染色质免疫沉淀(ChIP)实验指南及技术总结

染色质免疫沉淀（ChIP）实验指南及技术总结ChIP是一项比较流行的研究转录因子（transcription factor, TF）与启动子（promoter）彼此结合的实验技术。

由于ChIP采用甲醛固定活细胞或组织的方式，所以能比较真实的反映细胞内TF与Promoter的结合情况。

这个优势是EMSA这个体外研究核酸与蛋白彼此结合的实验方式所不能比拟的。

当用甲醛处置时，彼此靠近的蛋白与蛋白，蛋白与核酸（DNA 或RNA）之间会产生共价键。

细胞内，当TF与Promoter彼此结合（生物意义上的结合）时，它们必然靠的比较近，或契合在一路，这个时候用甲醛处置，能使它们之间产生共价键。

一般ChIP的流程是：甲醛处置细胞——搜集细胞，超声破碎——加入目的蛋白的抗体，与靶蛋白-DNA复合物彼此结合——加入Protein A，结合抗体-靶蛋白-DNA复合物，并沉淀——对沉淀下来的复合物进行清洗，除去一些非特异性结合——洗脱，取得富集的靶蛋白-DNA复合物——解交联，纯化富集的DNA-片断——PCR分析。

在PCR分析这一块，比较传统的做法是半定量－PCR。

可是此刻随着荧光定量PCR的普及，大家也愈来愈偏向于Q－PCR了。

另外还有一些由ChIP衍生出来的方式。

例如RIP （其实就是用ChIP的方式研究细胞内蛋白与RNA的彼此结合，具体方式和ChIP差不多，只是实验进程中要注意避免RNase，最后分析的时候需要先将RNA逆转录成为cDNA）；还有ChIP-chip（其实就是ChIP富集取得的DNA-片段，拿去做芯片分析，做法在ChIP的基础上有所改变，不同的公司有不同的做法，要按照公司的要求来准备样品）。

第一天：
（一）、细胞的甲醛交联与超声破碎。

一、掏出1平皿细胞（10cm平皿），加入243ul 37％甲醛，使得甲醛的终浓度为1％。

（培育基共有9ml）
二、37摄氏度孵育10min。

3、终止交联：加甘氨酸至终浓度为0.125M。

450ul 2.5M甘氨酸于平皿中。

混匀后，在室温下放置5min即可。

4、吸尽培育基，用冰凉的PBS清洗细胞2次。

五、细胞刮刀搜集细胞于15ml离心管中（PBS依次为5ml，3ml和3ml）。

预冷后2000rpm 5min搜集细胞。

六、倒去上清。

依照细胞量，加入SDS Lysis Buffer。

使得细胞终浓度为每200ul含2×106个细胞。

这样每100ul溶液含1×106个细胞。

再加入蛋白酶抑制剂复合物。

假设MCF7长满板为5×106个细胞。

本次细胞长得约为80％。

即为4×106个细胞。

因此每管加入400ul SDS Lysis Buffer。

将2管混在一路，共800ul。

7、超声破碎：VCX750，25％功率，冲击，9S间隙。

共14次。

（二）、除杂及抗体哺育。

八、超声破碎结束后，10，000g 4度离心10min。

去除不溶物质。

留取300ul做实验，其余保留于－80度。

300ul中，100ul加抗体做为实验组；100ul不加抗体做为对照组；100ul加入4ul 5M NaCl （NaCl终浓度为0.2M），65度处置4h解交联，跑电泳，检测超声破碎的效果。

九、在100ul的超声破碎产物中，加入900ul ChIP Dilution Buffer和20ul的50×PIC。

再各加入60ul Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA。

4度颠转混匀1h。

10、1h后，在4度静置10min沉淀，700rpm离心1min。

1一、取上清。

各留取20ul做为input。

一管中加入1ul 抗体，另一管中则不加抗体。

4
度颠转留宿。

（三）、查验超声破碎的效果。

取100ul超声破碎后产物，加入4ul 5M NaCl，65度处置4h解交联。

分出一半用酚/氯仿抽提。

电泳检测超声效果。

第二天：
（一）、免疫复合物的沉淀及清洗。

1二、孵育留宿后，每管中加入60ul Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA。

4度颠转2h。

13、4度静置10min后，700rpm离心1min。

除去上清。

14、依次用下列溶液清洗沉淀复合物。

清洗的步骤：加入溶液，在4度颠转10min，4度静置10min沉淀，700rpm离心1min，除去上清。

洗涤溶液：a. low salt wash buffer—-one wash
b. high salt wash buffer—–one wash
c. LiCl wash buffer——one wash
d. TE buffer——two wash
1五、清洗完毕后，开始洗脱。

洗脱液的配方：100ul 10％SDS，100ul 1M NaHCO3，800ul ddH2O，共1ml。

每管加入250ul洗脱buffer，室温下颠转15min，静置离心后，搜集上清。

重复洗涤一次。

最终的洗脱液为每管500ul。

1六、解交联：每管中加入20ul 5M NaCl（NaCl终浓度为0.2M）。

混匀，65度解交联留宿。

第三天：
（一）、DNA样品的回收
17、解交联结束后，每管加入1ul RNaseA（MBI），37度孵育1h。

1八、每管加入10ul 0.5M EDTA，20ul 1M （PH ），2ul 10mg/ml 蛋白酶K。

45度处置2h。

1九、DNA-片段的回收―――omega胶回收试剂盒。

最终的样品溶于100ul ddH2O。

（二）、PCR分析
二、技术总结
（一）、关于细胞
细胞的生长状态要好。

因为细胞的生长状态直接影响细胞内部的基因表达调控网络，也很有可能影响你所研究的TF与其靶Promoter的结合。

一般细胞长到75％－80％比较好。

（二）、关于抗体！
抗体是实验成败的致命因素之一！必需是IP级别的抗体，另外若是经济条件许可的话，尽可能买大厂的抗体。

不推荐国产抗体和santa cruz的抗体，即即是IP级别的。

单抗与多抗的选择也需要仔细考虑。

两种抗体各有利弊。

单抗特异性强，背景低。

可是单抗有一个致命的弱点，就是识别位点单一，而在ChIP甲醛交联的进程中，很有可能该位点被其它蛋白或核酸结合而被封锁，致使单抗不能识别靶蛋白。

多抗虽然没有这个问题，可是多抗特异性较差，背景可能会偏高。

一般而言，若是没有十足把握（单抗的识别位点远离靶蛋白与核酸结合的区域），选择多抗比较稳妥一些。

（三）、关于交联与超声破碎！
这一块的确是ChIP实验中比较难把握的部份。

交联的程度会影响到超声破碎的效果，交联的程度越高，超声破碎就越不易把基因组打坏成小片段。

交联不充分，只有一部份靶蛋白与其Promoter相结合，富集取得的Promoter的量不高，实验假阴性。

交联过充分，基因组上结合了太多的蛋白，对超声破碎造成障碍。

另外也会增加背景。

一般来讲，依照我的经验，交联条件取决于细胞类型。

不同的细胞系，交联的条件也不一样。

例如：NIH－3T3的交联条件是室温（25摄氏度）下15min，1％的甲醛浓度，而别的细胞系则可能完全不一样。

而超声破碎的条件，机械不一样，条件也不一样。

固然若是你有bioruptor这样的神器，那么超声破碎对你而言就是小菜一碟了。

一般，理想的超声破碎取得的片段大小是200bp－1000bp。

可是200bp－2000bp的范围也是可以接受的。

（四）、关于操作
希望尽可能的维持低温（4度）。

沉淀的时候可以先在4度放置一会，等它自然沉降一些，再超低转速（500rpm等）离心使其完全沉降。

虽说明书上说ChIP实验的进程中有几个可以停顿的地方，我仍是希望你能够持续把它做完，直到PCR结果出来为止。

尽可能避免实验中不可预知的影响因素。

（五）、关于解交联
虽说明书上说4小时已经足够，可是我仍是希望你可以解交联留宿。

因为在那样的环境里，DNA不会降解，留宿解交联更充分些。

只是不要忘记在EP管口封上封口膜。

（六）、关于DNA-片段的回收
需要注意的是：样品中SDS样品较高，普通的PCR产物回收试剂盒回收，很有可能会在最终的样品中混入SDS，影响PCR实验结果。

小Tip：过柱前，在样品中加入必然量的异丙醇，能有效的消除SDS沉淀。

染色质免疫沉淀（ChIP）实验中应注意的细节问题本文来自互联网搜索，仅供参考利用，最好实验条件需要自己试探：
一、cell counting：尽可能做到准确，会影响input结果。

二、cross link：甲醛的终浓度是1%，这个大体所有的protocol上都会强调。

3、resuspend cells with SDS:必然要选用小的tip头，在液面下吹打，不然很容易产生气泡，后面的sonication就麻烦了。

4、sonication：ChIP中最重要的一部份，适合的条件要自己试探，可以一次尝试不同次数的sonication，然后建议采用EZ-ChIP上推荐的方式看看sonication的效果如何。

五、加入salmon sperm DNA/Protein A or G之前要先混匀，因为salmon sperm DNA是很粘稠的物质，若不混匀，后面你会发现beads的量不一样，自然也会影响实验的结果。

六、wash 的时候前面几个步骤可以不用洗的太干净，但最后一个要尽可能吸干净，必要时可用gel loading tips吸。

7、含beads的samples离心时，有的protocol上推荐是1000rpm，45秒，但可以按照情况调整，但要注意转速不能太快避免beads破碎。

（固然若是采用的是magnetic的beads就不存在这个问题）
八、reverse crosslink可以是65°4个小时，也可以overnight。

九、reverse crosslink后的在进行下面步骤之前建议先离心，把蒸发到离心管盖子上的部份离下来。

10、每次行real time PCR之前都要把sample离心保证取样的准确。

1一、1~10ul的枪取3ul以上才比较准确，所以考虑好自己PCR反映体系的配置。

Upstate生物技术公司chip试剂盒英文Protocol ChIP assay: Chromatin immunoprecipitation assay was performed according to the protocol of ChIP assay kit (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY).1, For cells cultured in 2D, about 1—2×107 S1 cells were growth in 100mm dish, and were cross-linked by adding formaldehyde to final concentration of 1% and incubated in room temperature for 10 minutes. For cells growth in 3D, cells were isolated from EHS using PBS/EDTA, and also cross-linked as cells growth in 2D.
2, Wash cells twice using ice cold PBS containing protease inhibitors (1mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), 1microgram/ml aprotinin and 1microgram/ml pepstatin A). Note: Add protease inhibitors to PBS just prior to use. PMSF has a half-life of approximately 30 minutes in aqueous solutions.
3, Scrape cells into conical tube, Pellet cells for 4 minutes at 2000 rpm at 4℃.
4, Cells were washed with PBS and resuspended in ChIP lysis buffer (1% SDS, 10mM EDTA, 50 mM Tris-HCl add protease inhibitors (inhibitors: 1mM PMSF, 1microgram/ml aprotinin and 1microgram/ml pepstatin A).. After incubated 10 minutes on ice, cells were sonicated to shear DNA to lengths between 200 and 1000 basepairs being sure to keep samples ice cold.
5, Centrifuge samples (part A, step 7) for 10 minutes at 13,000 rpm at 4℃, and detected the OD260 of the lysates.
6, Sonicated lysates were then diluted to OD260 2 with ChIP dilution buffer (). 60 ul protein A-agarose beads (Upstate Catalog # 16-157) was added to sonicated lysates and rotated at 4 for one hour to reduce the non-specific dinding.
7, Pellet agarose by brief centrifugation and collect the supernatant fraction, 20ul of lystates were taken out as input control.
9, Add the immunoprecipitating antibody (the amount will vary per antibody) to the 2ml supernatant fraction and incubate 2h at 4℃with rotation. For a negative control, perform a no-antibody immunoprecipitation by incubating the supernatant fraction with 60 microliters of Salmon Sperm DNA/Protein A Agarose Slurry for one hour at 4℃with rotation.
10, Pellet agarose by gentle centrifugation (700 to 1000 rpm at 4℃, ~1min). Carefully remove the supernatant that contains unbound, non-specific DNA. Wash the protein A agarose/antibody/histone complex for 3-5 minutes on a rotating platform with 1ml of each of the buffers listed in the order as given below:
Low salt wash buffer % SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl , 150 mM NaCl); High salt wash buffer % SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl , 500 mM NaCl); LiCl buffer (0.25 M LiCl, 1% NP-40, 1% SDC, 1 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl ; TE buffer (20 mM Tris-HCl , 1 mM EDTA .
11, Elute the histone complex from the antibody by adding 250 microliter elution buffer (1%SDS, 0.1M NaHCO3) to the pelleted protein A agarose/antibody/histone complex from step 10
above. Vortex briefly to mix and incubate at room temperature for 15 minutes with rotation. Spin down agarose, and carefully transfer the supernatant fraction (eluate) to another tube and repeat elution. Combine eluates (total volume=approximately 500 microliters.)
12, Add 20 microliters 5M NaCl to the combined eluates (500 microliters) and reverse histone-DNA crosslinks by heating at 65℃for 4 hours.
Note: Include the input DNA from this step.
13, Add 10 microliters of 0.5M EDTA, 20 microliters 1M Tris-HCl, pH and 2 microliters of 10mg/ml Proteinase K to the combined eluates and incubate for one hour at 45℃.
14, Recover DNA by phenol/chloroform extraction and ethanol precipitation. Addition of an inert carrier, such as 20 micrograms glycogen, helps visualize the DNA pellet. Wash pellets with 70% ethanol and air dry.
15, Resuspend pellets in an appropriate buffer for PCR or slot-blot reactions. PCR or slot-blot conditions must be determined empirically.。