基于GC-MS的小鼠肠-脑轴相关组织样本中短链脂肪酸的检测方法[发明专利]

(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010124766.6
(22)申请日 2020.02.27
(71)申请人 山东省分析测试中心
地址 250014 山东省济南市历下区科院路
19号
(72)发明人 宋月　曲新艳　王泉博　
(74)专利代理机构 济南圣达知识产权代理有限
公司 37221
代理人 张晓鹏
(51)Int.Cl.
G01N 30/02(2006.01)
G01N 30/06(2006.01)
(54)发明名称基于GC-MS的小鼠肠-脑轴相关组织样本中短链脂肪酸的检测方法(57)摘要本发明公开了一种小鼠肠-脑轴相关组织中短链脂肪酸的检测方法，涉及脑组织、结肠组织、结肠内容物和粪便，包括如下步骤：将脑组织、结肠组织、结肠内容物和粪便进行预处理，得到脑组织、结肠组织、结肠内容物和粪便提取液；向脑组织、结肠组织、结肠内容物和粪便提取液中加入内标物，并加入五氟溴卞进行衍生化反应；衍生后溶液经过萃取后，利用GC -MS对萃取液中的乙酸、丙酸和丁酸进行检测。

本发明通过衍生化方法，建立了一种脑组织、结肠组织、结肠内容物和粪便中3种短链脂肪酸的检测气相色谱质谱快速测定方法。

针对不同的生物样本进行预处理，并进行衍生化处理，加入内标进行校正，实现准
确定量。

权利要求书1页 说明书5页 附图5页CN 111239291 A 2020.06.05
C N 111239291
A
1.一种基于GC -MS的小鼠肠-脑轴相关组织样本中短链脂肪酸的检测方法，其特征在于：包括如下步骤：
向采集的脑组织、结肠组织、结肠内容物和粪便中加入预冷的超纯水，低温下研磨均匀，然后经涡旋、超声提取、离心，取上清液即得提取液；
向各个提取液中加入内标物2-乙基丁酸，并进行衍生化反应；
衍生后溶液分别经过萃取后，利用GC -MS对各个萃取液中的乙酸、丙酸和丁酸进行检测。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：脑组织、结肠组织、结肠内容物和粪便样品与超纯水的质量比为1:4-5；
进一步的，低温研磨的温度为3-5℃，优选为4℃。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：低温研磨时，脑组织的研磨时间为55-65s；结肠组织的研磨时间为120～180s；结肠内容物的研磨时间为30～60s；粪便的研磨时间为55-65s；
进一步的，涡旋的工艺条件为：转速为2500rpm，时间设定为1min；
超声提取的工艺条件为：设定超声提取时间为10-20min ,温度设定为3-5℃。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：向各个提取液中加入五氟溴卞进行衍生化反应。

5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于：所述衍生化反应的方法，包括如下步骤：
向加入内标物的提取液中加入中性缓冲液，然后加入五氟溴卞，混合均匀后，55-65℃水浴加热1～2h，即可。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述中性缓冲液为磷酸盐缓冲液。

7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述衍生化反应还包括将反应结束后的反应体系置于冰上降温的步骤。

8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述萃取过程中使用的有机溶剂为正己烷。

9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：萃取的时间为1-3min。

10.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：HP -5毛细管柱，30m ×0.25mm ×0.25μm；初始温度70℃，保持3min；然后以10℃/min的速率升温至130℃，以30℃/min的速率升温至280℃，保持2min；进样口温度：250℃，进样方式：分流进样，分流比为30:1；载气：氦气；离子化方式：电子轰击源EI；离子源温度：230℃；传输线温度：290℃；电离能量：70eV；溶剂延迟：7min；采用选择离子模式SIM扫描。

权　利　要　求　书1/1页CN 111239291 A
基于GC-MS的小鼠肠-脑轴相关组织样本中短链脂肪酸的检测
方法
技术领域
[0001]本发明涉及分析化学技术领域，具体而言，涉及一种基于GS-MS的小鼠肠-脑轴相关组织样本中短链脂肪酸的检测方法，主要涉及脑组织、结肠组织、结肠内容物和粪便。

背景技术
[0002]公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

[0003]短链脂肪酸(Short chain fatty acids)是膳食纤维在大肠部位被消化分解后产生的主要代谢产物，主要包括乙酸、丙酸和丁酸。

SCFAs在盲肠和近端结肠中的浓度最高，是结肠细胞的主要能量来源。

此外，SCFAs可通过免疫、内分泌、神经和体液途径在肠-脑轴相互作用中发挥重要作用。

研究证明，SCFAs可以越过血脑屏障，作为肠-脑轴的信号分子，为神经细胞直接供能。

所以，确定SCFAs对肠-脑轴互作途径的影响对很多疾病的研究至关重要。

[0004]发明人发现，目前对于脑组织和结肠组织中短链脂肪酸的定量检测方法还未见报道，目前针对结肠内容物及粪便中短链脂肪酸的检测方法主要有液相色谱法、气相色谱法及气相色谱质谱法等，但由于其操作步骤繁琐、时间成本高、回收率结果偏低、灵敏度低、稳定性差等问题未得到广泛应用。

发明内容
[0005]为了解决现有技术中存在的技术问题，本发明的目的是提供一种基于GC-MS的小鼠肠-脑轴相关组织样本中短链脂肪酸的检测方法，主要涉及脑组织、结肠组织、结肠内容物和粪便。

本方法，无需复杂的前处理技术，具有操作简便、重复性好、稳定性高、定量准确等特点，适用于脑组织、结肠组织、结肠内容物及粪便中短链脂肪酸的测定。

[0006]为了实现上述目的，本发明的以下一个或多个实施例提供的技术方案为：[0007]一种基于GC-MS的小鼠肠-脑轴相关组织样本中短链脂肪酸的检测方法，主要涉及脑组织、结肠组织、结肠内容物和粪便，包括如下步骤：
[0008]向采集的脑组织、结肠组织、结肠内容物和粪便中加入预冷的超纯水，低温下研磨均匀，然后经涡旋、超声提取、离心，取上清液即得提取液；
[0009]S1:向采集的脑组织、结肠组织、结肠内容物和粪便中加入相应体积预冷的超纯水，在低温下研磨均匀，然后涡旋、超声提取、离心，取上清液即得组织提取液；
[0010]S2：准确量取100μL组织提取液，置于2mL带帽玻璃管中，加入10μL浓度为2mM的2-乙基丁酸，作为内标来降低基质干扰，然后加入44μL pH＝7.0的磷酸缓冲液和308μL100mM 的五氟溴卞溶液，剧烈涡旋1～2min，然后置于水浴锅中进行衍生化处理，温度设定为60℃，加热时间为1.5～2h，水浴结束后取出放置于冰上，以缩短冷却时间，降低短链脂肪酸的挥
发损失，加入200μL正己烷，剧烈涡旋提取3min，最后离心(4℃，10000rpm条件下离心15min)取上清液，待测。

[0011]S3：配置3种短链脂肪酸(乙酸、丙酸和丁酸)及1种内标(2-乙基丁酸)的混合标准溶液，得到的标准溶液分别为2μM、5μM、10μM、20μM、50μM、100μM、200μM、500μM、1000μM和2000μM，内标2-乙基丁酸浓度为200μM。

按照同样的衍生方法，加入40μL pH＝7.0的磷酸缓冲液和280μL100 mM的五氟溴卞溶液，剧烈涡旋1～2min，然后置于水浴锅中进行衍生化，温度设定为60℃，加热时间为1.5～2h，水浴结束后取出放置于冰上，以缩短冷却时间，降低短链脂肪酸的挥发损失，加入200μL正己烷，剧烈涡旋提取3min，最后离心(4℃，10000rpm条件下离心15min)取上清液，即得衍生后的系列标准品。

[0012]S4：采用GC-MS对S2步骤所得待测样品和S3步骤中的衍生后的标准工作溶液进行短链脂肪酸的测定。

[0013]作为优选，步骤S1中选用提前预冷的超纯水进行研磨，旨在于降低研磨过程中短链脂肪酸的损失，且低温研磨温度设定为4℃。

[0014]在一些实施例中，步骤S1中低温研磨时，脑组织的研磨时间为60s；结肠组织的研磨时间为120～180s；结肠内容物的研磨时间为30～60s；粪便的研磨时间为60s。

经过试验发现，结肠组织较难破碎，只有延长至特定的研磨时间，才能提高结肠组织中三种短链脂肪酸的提取效果。

[0015]在一些实施例中，步骤S1中涡旋的工艺条件为转速为2500rpm，时间设定为1min；步骤S2和S3中涡旋中涡旋转速设定为2500rpm。

[0016]在一些实施例中，步骤S1中超声提取工艺条件为设定超声提取时间15min,温度设定为4℃。

[0017]在一些实施例中，步骤S2和S3中衍生剂为五氟溴卞烷基化试剂。

[0018]在一些实施例中，步骤S2和S3中衍生化条件为55-65℃水浴加热1～2h。

[0019]在一些实施例中，步骤S2和S3中衍生化反应还包括将反应结束后的反应体系置于冰上降温的步骤。

[0020]在一些实施例中，步骤S2和S3中萃取过程中使用的有机溶剂为正己烷，萃取时间为1～3min
[0021]在一些实施例中，步骤S4中，GC-MS条件为：HP-5毛细管柱，30m×0.25mm×0.25μm；初始温度70℃，保持3min；然后以10℃/min的速率升温至130℃，以30℃/min的速率升温至280℃，保持2min；进样口温度：250℃，进样方式：分流进样(分流比为30:1)；载气：氦气；离子化方式：电子轰击源(EI)；离子源温度：230℃；传输线温度：290℃；电离能量：70eV；溶剂延迟：7min；采用选择离子模式(SIM)扫描。

[0022]与现有技术相比，本发明的以上一个或多个实施例的有益效果为：
[0023]通过衍生化方法，建立了一种脑组织、结肠组织、结肠内容物和粪便中3种短链脂肪酸的检测GC-MS快速测定方法。

针对不同的生物样本进行预处理，并进行衍生化处理，加入内标进行校正，实现准确定量；本发明首次实现了脑组织和结肠组织中的短链脂肪酸的测定；重复性好；回收率高；适用于脑组织、结肠组织、结肠内容物和粪便中短链脂肪酸的检测。

为生物医学领域的研究提供了科学依据，可以更好的分析短链脂肪酸对肠-脑-轴互作途径的影响，这对于研究众多疾病的的发生和发展至关重要。

附图说明
[0024]构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

[0025]图1为本发明实施例中标准工作溶液的色谱图；
[0026]图2为本发明实施例中空白样品中短链脂肪酸的色谱图(a.脑组织，b.结肠组织，c.结肠内容物，d.粪便)；
[0027]图3为本发明实施例中40μM添加水平的短链脂肪酸色谱图(a.脑组织，b.结肠组织，c.结肠内容物，d.粪便)；
[0028]图4为本发明实施例中400μM添加水平的短链脂肪酸色谱图(a.脑组织，b.结肠组织，c.结肠内容物，d.粪便)；
[0029]图5为本发明实施例中1000μM添加水平的短链脂肪酸色谱图(a.脑组织，b.结肠组织，c.结肠内容物，d.粪便)；
具体实施方式
[0030]应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。

除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

[0031]需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。

如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

[0032]实施例1
[0033](1)样品预处理
[0034]脑组织：准确称量0.5g脑组织，加入2mL预冷的超纯水，采用组织研磨仪在4℃条件下研磨均匀，剧烈涡旋1min，超声提取15min，4℃，10000rpm条件下离心10min，取上清液；[0035]结肠组织:预处理方法同脑组织。

[0036]结肠内容物：准确称量0.5g结肠内容物，加入2.5mL预冷的超纯水，采用组织研磨仪在4℃条件下研磨均匀，剧烈涡旋1min，超声提取15min，4℃，10000rpm条件下离心10min，取上清液，用预冷的超纯水稀释2倍；
[0037]粪便：预处理方法同结肠内容物。

[0038](2)样品前处理
[0039]用移液枪移取100μL组织提取液，置于洁净的2mL带帽玻璃管中，加入10μL 2mM的2-乙基丁酸内标进行校正，加入相应体积pH＝7.0的磷酸盐缓冲液，充分混匀后加入308μL100mM衍生化试剂(五氟溴卞)，剧烈涡旋1～2min，然后置于水浴锅中进行衍生化，温度设定为60℃，加热时间为1～2h，水浴结束后取出放置于冰上，以缩短冷却时间，降低短链脂肪酸的挥发损失，加入200μL正己烷，剧烈涡旋提取3min，最后离心(4℃，10000rpm条件下离心15min)取上清液，用于GC-MS分析，具体色谱图见图2。

[0040](3)仪器分析条件
[0041]GC-MS条件为：HP-5毛细管柱，30m×0.25mm×0.25μm；初始温度70℃，保持3min；然
后以10℃/min的速率升温至130℃，以30℃/min的速率升温至280℃，保持2min；进样口温度：250℃，进样方式：分流进样(分流比为30:1)；载气：氦气；离子化方式：电子轰击源(EI)；离子源温度：230℃；传输线温度：290℃；电离能量：70eV；溶剂延迟：7min；采用选择离子模式(SIM)扫描。

[0042]表1 3种短链脂肪酸和1种内标(2-氨基丁酸)的GC-MS参数
[0043]
[0044](5)GC-MS分析结果
[0045]首先对衍生后的乙酸、丙酸和丁酸的混合标准品进行GC-MS分析，得到的色谱图见图1。

以衍生后乙酸、丙酸和丁酸的峰面积与内标峰面积之比对浓度进行线性回归得到线性回归方程。

随后进行乙酸、丙酸和丁酸高、中、低不同浓度的方法学验证实验，根据信噪比S/ N≥3计算得到分析方法的检出限。

[0046]表2 3种短链脂肪酸在不同样本中的相关数据
[0047]
[0048]方法学验证结果(如表2所示)表明，3种短链脂肪酸的线性关系良好(R2>0.99)，脑组织中3个添加水平的5个加标生物学重复的回收率在81.25％～97.91％之间，相对标准偏差(RSD)为1.29％～8.21％，结肠组织中3个添加水平的5个加标生物学重复的平均回收率在88.11％～98.83％之间，相对标准偏差(RSD)为3.77％～11.13％，结肠内容物中3个添加水平的5个加标生物学重复的平均回收率在82.15％～105.73％，相对标准偏差(RSD)为1.78％～8.72％，粪便中3个添加水平的5个生物学重复的平均回收率在85.41％～108.91％，相对标准偏差(RSD)为2.59％～12.68％。

检出限为0.004μM～0.5μM。

此外，图3、图4和图5分别为添加浓度为40μM、400μM和1000μM的短链脂肪酸色谱图。

[0049]以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。

凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

图1
图2
图3
图4
图5。