贝克曼流式细胞仪原理及软件介绍
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当以 45o 角放置滤片时,该滤片可以通过一定 波长的光,同时也可以阻断并折射该波长以下的 光
这种方式的滤片称为二向色性滤片( dichroic filter)
滤片
带通滤片 BAND PASS (BP)
只允许某些波长的光通过
630 nm BandPass Filter
White Light Source
将光学信号转变为电脉冲(数字数据)信号
不同的脉冲信号被转换成数字通道(CHANNEL)的过程
Single Parameter Histogram: Count vs MFI Immunophenotyping
0
0
Count 11 15
0
7
0
3
0
.1
1
10
100
1000
Log FITC
Single Parameter Histogram
流式细胞仪 FLOW CYTOMETER
原理及软件介绍
Beckman Coulter流式细胞仪发展史
1947年Wallace Coulter发明了库尔特原理，用于血细胞分析 1953年推出了世界上第一台流式细胞分析仪Coulter Counter Model A 1972年推出世界上第一台激光流式细胞仪EPICS II 1975年研制出世界上第一台带计算机的流式细胞仪 1997年推出世界上第一台单激光四色数字化流式细胞仪EPICS XL/MCL 2000年首先将高精度数字化颜色补偿技术ADC（Advanced Digital
空冷/水冷
Enterprise II
水冷
Innova300系列
Innova70系列
常用激光器及其通道分配表
检测信号
散射光信号—前向散射光(FS)
FS----Forward (Angel Light) Scatter 在激光束正前方的检测器, 为前向散射光检测器
FS的强度与细胞或其他颗粒的大小, 形状及 optical homogeneity 有关
FALS Sensor
Fluorescence
Fluorescence detector ( FL1,FL2,FL3,FL4,FL5,SS)
Freq
光路 - 滤片特性
长通滤片 – 允许长于设定波长的光通过 短通滤片 – 允许短于设定波长的光通过 带通滤片 – 允许一定带宽的波长通过
光路 - 滤片特性
200
400
600
800
1000
0
Neutrophils
Monocytes
Lymphocytes
0 200
400
600
800
1000
90 Degree Scatter
光路-荧光信号
每种荧光染料均有特定的激发波长, 并激发后会 有发射波长,流式细胞仪检测的即是它特定的发 射波长.
利用各种不同波长的光学滤片来收集(检测)这 些光学信号
Transmitted Light
620 -640 nm Light
二向色性滤片 DICHROIC FILTER
一定波长以上通过，该波长以下折射
Light Source
Dichroic Filter/Mirror at
45 deg
Transmitted
Light
Reflected light
FC500 Filter Block Configuration
Dual Parameter Histograms
Dual Parameter Histograms
分析系统
以FC500机型的CXP软件介绍
Fluo-3,Fura R ed, Alexa 488
SS
620B P
488DLP
500LP
6
0
6
FL3 ECD
0
4
5
DL P
DS P
675B P
525B P
FL1
L
7
FL4
D
1
F IT
5
0
0
PC5
5 P
DL P
C
575BP
755BP
FL2
FL5
PE
PC7
Optics - Detectors
Photomultiplier tube (PMT)
Focused laser beam
Injector Tip
Sheath fluid
光路构造
光路
光源
检测信号 散射光信号
FS: 前向角散射光 SS: 侧向角散射光(90度散射光)
荧光信号 荧光染料 光学滤片
光路
光源 与通过的细胞聚焦在同一点上
激光
空冷
488nm blue, 633nm red, 325nm UV, 514nm green,
Laser
侧向散射光
FALS Sensor
90LS Sensor
侧向散射光
Light Scatter Gating
Side Scatter Projection
ForwardScater rPjoection
ForwardScater
Scale
1000 200 100 50 40 30 20 15 8
光路（光学系统）
光源 滤片 光电倍增管PMT HV
电路（电路系统）
放大电路HV及GAIN 增益 A/D转换
分析系统：计算机
流路构造
流路
单细胞悬液
大多数仪器是在50-300 µm 大小的孔径中,将细 胞悬液注射进入鞘液中
这一过程,成为流体动力学聚焦
FLOW CELL
Fluorescence signals
Compensation）应用于流式平台，引领流式进入全新的全矩阵补偿、全自动补 偿和脱机补偿时代 2003年推出世界上第一台单激光五色的流式细胞仪FC500/MCL，2005年升级为 FC500/MPL 2006年推出世界上第一台具有EV参数同时进行无成本绝对计数的多功能细胞分 析系统Quanta SC， 将流式细胞术与库尔特原理完美结合，2007年推出MPL进 样系统 2007年收购Dako公司的Moflo和Cyan，使Beckman公司成为高端流式市场的领导 者 2009年，推出世界是第一台三激光十色的分析型流式细胞仪Gallios/Navios
荧光染料的特性
•激发波长(EXCITING) •发射波长(EMISSION)
常用荧光染料的特性
荧光染料 颜色
FITC 免疫荧光
PE(RD1) 免疫荧光
ECD 免疫荧光
PeCy5 免疫荧光
PI DNA染色
激发波长 (nm)
488 绿色
488 橙色
488 橙红
488 红
488 橙红
发射波长(nm) 用途 525
Howard Shapiro, Practical Flow Cytometry, 3rd Edition
分类
分析型：只能分析用，液流进入废液筒 分选型：回收目标细胞，用于后续实验。要求管
道绝对无菌。
基本原理
流路（液流系统）
流动室 鞘液SHEATH 样本流SAMPLE 单细胞悬液5*105~1*106个/ml
• 5 color 1 Laser configuration • O ptim ized for FITC / PE / EC D / PC 5 / PC 7
1 laser 5 Color
• Exam ples of other dyes : PE-TR , PerCP-Cy5.5, PE-Cy5, PE-Cy7, PI, 7AA D , EG FP, EYFP,
Beckman Coulter Celllab Family
EPICS XL-ADC
Cytomics FC500
Gallios/Navios Cyan ADP
QUANTA SC MoFlo XDP
FC500硬件
What is flow cytometry?
流式细胞术是单个细 胞/颗粒流过检测装 置过程中，检测到的 物理和/或化学的特 性。
FS用于检测细胞或其他粒子的表面属性 如:大小
前向散射光
Laser
FALS Sensor
前向散射光
散射光信号 – 侧向散射光
SS-Side (Angel Light) Scatter 与激光束垂直方向的检测器为侧向检测器, 也称 为90度散射光检测器
SS用于检测细胞内部结ຫໍສະໝຸດ 如:胞浆内颗粒多少, 核质比575 620 675 620
5 Color Single Laser (488nm)
FITC/PE/ECD/PC5/PC7
荧光染料比较(平均荧光强度)
Q-Prep / ImmunoPrep 试剂系统
CD8-FITC
CD8-PE
CD8-ECD
CD8-PC5
CD8-PerCP
CD8-APC
PerCP < APC < FITC < ECD < PC5 < PE
这种方式的滤片称为二向色性滤片( dichroic filter)
滤片
带通滤片 BAND PASS (BP)
只允许某些波长的光通过
630 nm BandPass Filter
White Light Source
将光学信号转变为电脉冲(数字数据)信号
不同的脉冲信号被转换成数字通道(CHANNEL)的过程
Single Parameter Histogram: Count vs MFI Immunophenotyping
0
0
Count 11 15
0
7
0
3
0
.1
1
10
100
1000
Log FITC
Single Parameter Histogram
流式细胞仪 FLOW CYTOMETER
原理及软件介绍
Beckman Coulter流式细胞仪发展史
1947年Wallace Coulter发明了库尔特原理，用于血细胞分析 1953年推出了世界上第一台流式细胞分析仪Coulter Counter Model A 1972年推出世界上第一台激光流式细胞仪EPICS II 1975年研制出世界上第一台带计算机的流式细胞仪 1997年推出世界上第一台单激光四色数字化流式细胞仪EPICS XL/MCL 2000年首先将高精度数字化颜色补偿技术ADC（Advanced Digital
空冷/水冷
Enterprise II
水冷
Innova300系列
Innova70系列
常用激光器及其通道分配表
检测信号
散射光信号—前向散射光(FS)
FS----Forward (Angel Light) Scatter 在激光束正前方的检测器, 为前向散射光检测器
FS的强度与细胞或其他颗粒的大小, 形状及 optical homogeneity 有关
FALS Sensor
Fluorescence
Fluorescence detector ( FL1,FL2,FL3,FL4,FL5,SS)
Freq
光路 - 滤片特性
长通滤片 – 允许长于设定波长的光通过 短通滤片 – 允许短于设定波长的光通过 带通滤片 – 允许一定带宽的波长通过
光路 - 滤片特性
200
400
600
800
1000
0
Neutrophils
Monocytes
Lymphocytes
0 200
400
600
800
1000
90 Degree Scatter
光路-荧光信号
每种荧光染料均有特定的激发波长, 并激发后会 有发射波长,流式细胞仪检测的即是它特定的发 射波长.
利用各种不同波长的光学滤片来收集(检测)这 些光学信号
Transmitted Light
620 -640 nm Light
二向色性滤片 DICHROIC FILTER
一定波长以上通过，该波长以下折射
Light Source
Dichroic Filter/Mirror at
45 deg
Transmitted
Light
Reflected light
FC500 Filter Block Configuration
Dual Parameter Histograms
Dual Parameter Histograms
分析系统
以FC500机型的CXP软件介绍
Fluo-3,Fura R ed, Alexa 488
SS
620B P
488DLP
500LP
6
0
6
FL3 ECD
0
4
5
DL P
DS P
675B P
525B P
FL1
L
7
FL4
D
1
F IT
5
0
0
PC5
5 P
DL P
C
575BP
755BP
FL2
FL5
PE
PC7
Optics - Detectors
Photomultiplier tube (PMT)
Focused laser beam
Injector Tip
Sheath fluid
光路构造
光路
光源
检测信号 散射光信号
FS: 前向角散射光 SS: 侧向角散射光(90度散射光)
荧光信号 荧光染料 光学滤片
光路
光源 与通过的细胞聚焦在同一点上
激光
空冷
488nm blue, 633nm red, 325nm UV, 514nm green,
Laser
侧向散射光
FALS Sensor
90LS Sensor
侧向散射光
Light Scatter Gating
Side Scatter Projection
ForwardScater rPjoection
ForwardScater
Scale
1000 200 100 50 40 30 20 15 8
光路（光学系统）
光源 滤片 光电倍增管PMT HV
电路（电路系统）
放大电路HV及GAIN 增益 A/D转换
分析系统：计算机
流路构造
流路
单细胞悬液
大多数仪器是在50-300 µm 大小的孔径中,将细 胞悬液注射进入鞘液中
这一过程,成为流体动力学聚焦
FLOW CELL
Fluorescence signals
Compensation）应用于流式平台，引领流式进入全新的全矩阵补偿、全自动补 偿和脱机补偿时代 2003年推出世界上第一台单激光五色的流式细胞仪FC500/MCL，2005年升级为 FC500/MPL 2006年推出世界上第一台具有EV参数同时进行无成本绝对计数的多功能细胞分 析系统Quanta SC， 将流式细胞术与库尔特原理完美结合，2007年推出MPL进 样系统 2007年收购Dako公司的Moflo和Cyan，使Beckman公司成为高端流式市场的领导 者 2009年，推出世界是第一台三激光十色的分析型流式细胞仪Gallios/Navios
荧光染料的特性
•激发波长(EXCITING) •发射波长(EMISSION)
常用荧光染料的特性
荧光染料 颜色
FITC 免疫荧光
PE(RD1) 免疫荧光
ECD 免疫荧光
PeCy5 免疫荧光
PI DNA染色
激发波长 (nm)
488 绿色
488 橙色
488 橙红
488 红
488 橙红
发射波长(nm) 用途 525
Howard Shapiro, Practical Flow Cytometry, 3rd Edition
分类
分析型：只能分析用，液流进入废液筒 分选型：回收目标细胞，用于后续实验。要求管
道绝对无菌。
基本原理
流路（液流系统）
流动室 鞘液SHEATH 样本流SAMPLE 单细胞悬液5*105~1*106个/ml
• 5 color 1 Laser configuration • O ptim ized for FITC / PE / EC D / PC 5 / PC 7
1 laser 5 Color
• Exam ples of other dyes : PE-TR , PerCP-Cy5.5, PE-Cy5, PE-Cy7, PI, 7AA D , EG FP, EYFP,
Beckman Coulter Celllab Family
EPICS XL-ADC
Cytomics FC500
Gallios/Navios Cyan ADP
QUANTA SC MoFlo XDP
FC500硬件
What is flow cytometry?
流式细胞术是单个细 胞/颗粒流过检测装 置过程中，检测到的 物理和/或化学的特 性。
FS用于检测细胞或其他粒子的表面属性 如:大小
前向散射光
Laser
FALS Sensor
前向散射光
散射光信号 – 侧向散射光
SS-Side (Angel Light) Scatter 与激光束垂直方向的检测器为侧向检测器, 也称 为90度散射光检测器
SS用于检测细胞内部结ຫໍສະໝຸດ 如:胞浆内颗粒多少, 核质比575 620 675 620
5 Color Single Laser (488nm)
FITC/PE/ECD/PC5/PC7
荧光染料比较(平均荧光强度)
Q-Prep / ImmunoPrep 试剂系统
CD8-FITC
CD8-PE
CD8-ECD
CD8-PC5
CD8-PerCP
CD8-APC
PerCP < APC < FITC < ECD < PC5 < PE