航空煤油中污染微生物的分离及初步鉴定

航空煤油中污染微生物的分离及初步鉴定
作者：张振华
来源：《科学与财富》2011年第03期
[摘要] 本文通过富集、分离纯化等方法，研究了航空煤油中污染微生物的种类并对其做初步鉴定。

研究表明：航空煤油中污染微生物的种类主要有真菌、细菌和放线菌。

[关键词] 微生物学分离鉴定航空煤油
1、引言
飞机燃油中发生微生物污染会引发一系列的问题，如某些微生物会破坏沥青、聚乙烯、聚氯乙烯、多硫化物、聚氨酯醚等涂层以及合金结构，从而造成金属结构被腐蚀，油量指示出现故障；微生物污染所造成更坏的影响在于水/油界面上微生物团簇结构的形成会造成飞机飞行过程中排气系统或燃油过滤器发生堵塞，产生灾难性后果。

2、试验
2.1 试验材料
1）样品取自于某煤油储罐及加油车不同位置的样品。

2）培养基（参见考文献[2]），真菌培养基，组成为每升含硝酸钠3g，硫酸亚铁0.01g，磷酸氢二钾1g，蔗糖30g，硫酸镁0.5g，琼脂粉13g，pH调至6.7。

细菌培养基，组成为每升含牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂粉13g，pH调至7.2左右。

放线菌培养基，组成为每升含可溶性淀粉20g，硝酸钾1g，硫酸镁0.5g，氯化钠0.5g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸铁
0.01g，琼脂粉13g，pH调至7.4。

无机盐培养基，组成为每升含煤油15mL，硫酸铵2g，柠檬酸钠1g，硫酸镁0.2g，磷酸氢二钾4g，磷酸二氢钾6g，聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯1mL，pH 调至7.0。

2.2 试验方法
1）航空煤油中微生物富集和分离（1）富集：采用唯一碳源法，即以航空煤油为碳源的无机盐培养基在121℃灭菌20min备用。

富集真菌时，加入80%的乳酸溶液数滴，以抑制细菌生长；富集放线菌时，加入苯酚溶液，以抑制细菌生长。

32℃恒温培养，待培养基变浑浊后，按10%的量移入新的培养基，重复三到四次。

（2）分离：微生物富集过后涂布，进而挑取不同的菌分离。

细菌采用平板划线分离法，真菌和放线菌采用点接法[3]。

（3）反正实验：将分离纯化得到的微生物菌株，接种到无机盐固体培养基平板上，加入灭菌煤油作为唯一碳源。

恒温培养，观察菌株能否在唯一碳源培养基上生长。

若生长，则表明该菌株为能在航空煤油中生
长的菌株；反之，则表明该菌株可能是在操作过程中的污染菌株。

将能在唯一碳源培养基上生长的菌株保存，备用。

2）菌属的鉴定菌落生长一段时间的外观形态用数码相机拍摄；显微图谱中，真菌和放线菌用石碳酸棉兰进行染色后，采用自创的透明胶带法观察菌丝及孢子。

细菌和放线菌革兰氏染色后镜检。

按照真菌鉴定手册对纯化的真菌进行初步鉴定[4-6]；将活化的细菌菌株转接到适合的培养基上，进行不同的生理生化试验，并记录实验现象。

按照伯杰氏细菌鉴定手册第八版对纯化的细菌进行鉴定[7-10]；按照放线菌鉴定手册对纯化的放线菌进行初步鉴定[11,12]
3、结果分析
试验从航空煤油中分离到23株能以煤油为唯一碳源生长的微生物，对部分菌株经初步验证结果如下。

3、1 真菌鉴定结果
1）枝孢霉菌菌株在真菌培养基上培养7天后，直径约为1.1～2.4mm；菌落低凸，背面中间凹陷，近似圆形；气生菌丝发达，菌落呈绒状深橄榄绿色；显微镜下其孢子无色，分生孢子梗无色，具有分枝、横梗，孢子串生呈球形或卵圆形。

图1、2分别表示该菌的菌落形态和孢子形态。

经初步鉴定该菌株属于子囊菌亚门枝孢菌属。

2）青霉生长7天的菌落近似圆形，直径大约30mm，表面粉棉状，并有辐射状褶皱，颜色以墨绿色为主，外圈为淡红褐色。

显微镜下观察其分生孢子梗具有副枝；前端有扫帚状分枝，帚状枝由3～4个轮生而略微散开的梗基构成；瓶梗单轮生，小梗顶端细长，分生孢子串生，形成分生孢子链；孢子近球形，大小约3.1～4.0μm×3.25～4.5μm，图3、4分别表示该菌的菌落形态和孢子形态。

经初步鉴定该菌株属于半知菌亚门，丝孢纲丝孢目中的从梗孢科，根据孢子形态特征等可将其归入青霉属。

3.2 细菌鉴定结果
对分离纯化所得菌株X1和X2做一系列生理生化实验，并观察其菌落形态和显微形态。

表1 X1和X2菌株形态及生理生化特征
注：+表示阳性；－表示阴性；[+]表示多数阳性。

按照伯杰细菌鉴定手册对所得的两株菌进行初步鉴定，得知两种菌属分别为弧菌属和假单胞菌属。

3.3 放线菌鉴定结果
对分离纯化所得的两株放线菌做生理生化实验，后经石碳酸棉兰染色显微镜鉴，观察两株菌的显微形态。

生理生化特征见表2，两株菌的菌落和显微图谱见图5～8。

根据放线菌的分类初步确定两种菌属于小单胞菌属和诺卡氏菌属。

表2 放线菌培养特征及生理生化特征
4、结论
通过对煤油样品中微生物的分离纯化，得到真菌、细菌和放线菌23种，按照真菌鉴定手册、伯杰氏细菌鉴定手册和放线菌鉴定手册，并通过菌落形态观察、个体形态观察和生理生化实验，对其进行初步鉴定。

鉴定表明：污染微生物中真菌15种，所属枝孢霉、青霉、曲霉、镰刀霉、木霉种属，其中枝孢霉菌的数量最多，生长最快，对煤油的污染最严重。

6种细菌有革兰氏阴性杆菌，阳性球菌，阴性弧菌等，其中不乏腐生类细菌如假单胞菌、芽孢杆菌等，这些菌能以包括链烷烃、芳香烃等石油类物质为碳源进行代谢生长，并产生具有腐蚀性的代谢产物。

2种放线菌属于小单胞菌属和诺卡氏菌属。

实验结果与许多现象的理论解释符合一致。

参考文献：
[1] 朱绒霞, 马艳玲等. 油田管材的SRB腐蚀[J]. 中国腐蚀与防腐学报, 2001, 21(4): 225-229
[2] 杜连祥, 路福平. 微生物学实验技术[M]. 北京: 中国轻工业出版社, 2005: 350-357
[3] 栾雨时, 包永明. 生物工程试验技术手册[M]. 北京: 化工工业出版社, 2005: 122-127。