腐败苹果中乳酸球菌的分离与鉴定

中国果菜
China Fruit &Vegetable
综合利用Comprehensive Utilization 第43卷,第4期
2023年4月
收稿日期:2022-11-14
基金项目:国家自然科学基金（31460398）；中央引导地方科技发展专项———庆阳市科技支撑项目（QNKB2-11）第一作者简介:段春燕（1984—），女，助理研究员，硕士，主要从事动物营养、
微生物降解方面研究工作腐败苹果中乳酸球菌的分离与鉴定
段春燕1，宋曦2，王淑玲2
（1.陇东学院生命科学与技术学院，甘肃庆阳745000；2.陇东学院农林科技学院，
甘肃庆阳745000）摘要:乳酸菌是健康人和动物肠道的优势菌群之一，对于维持肠道微环境的稳定与健康发挥着重要的作用。

开发和
利用乳酸菌资源，并对其进行分离鉴定和生物学特性研究，对推动乳酸菌的基础研究、开发具有应用特色的乳酸菌制品具有重要意义。

本文利用MRS 培养基（乳酸菌分离专用培养基）从腐败的苹果中分离得到乳酸菌，运用传统分离鉴定方法对其进行了形态观察、硝酸盐还原试验、葡萄糖产气试验、6.5%氯化钠耐盐性试验等，该菌株被鉴定为乳球菌属，并通过测定该菌株的生长曲线和产酸量研究其生长状况和产酸能力。

结果表明，该菌株在培养32h 时处于对数生长期，在32~38h 趋于稳定，在培养38h 后开始衰减。

产酸量在培养36h 时达到最高，为34°T ，之后趋于稳定，在38h 后产酸量开始下降。

关键词:乳酸菌；分离；鉴定；苹果中图分类号：Q935
文献标志码：A
文章编号：1008-1038(2023)04-0038-06
DOI：10.19590/ki.1008-1038.2023.04.008
Isolation and Identification of a Strain of
from Rotten Apple
DUAN Chunyan 1,SONG Xi 2,WANG Shuling 2
(1.College of Life Science and Technology,Longdong University,Qingyang 745000,China;2.College
of Agriculture and Forestry,Longdong University,Qingyang 745000,China)
Abstract:Lactic acid bacteria are one of the dominant intestinal microflora in healthy humans and animals,and play
an important role in maintaining the stability and health of the intestinal microenvironment.The development and utilization of lactic acid bacteria resources,as well as the isolation and identification of them and the study of their biological characteristics,are of great significance for promoting basic research on lactic acid bacteria and developing lactic acid bacteria products with application characteristics.In this paper,a strain of lactic acid bacteria was isolated from the rotten apple by MRS culture medium.The strain was identified by using the morphological observation,nitrate reduction test,the test of gas production of glucose and 6.5%NaCl salt tolerance test.Its growth
20世纪初，诺贝尔生理学与医学奖获得者、俄国著名科学家梅奇尼科夫注意到，经常食用酸乳的巴尔干国家的居民寿命较长，因此提出了“酸乳长寿说”[1-3]，而乳酸菌正是这类酸乳发酵食品生产中必不可少的微生物种群，其营养主要体现在对食品的发酵作用：食品原料经乳酸菌发酵后，使蛋白质、脂肪和糖类分解为人体更易吸收的预消化状态，可以提高食品的营养价值，改善食品风味，增强食品保健作用，延长食品的保存期[4-5]。

乳酸菌在发酵过程中可以产生乳糖酶，将乳糖分解成葡萄糖和半乳糖（构成脑神经系统中脑苷脂的成分），避免乳糖不耐症的发生[6-7]。

乳酸菌产生的有机酸可使pH降低，增加肠道内维生素B1、B6和B12的稳定性，并且使钙、磷等元素处于易吸收的游离状态，有利于骨骼发育，还可防治由于缺铁、缺钙引起的贫血病和软骨病等。

其菌体可为动物提供多种对其生长发育有益的物质，如维生素、氨基酸、淀粉酶、蛋白酶等消化酶类及其它促生长物质[8-9]，促进机体对蛋白质的消化、吸收，增进食欲。

目前有多种乳酸菌发酵食品，而发酵乳制品是市场上发展最为迅速的，乳酸菌饮料的市场发展更是不可小觑。

自20世纪80年代开始，我国就有乳酸菌饮料的生产，是乳制品工业发展最快的产品之一，大大超过了其他乳制品的增长率，并为进一步发展提供了巨大的潜力[10-11]。

但不可忽视的是，我国在乳酸菌产品生产中广泛采用国外的菌种，在益生菌及其发酵产品开发方面，缺乏适合我国人群生理特点的益生菌基础性研究及益生菌功能评价体系，因此有必要研究出适合中国人群生理特点的乳酸菌。

开发和利用乳酸菌资源，并对这些乳酸菌进行分离鉴定和生物学特性的研究，对推动乳酸菌的基础研究、开发具有应用特色的乳酸菌制品具有重要的现实意义。

乳酸菌的生产运用中要定期进行菌种鉴定筛选，以达到保证发酵乳质量和品质稳定性的目的，由于样品的来源不同，分离的菌种所具有的特点也不同，目前对于苹果乳酸菌的研究主要集中在苹果汁发酵菌种的选育及其产酸发酵条件的优化方面，有关从腐败苹果中筛选分离乳酸菌的研究较少，本试验从腐败苹果中分离乳酸菌并对其进行初步的生理生化鉴定，旨在为进一步开发提供理认依据，也为充分挖掘乳酸球菌资源提供参考。

1材料与方法
1.1原料
腐败苹果，为甘肃省庆阳市红富士苹果。

1.2试剂
蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、葡萄糖等购于广东中山百微生物技术有限公司；磷酸氢二钾、柠檬酸三铵、乙酸钠、七水硫酸镁、吐温-80、硫酸锰、碳酸钙、琼脂粉、氯化钠、硝酸钾、氢氧化钠、0.5%酚酞均购于浙江天杭生物科技有限公司，所有试剂均为国产分析纯。

革兰氏染色剂：（1）结晶紫染色液：将结晶紫1g完全溶于20mL95%乙醇中，然后与80mL1%草酸铵溶液混合；（2）卢戈氏碘液：2g碘化钾溶于蒸馏水中，再将1g 碘溶于碘化钾溶液，待完全溶解后，再加蒸馏水至300mL；（3）95%乙醇；（4）番红复染液：将番红0.25g溶于10mL95%的乙醇，再加90mL蒸馏水。

格里斯试剂Ⅰ：磺胺酸0.5g溶于150mL30%醋酸中。

格里斯试剂Ⅱ：-萘胺0.5g加入50mL蒸馏水中，煮沸后加入30%醋酸150mL。

1.3仪器与设备
BCD-206STPH冰箱，青岛海尔股份有限公司；JB-HS-1300U洁净工作台，苏州佳宝净化工程设备有限公司；SPX-150B生化培养箱，上海博泰试验设备有限公司；YXQ-LS-40sll立式压力蒸汽灭菌器，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；XSP-4C生物显微镜、JJ-200电子天平，上海精科有限公司；UV1700PC紫外分光光度计，上海澳西仪器有限公司；Q/IROE02-2001微量移液枪，上海求精生化试剂仪器有限公司。

curve and acid production ability of the strain was measured.The results showed that the strain was in logarithmic growth phase after32h culture,in stabilized phase after32-38h culture,beginning to decline after38h culture.
Acid production reached the highest at34°T after36h,then stabilized,and began to decline after38h.
Keywords:Lactic acid bacteria;isolation;identification;apple
综合利用段春燕，等：腐败苹果中乳酸球菌的分离与鉴定39
1.4方法
1.4.1培养基的制备
（1）基础培养基
葡萄糖1g、酵母膏1g、琼脂2g、无水乙醇3g，加蒸馏水至100mL。

加碳酸钙1.5g（165℃干燥灭菌3h）为碳酸钙基础培养基，pH=5.5。

制法：121℃灭菌20min，降温至44℃加入3%无水乙醇和1.5%碳酸钙。

（2）MRS固体培养基
准备蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母膏5g、葡萄糖20g、磷酸氢二钾5g、柠檬酸三铵2g、乙酸钠5g、七水硫酸镁0.58g、吐温-801mL、硫酸锰0.25g、碳酸钙20g、琼脂粉20g，加蒸馏水至1000mL，调pH至6.2～6.4[12]。

制法：121℃灭菌15min。

不加琼脂粉即可得到MRS 培养液。

（3）斜面保藏培养基
蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母膏5g、葡萄糖20g、磷酸氢二钾5g、柠檬酸三铵2g、乙酸钠5g、七水硫酸镁0.58g、吐温-801mL、硫酸锰0.25g、碳酸钙20g、琼脂粉20g，加蒸馏水至1000mL，调pH至6.2～6.4，121℃灭菌15min。

（4）硝酸盐还原培养基
牛肉膏5g、蛋白胨10g、氯化钠5g、硝酸钾1g，加蒸馏水至1000mL，pH=7.4[13]。

制法：121℃灭菌20min。

与格里斯试剂Ⅰ和格里斯试剂Ⅱ配用。

（5）PY基础培养基
蛋白胨0.5g、酵母膏1.0g、胰酶解酪朊0.5g、盐溶液4.0mL，加蒸馏水至100mL[14]。

制法：加热溶解，分装于小试管中，每支5mL，121℃灭菌20min。

盐溶液配制：准备无水氯化钙0.2g、七水硫酸镁0.48g、磷酸氢二钾1.0g、碳酸氢钠10.0g、氯化钠2.0g，先将氯化钙和七水硫酸镁混合溶解于300mL蒸馏水，再加500mL水，边搅拌边加入其它盐类直到全部溶解，加200mL蒸馏水，混合后置于4℃备用。

（6）葡萄糖产气培养基
在PY基础培养基内加入葡糖糖30g、吐温-80 0.5mL、琼脂6g，121℃灭菌20min。

（7）6.5%氯化钠耐盐性试验培养基
在MRS液体培养基中加入6.5%氯化钠，121℃灭菌20min。

1.4.2菌种的分离鉴定
通过富集—梯度稀释—扩大培养—镜检—纯化—初步定性试验—菌种筛选—斜面保藏等步骤进行菌种的分离鉴定。

（1）富集
称取腐烂的苹果液10g于盛有100mL基础培养基的三角瓶中，在恒温培养箱中37℃培养48h。

（2）梯度稀释
取1mL富集后的培养液于盛有9mL的0.8%生理盐水的试管中，梯度稀释，获得稀释梯度为10-5、10-6、10-7的培养液。

（3）扩大培养
取10-5、10-6、10-7的稀释梯度的菌悬液涂布于MRS 固体平板培养基上，每个稀释度做三个平行试验。

将培养皿倒置于生化培养箱内（以免培养过程皿盖冷凝水滴下，冲散已分离的菌落，稀释培养基），37℃培养48～72h。

（4）镜检
待MRS培养基平板上菌落形成后，观察菌落形态，将呈乳白色且有水解圈、生长状况良好的单个小菌落用接种环挑取到载玻片上，在革兰氏染色液染色后在生物显微镜下仔细观察染色细胞形态特征及颜色，判断是否为纯菌株，是否为革兰氏阳性菌，是否有疑似乳酸球菌的菌株。

选取符合条件的5株菌株，标记为A、B、C、D、E。

（5）纯化
将上述5株菌株进行划线纯化，再一次镜检，筛选符合条件的菌株。

（6）初步定性实验
用接种环挑取纯种培养基上的单个菌落到载玻片上，加几滴3%的过氧化氢溶液，观察试验现象，有气泡冒出为阳性，没有气泡冒出为阴性，并进行记录。

（7）菌种筛选
根据革兰氏染色和初步定性试验得到的单菌落菌株，在MRS平板培养基上进一步分离，根据其HC值（透明圈直径与变色圈直径的比值），选取一株HC值较大、透明圈较明显、生长较好的乳酸球菌菌株，标记为Q。

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（8）斜面保藏
将筛选得到的乳酸菌菌株接种到斜面保藏培养基上，在37℃培养72h后保藏于4℃冰箱内。

1.4.3菌种的生化鉴定
（1）硝酸盐还原试验
将被检菌接种于硝酸盐还原培养基中，于35℃培养1～4d，将格里斯试剂Ⅰ和格里斯试剂Ⅱ等量混合后（约0.1mL）加入培养基内，立刻观察试验结果，有红色出现为阳性，没有红色出现为阴性。

（2）葡萄糖产气试验
在PY基础培养基内加入葡糖糖30g，吐温-80 0.5mL，再加琼脂6g，做成琼脂柱，分装试管，高度4～5cm，将大量新鲜、活力强的菌种Q进行穿刺接种，再在其上加盖一层约7mm厚的琼脂粉，恒温培养，观察试验现象，出现将2%琼脂粉层向上顶的现象表示产气，试验结果为阴性，没有出现该种现象为阳性。

（3）耐盐性试验
将菌种接种到添加有6.5%氯化钠的MRS液体培养基中，30℃培养24h，650nm测定OD值，OD值有变化为阴性，没有变化为阳性。

（4）不同温度生长试验
在MRS液体培养基中接种菌株Q，分别在10、45℃条件下培养72h后，650nm测定OD值，OD值有变化为阴性，没有变化为阳性。

（5）生长曲线试验
配制200mL MRS液体培养基，取20mL分装到10个100mL的三角瓶中，在121℃、20min灭菌后，在每个三角瓶接种一环得到的菌株Q，37℃培养24h后，每隔2h取一次样，用紫外分光光度计测定不同时间段的OD600nm值，用MRS液体培养液做空白对照。

（6）产酸试验
酸度以吉尔涅尔度（°T）表示，100mL发酵液消耗1mL0.1mol/L氢氧化钠溶液记为1°T。

在测OD值时，同时取10mL的培养液，加2～3滴0.5%的酚酞溶液，用标定过的0.1mol/L氢氧化钠溶液滴定至浅粉色，半分钟内不褪色，由消耗氢氧化钠溶液的体积来计算样品中的产酸量，并绘制产酸曲线。

2结果与分析
2.1菌株分离筛选结果
2.1.1扩大培养
菌株扩大培养48h后，菌落特征如图1所示。

可观察到，在MRS培养基上有明显的水解圈，在培养基表面为乳白色的表面，湿润平滑或扁平、中间凸起的小菌落。

图1乳酸菌的菌落特征
Fig.1Colony characteristics of lactic acid bacteria
2.1.2镜检
对纯化后的5株菌种，挑取培养皿上的单个菌落用生物显微镜进行镜检，染色后为革兰氏阳性，呈球形单个排列。

镜检结果见表1。

表1菌株分离筛选结果
Table1Results of strain isolation and screening
注：“+”表示阳性，“-”表示阴性，下同。

2.1.3初步定性试验
按照定性试验操作规程操作，在载玻片的菌种上滴数滴3%过氧化氢溶液之后，试验现象见表1。

用革兰氏染色方法和初步定性试验筛选出了符合条件的单个菌株，即菌株D。

2.1.4菌株筛选
对革兰氏染色和初步定性实验得到的菌株D，在MRS平板培养基上再一次分离纯化，待长出菌落后，目测得到一株透明圈明显、生长较好的菌株，标记为Q，在生物显微镜下镜检，结果见图2（见下页）。

在图2中可观察到，菌株Q在革兰氏染色、镜检后的染色和形态特性，菌株革兰氏染色初步定性实验
A++
B-+
C++
D+-
E+
+
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即阳性，单个排列，呈小球状。

图2
乳酸菌的形态及染色特性
Fig.2
Morphology and dyeing characteristics of lactic acid
bacteria
2.2菌株鉴定结果
由表2可知，菌株Q 通过鉴定试验，得到结果均为
阴性，即在硝酸盐还原试验中没有红色出现；在葡萄糖产气试验中，琼脂粉有凸起的现象，也可能因为菌种不优良而使试验现象不明显，即琼脂粉凸起不明显；在6.5%NaCl 耐盐性试验中，有乳酸菌生长，即OD 值有变化；
在不同温度下生长试验10℃和45℃的条件下都生长。

表2乳酸菌鉴定试验结果
Table 2
Identification test results of lactic acid bacteria
2.3
生理生化试验结果
2.3.1
乳酸菌的生长曲线测定结果
由图3可见，乳酸菌在前30h 生长速度较快，OD 600nm
值连续上升，32～38h 期间乳酸菌数趋于平衡，OD 600nm 值稳定在0.860左右，处于稳定期，在培养38h 后开始衰退。

2.3.2
产酸试验
由试验分离得到的乳酸菌Q 在37℃培养24h 后，与OD 值同时测定的酸度结果如图4所示。

由图可知，乳酸菌酸度上升较快的时间为前30h，30～34h 酸度上升缓慢，在36h 酸度达到最大值34毅T，变化较平稳，与相应时间段的OD 600nm 值的变化情况基本一致，即酸度上升较快的时间同样也是细菌的对数生长期和稳定期前期，
在38h 后酸度开始下降。

图3
乳酸菌的生长曲线图
Fig.3
Growth curve of lactic acid bacteria
图4乳酸菌的产酸曲线
Fig.4Acid production curve of lactic acid bacteria
3讨论与小结
综上所述，从腐败苹果中分离得到的乳酸菌为革兰氏阳性菌，细胞形态为杆菌或球菌，过氧化氢酶为阴性，消耗葡萄糖产生乳酸，不形成内生孢子，无运动性[1]。

分离出的菌株Q 被鉴定为乳酸球菌乳球菌属。

该菌株对数生长期较长，稳定期短，产酸能力较弱。

相较于发酵酸奶中的乳酸菌，从腐败苹果中分离得到的试验菌种产酸能力、稳定性较差。

本试验采用传统的分离鉴定方法，试验周期较长，且存在试验环境偏差问题，近年来逐步建立起的基因鉴定分析方法，特别是序列分析方法成为鉴定乳酸菌重要方法，可进一步采用分子生物学方法进行鉴定。

参考文献院
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