员的身体健康等优点，现已广泛应用于各个领域的检测中[14-16]。

1 实验
1.1 试剂与仪器
黄曲霉毒素B1 ELISA快速检测试剂盒，北京华安麦科生物技术有限公司；黄曲霉毒素B1标准品，美国sigma公司；黄曲霉毒素B1阴性质控样品，中国检科院；甲醇(分析纯)、去离子水。

无菌离心管(50 mL)；移液器；MULTISKAN MK3 酶标仪；Thermo高速离心机；G&G 电子天平；涡旋振荡器。

1.2 实验方法
1.2.1 样品前处理
称取5.0 g粉碎后待测样品于50 mL离心管中，加入25 mL浓度为40%甲醇的甲
醇，于涡旋振荡器上振荡10 min。

离心(4000 r/min，5 min)，取离心后上清液1 mL加入4 mL去离子水。

混匀备用。

1.2.2 AFB1含量的测定
将所需酶联免疫试剂盒从冷藏环境中取出，置于室温(20～25 ℃)平衡1 h以上，取出所需要数量的微孔板。

将标准品和样品按序编号，并记录标准品孔和样品孔的位置。

加入50 μL 标准品和样品于对应微孔中，加入50 μL酶标物，振荡混匀，用盖板膜盖板后置于25 ℃避光反应15 min。

将孔内液体甩干，用洗涤液250 μL 每孔充分洗涤4次，于吸水纸上拍干。

每孔中加入100 μL底物液，用盖板膜盖板后于25 ℃反应5 min。

加入终止液，振荡混匀后，于酶标仪(双波长450/630 nm)检测，测定每孔OD值。

1.2.3 标准曲线的绘制与计算
以标准品的百分吸光率为纵坐标，标准品浓度的对数为横坐标，绘制标准曲线。

将样本的百分吸光率代入标准曲线中，计算出样本所对应的浓度。

1.2.4 精密度实验
取相同的花生样品，按试剂盒检测方法，按上述检测方法测定6次，计算RSD。

1.2.5 回收率实验
选取阴性花生样品，分别添加10 μg/kg、20 μg/kg、30 μg/kg三个不同浓度的标准品溶液，按上述检测方法，每个样品平行测定后，计算平均回收率和RSD。

2 结果与讨论
2.1 标准曲线
以标准品的百分吸光率为纵坐标，标准品浓度的对数为横坐标，绘制标准曲线。

结果如图1所示。

图1AFB1标准曲线Fig.1 The curve of AFB1 standard
由图1可知，AFB1在2.5～75 μg/kg范围内线性关系较好，线性回归方程为：
y=-0.507x+0.413，相关系数R2=0.999。

2.2 重现性实验
由表1可知，样品的相对标准偏差RSD为1.56%，RSD<5%，说明该方法检测AFB1的随机误差较小，具有较好的精密度和重现性。

表1 精密度实验结果Table 1The results of precision test
2.3 回收率实验
由表2可知，样品的加标回收率平均值均大于97%，RSD分别为2.07%、3.73%、4.85%。

表明该方法准确可靠，适用于花生样品中AFB1的定量检测。

表2 样品加标回收实验结果Table 2The results of sample recovery
3 结论
本研究采用酶联免疫法检测花生样品中的黄曲霉毒素B1，结果表明，AFB1在
2.5～75 μg/kg范围内线性关系较好，线性回归方程为：y=-0.507x+0.413，相
关系数R2=0.999。

由重现性实验结果可知，对相同花生样品的6次平行实验的相对标准偏差(RSD)为1.56%。

由加标实验可知，加标回收率均大于97%，相对标
准偏差(RSD)分别为2.07%、3.73%、4.85%。

说明该方法重现性好，准确度高，适用于花生样品中黄曲霉毒素B1的检测。

该方法在保证检测结果准确性的同时，大幅简化了实验步骤，提高了检测效率，同时也避免实验人员使用过多的有毒有害试剂，有利于实验室对花生样品中黄曲霉毒素B1的检测与研究。

参考文献
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