分子生物学-研究方法(上)PPT课件

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基因工程技术区别于其它技术的根本特征：具 有跨越天然物种屏障、把来自任何生物的基因 置于毫无亲缘关系的新的寄主生物细胞之中的 能力。
1962年Arber 发现限制性核酸内切酶， 1967年Gellert发现了 DNA 连接酶。
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酶类
重组DNA实验中常见的主要工具酶
功能
限制性核酸内切酶 DNA连接酶
分离DNA片段的大小范围（bp） 50 000~1 000 20 000~1 000 6 000~300 1 000~100 500~25 50~1
凝胶的分辨能力同凝胶类型和浓度有关，凝胶
浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，
孔隙越小，其分辨能力就越强。反之，浓度降低，
孔隙就增大，其分辨能力也就随之减弱。
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（3）PCR的应用
• 反向PCR：扩增已知序列旁侧的未知DNA序列
• 锚定PCR: 用于测定基因结构
• 不对称PCR: 用于扩增某一单链模板
• RT-PCR(逆转录-PCR): 逆转录联合PCR以扩增cDNA
• 复合PCR: 用多对引物同时扩增几条DNA片段
• 易错PCR：引入错配碱基，导致随机突变
• 荧光定量PCR: 用于估计模板DNA的浓度
• 免疫PCR：扩增抗原-抗体复合物上的DNA分子
• 原位PCR：在组织或细胞标本片上直接进行PCR
• 微生物PCR: 用于微生物的鉴定和分类
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➢ 设计引物应遵循以下原则：
①引物长度：15-30bp，常为20nt左右。 ②引物扩增跨度：以200-500bp为宜。 ③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜。避免5个以上 相同碱基的成串排列。 ④引物内部应避免出现出现二级结构，避免两条引 物间互补。 ⑤引物3ˊ末端碱基，应与模板单链严格配对。 ⑥引物中具有或能够加上合适的酶切位点。 ⑦特异性：与数据库中的其它序列无明显同源性。
引物1
引物2
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• PCR反应条件
PCR的基本原理 • PCR过程 • PCR的特点 Taq酶 引物1
引物2 Taq酶.Leabharlann 36• PCR反应条件
PCR的基本原理 • PCR过程 • PCR的特点 第1轮结束
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• PCR反应条件
PCR的基本原理 Taq• PCR过程 • PCR的特点 Taq
为菌落杂交和空斑杂交。在杂交膜上接种转化子细胞，裂 解以释放待检DNA，变性并固定DNA，与探针杂交，放射自 显影。用于鉴定阳性重组体。
检测重组体克隆. 的菌落杂交技术
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（4）组织原位杂交（Tissue in situ hybridization）：
指组织或细胞的原位杂交。经适当处理后，使细胞通透 性增加，让探针进入细胞内与DNA或RNA杂交，以确定探针互 补序列在胞内的空间位置。
Taq
Taq
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• PCR反应条件
PCR的基本原理 • PCR过程 • PCR的特点 第2轮结束
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第1轮扩增 第2轮扩增
• PCR反应条件
第3•轮扩PC增R过程
• PCR的特点
第4轮扩增
第5轮扩增
第6轮扩增
重复30轮后
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230=1,073,741,824 40
PCR设备
电泳分析
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电泳分析
用途：鉴定重组DNA分子 蛋白质与核酸相互作用 DNA分型 DNA核苷酸序列分析 限制酶酶切片段分析 限制酶酶切作图
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➢ 琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.2 - 50kb之间
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➢ 聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶分辨范.围为1-1000个碱基对 11
凝胶类型及浓度 0.3%琼脂糖 0.7%琼脂糖 1.4%琼脂糖 4.0%聚丙烯酰胺 10.0%聚丙烯酰胺 20.0%聚丙烯酰胺
末端转移酶
在双链核酸的3ˊ末端加上多聚单核苷酸
DNA外切酶III
从DNA链的3ˊ末端逐个切除单核苷酸
λ噬菌体DNA外切酶
从DNA链的5ˊ末端逐个切除单核苷酸
碱性磷酸酯酶
切除位于DNA链5ˊ或3ˊ末端的磷酸基团
科学家已几乎能随心所欲地把任何DNA分子切割成一系列不连续的片段， 再利用凝胶电泳技术将这些片段按照分. 子量大小逐一分开，以供下一步研7究。
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(t1/2 = 4.5×109a)
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➢ 放射性强度的探测
（1）盖革计数器（Geiger counter tuber）， 闪烁计数器。
（2）放射自显影：X-光乳胶片覆盖于样品，在 黑暗中，-70℃，曝光。
➢ 放射性分子的制备：核物理，化学，生化反应， 生化分离技术
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➢ 核酸分子的放射性同位素标记应用举例 利用切口平移技术制备DNA放射性探针
PCR仪
注: Taq来自Thermus aquaticus
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1.4.2 PCR反应体系
Tmplate DNA DNA Primers dNTPs Taq DNA Polymerase 10× Buffer
1.4.3 基本反应步骤
1个循环包括高温变性、低温退火和中温延伸反应。 经n次循环后, 一个DNA分子.可扩增为2n个分子。 29
合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板， 按碱基配对原则，合成一条新的与模板DNA互补的链。
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1个PCR循环产生2条双链分子
一般每完成一个循环需2-4分钟，2-3小时就能 将待扩增目的基因扩增放大几百万倍。
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PCR的基本原理
模板DNA
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PCR的基本原理
• PCR反应条件 • PCR过程 • PCR的特点
Western杂交：将蛋白质从电泳凝胶中转移到杂交滤膜上，
然后同放射性同位素125I标记的特定蛋白质进行反应。
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1.3.3 核酸分子杂交
复性（退火）：在一定条件 下变性的两条单链重新结合 为双链的过程
杂交：来源不同的两条单链 结合为双链分子的过程。
核酸探针：指序列或功能特 性已知的标记分子，为双链 或单链，长度通常为几十至 几百bp,包括DNA探针、RNA探 针和cDNA探针。
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➢ Southern杂交应用举例
环状芽孢杆菌基因. 启动子的分离与鉴定
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（2）斑点杂交（Dot blot）：直接将DNA样品点在滤 膜上使之成为斑点，变性并固定，与探针杂交，放射 自显影。
环状芽孢杆菌C-2基因启动子探针. 与重组DNA分子的斑点杂交 25
（3）菌落原位杂交（Hybridization in situ)：又分
探针杂交
放射自显影
＋
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例题：
某作者用人的一放射性DNA探针与鼠基因组DNA 进行杂交，在所得到的杂交图谱中，第1泳道的点 样处有一略呈拖尾状的放射性杂交斑点；第2泳道 呈较长的弥散形杂交带；第3泳道有3条较清晰的杂 交条带，上下两条带的显色程度相当，中间的条带 显色最深，约分别为其上下两侧条带的两倍。试分 析上述实验结果。
复制机制。
(3)50年代末至60年代，相继提出了“中心法则” 和操纵子学说, 成功地破译了遗传密码，充分认 识了遗传信息的流动和表达途径。
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1970年Mandel和Higa发现，大肠杆菌细胞经适量氯化钙处 理后，能有效地吸收λ噬菌体DNA。
1972年，Cohen等人又报道，经氯化钙处理的大肠杆菌细 胞同样能够摄取质粒DNA。
从此，大肠杆菌就成了分子克隆中最常用的转化受体。
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➢ 基因工程的主要内容或步骤
“分---切---连---转---筛”
（1）从基因组中分离、或PCR扩增、或人工合成带有目的 基因的DNA片段。 （2）用适当的限制酶分别切割适当的载体分子和含有目的 基因的DNA分子。 （3）将目的基因连接到载体分子上，形成重组DNA分子。 （4）将重组DNA分子转移到适当的受体细胞中并增殖。 （5）筛选重组转化子，扩增目的基因。再将目的基因克隆 到表达载体上，导入受体细胞，使表达目的产物。
dna分子标记类型72主要的dna分子标记英文缩写英文缩写英文名称英文名称中文名称中文名称rflprflprestrictionfragmentlengthpolymorphismrestrictionfragmentlengthpolymorphism限制性片段长度多态性限制性片段长度多态性stsstssequencetaggedsitesequencetaggedsite序列标签位点序列标签位点rapdrapdrandomamplifiedpolymorphicdnarandomamplifiedpolymorphicdna随机扩增多态性随机扩增多态性dnadnascarscarsequencesequencecharacterizedamplifiedregioncharacterizedamplifiedregion序列特异性扩增区序列特异性扩增区aflpaflpamplifiedfragmentlengthpolymorphismamplifiedfragmentlengthpolymorphism扩增片断长度多态性扩增片断长度多态性ssrssrsimplesequencerepeatsimplesequencerepeat简单序列重复简单序列重复sslpsslpsimplesequencelengthpolymorphismsimplesequencelengthpolymorphism简单序列长度多态性简单序列长度多态性issrissrinterintersimplesequencerepeatssimplesequencerepeats间简单序列重复间简单序列重复sscpsscpsinglesinglestrandconformationpolymorphismstrandconformationpolymorphism单链构象多态性单链构象多态性snpsnpsimplenucleotidepolymorphismsimplenucleotidepolymorphism单核苷酸多态性单核苷酸多态性73rflp限制性片段长度多态性限制性片段长度多态性不同个体基因组内的核苷酸序列因某种原因不同个体基因组内的核苷酸序列因某种原因产生碱基突变后改变了某种限制性内切酶的剪产生碱基突变后改变了某种限制性内切酶的剪切位点导致酶切片段的大小发生变化这种变化可以通过与特定探针进行杂交而得到检测从而可比较不同品种或个
1.2.3 植物转基因的方法
(1)Ti质粒介导
(2)电转化法
(3)基因枪法
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1.3 核酸的分子杂交
1.3.1 放射性同位素技术
同位素：原子序数相同而质量不同的元素。
➢ 放射性同位素 同位素可分为稳定同位素和不稳 定同位素，后者又称为放射性同位素。不稳定同位 素原子核结构不稳定，易自发产生衰变，产生α射线、β-射线和γ-射线等，同时从不稳定同位素 变成稳定同位素。在分子生物学研究中，得到应用 的是放射性同位素。
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1.3.2 分子杂交类型
根据鉴定对象不同，可将分子杂交法分为3种类型：
Southern杂交由E.M.Southern于1975年创立。
Southern杂交：将DNA分子从电泳凝胶转移至杂交滤膜上，
然后与核酸探针进行杂交。
Northern杂交：将RNA分子从电泳凝胶转移至杂交滤膜上，
然后与核酸探针进行杂交。
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1)电泳:将已酶切的待检DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳。
2)转膜:将分离的核酸样品转移到滤膜上（印迹转移）。
3)杂交:将滤膜与标记的DNA或RNA探针进行杂交。
印迹法：凝胶印迹法、斑点和狭线印迹法、菌落和 噬菌斑印迹法。
杂交膜：尼龙滤膜、硝酸. 纤维素滤膜等。
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杂交模式图 －
DNA印迹转移
① 模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右 一定时间后，使模板DNA双链解离，使之成为单 链，以便与引物结合。
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② 模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热 变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板 DNA单链上的互补序列配对结合。
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③ 引物的延伸：DNA模板--引物结合物在Taq DNA聚
若退火的核酸来自 不同的生物有机体，则 所形成的双链分子就被 . 称为杂种核酸分子。 19
（1）Southern杂交（Southern印迹）：用适当 的限制酶消化待测DNA，电泳后，将凝胶浸于碱 性溶液中以变性DNA，再经毛细作用将变性的 DNA从凝胶中转移至杂交膜上并固定，然后与放 射性同位素标记的核酸探针杂交，再经放射自 显影显示杂交结果。该技术可有效地分析基因 结构或检测待测DNA样本中是否含有特定的序列。
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1.2 转基因方法
1.2.1 细菌转基因的方法 (1)结合（conjugation） (2)转化（transformation）(常规转化、电转化等) (3)转染（transfection） (4)转导（transduction）
1.2.2 动物转基因的方法 (1)显微注射法：包括细胞核内和细胞质内注射。 (2)电导转基因法 (3)逆转录病毒介导法 (4)胚胎干细胞介导法 (5)精子载体法
1 DNA操作技术
• DNA分子的切割与连接 • 核酸分子杂交 • 凝胶电泳 • 细胞转化 • 核酸序列分析 • 基因的人工合成 • 基因的定点突变 • PCR扩增 • 基因敲除
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1.1 核酸的凝胶电泳
原理： 种类：琼脂糖（agarose）凝胶电泳；
聚丙烯酰胺（polyacrylamide）凝胶电泳
Localization of RNA
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1.4 聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR）
➢ PCR技术简史
1.4.1 PCR原理 PCR是一种体外无性扩增DNA的实验技 术。待扩增DNA片段经高温变性成为单链后，在低温 （如52℃）下与寡聚核苷酸引物退火，然后在中温下 以每一条单链为模板，由多聚酶催化延伸引物链，分 别合成一条新链。经过解链、退火和链延伸等多个循 环反应，原DNA片段就可得到大量扩增。
第五章
分子生物学研究方法（上）
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本章主要内容
常见的DNA操作技术 基因克隆技术简介 蛋白质组学及研究技术
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引言
➢ 重组DNA技术发展史上的重大事件
(1) 40年代，解决了遗传的物质基础问题。确定了
遗传信息的携带者，即基因的分子载体是DNA而不是蛋白 质。
(2)50年代，解决了基因的自我复制和世代交替问 题。建立了DNA分子的双螺旋结构模型，提出了半保留
识别并在特定位点切开DNA 通过磷酸二酯键把两个或多个DNA片段连接成一个DNA分子
DNA聚合酶I（大肠杆菌） 按5ˊ到3ˊ方向加入新的核苷酸，补平DNA双链中的缺口
反转录酶
按照RNA分子中的碱基序列，根据碱基互补原则合成DNA链
多核苷酸激酶
把磷酸基团加到多聚核苷酸链的5ˊ-OH末端（进行末端标 记实验或用来进行DNA的连接
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➢ 放射性的衰变类型 α-射线：带正电荷的高速粒子流 β-射线：带负电荷的粒子流 γ-射线：光子流
➢ 分子生物学研究中常用的放射性同位素及其性质
元素名称 半衰期 12.1年 5700年 14.3天 87.1天 5.8年
147N + 10n → 146C + 11H 146C → 147N + 0-1e 23892U → 20682Pb + 842He + 60-1e