骨髓间充质干细胞对心脏死亡脂肪变供肝移植后肝功能的保护

《中国组织工程研究》 Chinese Journal of Tissue Engineering Research
文章编号:2095-4344(2019)17-02625-05
2625
www.CRTER
.org
·研究原著·
蔡秋程，男，1978年生，福建省泉州市人，汉族，2015年福建医科大学毕业，博士，主治医师，主要从事肝脏移植、肝胆外科疾病的诊治。

通讯作者：江艺，博士，主任医师，中国人民解放军联勤保障部队第900医院肝胆外科，福建省福州市 350025
文献标识码:A
稿件接受：2019-01-15
Cai Qiucheng, MD, Attending physician, Department of Hepatobiliary Surgery, the 900th Hospital of PLA Joint Service Support Force, Fuzhou 350025, Fujian Province, China
Corresponding author: Jiang Yi, MD, Chief physician, Department of Hepatobiliary Surgery, the 900th Hospital of PLA Joint Service Support Force, Fuzhou 350025, Fujian Province, China
骨髓间充质干细胞对心脏死亡脂肪变供肝移植后肝功能的保护
蔡秋程，范洪凯，熊日晖，江 艺(中国人民解放军联勤保障部队第900医院肝胆外科，福建省福州市 350025)　DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.1683 ORCID: 0000-0002-3086-6687(蔡秋程)
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文题释义：
转氨酶：是人体肝脏正常运转过程中必不可少的“催化剂”，肝细胞是转氨酶的主要生存地。

当肝细胞发生炎症、中毒、坏死时会导致肝细胞受损，转氨酶便会释放到血液里，使血清转氨酶升高。

边缘供肝：供肝短缺是当今制约临床肝移植进一步发展的瓶颈，如何扩大供肝来源，挖掘潜在边缘供肝，成为肝移植工作者极为感兴趣又急需解决的现实问题。

边缘供肝一般是指肝移植后存在原发性移植肝无功能或功能低下以及迟发性移植物失活风险的肝移植供者。

摘要
背景：公民逝世后供肝捐赠者由于脂肪肝的高发病率，以及较长热缺血时间、组织低灌注时间等损害，移植后并发症发生率明显增加。

理论上间充质干细胞可以促进移植器官细胞的再生，减轻器官移植后的缺血再灌注损伤和各种免疫损伤，从而起到对移植器官功能的保护作用。

目的：探讨骨髓间充质干细胞对大鼠心脏死亡脂肪变供肝移植后肝功能的保护作用。

方法：应用密度梯度离心法分离、培养纯化大鼠骨髓间充质干细胞；将供体大鼠给予高脂饲料喂养8周致中-重度脂肪肝，然后诱导大鼠心脏死亡。

将受体大鼠随机分为3组：①对照组(n =10)：心脏死亡脂肪变供肝移植；②阴性对照组(n =10)：心脏死亡脂肪变供肝移植，移植术中经门静脉注射生理盐水1 mL ；③实验组(n =10)：
心脏死亡脂肪变供肝移植，术中经门静脉注射1 mL(约1.0×106
个细胞)PBS 配备的骨髓间充质干细胞悬液。

移植后第1，3，7天检测血清转氨酶活性。

移植后48 h ，采用Tunel 法检测肝细胞凋亡情况。

结果与结论：①移植后第1天，3组转氨酶活性比较差异无显著性意义(P > 0.05)；移植后第3，7天，实验组转氨酶活性低于对照组和阴性对照组(P < 0.05)；②实验组肝细胞凋亡指数低于对照组和阴性对照组，组间比较差异有显著性意义(P < 0.01)；对照组和阴性对照组间比较差异无显著性意义(P > 0.05)；③结果表明，骨髓间充质干细胞移植能够抑制肝细胞凋亡，有利于脂肪变供肝移植后肝功能的恢复。

关键词：
心脏死亡；器官移植；脂肪变供肝；肝移植；骨髓间充质干细胞；转氨酶活性；肝细胞凋亡；福建省自然科学基金项目
中图分类号：R459.9；R394.2 基金资助：
福建省自然科学基金面上项目(2016J01585)，项目负责人：蔡秋程
骨髓间充质干细胞对大鼠心脏死亡脂肪变供肝移植后肝功能的保护 结果与结论： (1)移植后第3，7天，实验组转氨酶活性低于对照组和阴性对照组；　(2)移植后48 h ，实验组肝细胞凋亡指数低于对照组和阴性对照组；　
(3)结果表明，骨髓间充质干细胞移植能够抑制肝细胞凋亡，有利于脂肪变供肝移植后肝功能的恢复。

　供体大鼠：
(1)将供体SD 大鼠30只给予高脂饲料喂养8周致中-重度脂肪肝；　(2)然后诱导大鼠心脏死亡。

　细胞： (1)应用密度梯度离心法分离、培养纯化大鼠骨髓间充质干细胞； (2)取生长良好的第3代细胞，胰蛋白酶消化后，PBS 清洗3遍，生理盐水制成活细胞悬液备用。

受体大鼠： (1)将SD 大鼠30只随机分为3组； (2)对照组(n =10)：心脏死亡脂肪变供肝移植；　
(3)阴性对照组(n =10)：心脏死亡脂肪变供肝
移植，术中经门静脉注射生理盐水1 mL ； (4)实验组(n =10)：心脏死亡脂肪变供肝移植，术中经门静脉注射1 mL 骨髓间充质干细胞悬液。

　
蔡秋程，范洪凯，熊日晖，江艺. 骨髓间充质干细胞对心脏死亡脂肪变供肝移植后肝功能的保护[J]. 中国组织工程研究，2019，23(17):2625-2629. DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.1683
ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH
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Intravenous administration of bone marrow mesenchymal stem cells protects liver function following fatty liver transplantation from donors after cardiac death
Cai Qiucheng, Fan Hongkai, Xiong Rihui, Jiang Yi (Department of Hepatobiliary Surgery, the 900th Hospital of PLA Joint Service Support Force, Fuzhou 350025, Fujian Province, China)
Abstract
BACKGROUND: Liver transplantation from donation after cardiac death triggers a significant increase in the incidence of complications after transplantation due to the high incidence of fatty liver, long-term warm ischemia time and low perfusion time. Theoretically, mesenchymal stem cells can promote the regeneration of transplanted organ cells, and reduce ischemia-reperfusion injury as well as various immune damages after organ transplantation, thus protecting the function of transplanted organs.
OBJECTIVE: To study the effect of bone marrow mesenchymal stem cells on liver function undergoing liver transplantation from donors after cardiac death.
METHODS: Rat bone marrow mesenchymal stem cells were isolated, cultured and purified by density gradient centrifugation. The donor rats were reared to moderate-severe fatty liver, and induced cardiac death. Recipient rats were randomized into three groups: (1) control group (n =10), fatty donor liver transplantation from donation after cardiac death; (2) negative control group (n=10), fatty donor liver transplantation from donation after cardiac death plus injection of 1 mL normal saline through the portal vein; and (3) experimental group, fatty donor liver transplantation from donation after cardiac death plus injection of 1 mL PBS containing bone marrow mesenchymel stem cells (approximately 1.0×106 cells). The serum transaminase levels were evaluated at 1, 3, and 7 days after liver transplantation. Apoptosis of hepatocytes was detected using TUNEL.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) On the 1st day after transplantation, there was no significant difference in the transaminase level among the three groups. On the 3rd and 7th days after transplantation, the levels of transaminase in the experimental group were significantly lower than those in the control group and negative control group (P < 0.05). (2) The apoptotic index of hepatocytes in the experimental group was significantly lower than that in the control group and the negative control group (P < 0.01); however, there was no significant difference
between the control group and the negative control group (P > 0.05). To conclude, bone marrow mesenchymal stem cell transplantation can inhibit the apoptosis in hepatocytes and make liver function recover quickly following fatty liver transplantation from donors after cardiac death. Key words: Cardiac death; organ transplantation; fatty liver transplantation; liver transplantation; bone marrow mesenchymal stem cells; transaminase activity; hepatocyte apoptosis; Natural Science Foundation of Fujian Province
Funding: the Natural Science Foundation of Fujian Province (General Program), No. 2016J01585 (to CQC)
0 引言 Introduction
由于公民逝世后器官捐献人群中脂肪肝的高发病率、捐赠前药物治疗、肠外营养、缺氧等，常伴有明显肝脂肪变性，同时较长热缺血时间及组织低灌注时间、大量炎性递质和氧自由基释放等，都将影响公民逝世后捐献供肝的质量。

随着肝移植的快速发展，临床上面临供者缺乏的困境，边缘性供肝成功应用于临床的比例不断增加，但是移植术后早期肝功能不全、早期移植肝无功能、移植物功能延迟恢复、肝动脉血栓形成、胆道并发症、慢性排斥反应的发生风险也随之增加。

因此，对于器官移植后功能的保护，降低术后并发症、提高患者的生存率和生存质量成为目前肝移植研究的热点[1]。

骨髓间充质干细胞是一类起源于中胚层的成体干细胞，具有自我更新、多向分化和高度增殖的特点[2]，同时兼有免疫调节、炎症趋化、组织修复等生物学特性[3]。

上述这些生物学特性有利于促进移植器官细胞的再生，减轻器官移植后的缺血再灌注损伤和各种免疫损伤，从而起到对移植器官功能的保护作用[4]。

该实验主要探讨骨髓间充质干细胞对大鼠心脏死亡脂肪变供肝移植后肝功能的保护作用。

1 材料和方法 Materials and methods
1.1 设计 细胞学体外实验和动物体内实验。

1.2 时间及地点 实验于2017年1月至2018年10月在中国人民解放军联勤保障部队第900医院比较医学科动物实验室完成。

1.3 材料
1.3.1 实验动物 4周龄清洁级SD 大鼠64只，体质量80-100 g ，由福建医科大学实验动物中心提供，动物合格证号：2015000561081，饲养于中国人民解放军联勤保障部队第900医院比较医学科SPF 级动物实验中心的屏障环境中，温度20-22 ℃，湿度40%-70%。

1.3.2 实验试剂 低糖DMEM 培养基(美国Gibco 公司)；胎牛血清(美国Hyclone 公司)；小鼠抗大鼠单抗CD45-PE 、小鼠抗大鼠单抗CD44-FITC 、仓鼠抗大鼠单抗CD90-APC (Biolegend 公司)；油红O 染色剂(美国Sigma 公司)；成软骨诱导试剂(Miltenyi 公司)；TUNEL 凋亡试剂盒(德国Boehringer 公司)。

1.4 实验方法　
1.4.1 大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养
大鼠骨髓间充质干细胞的培养及鉴定：
细胞来源：
密度梯度离心法分离、培养纯化大鼠骨髓间充质干细胞
细胞培养基：低糖DMEM 培养基 添加材料： 体积分数为10%胎牛血清
培养时间： 原代培养14 d 左右，贴壁细胞汇合度达80%-90%开始传代 细胞传代： 取第3代对数生长期大鼠骨髓间充质干细胞用于实验
细胞鉴定：
①流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞的表面标志物，结果显示细胞抗原CD44、CD90阳性表达，CD45阴性表达；②骨髓间充质干细胞能够向软骨细胞、脂肪细胞分化
伦理学批准：实验方案经中国人民解放军联勤保障部队第900医院动物实验
伦理委员会批准
Cai QC, Fan HK, Xiong RH, Jiang Y. Intravenous administration of bone marrow mesenchymal stem cells protects liver function following fatty liver transplantation
from donors after cardiac death. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2019;23(17):2625-2629. DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.1683
P .O. Box 10002, Shenyang 110180
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选取4周龄SD 大鼠4只，应用密度梯度离心法分离、培养纯化大鼠骨髓间充质干细胞[5]，观察其形态；流式细胞仪鉴定细胞表面标志；成软骨诱导试剂盒、成脂诱导试剂盒检测骨髓间充质干细胞向软骨细胞、脂肪细胞的分化潜能。

取生长良好的第3代细胞，胰蛋白酶消化后，PBS 清洗3遍，生理盐水制成活细胞悬液备用。

1.4.2 大鼠心脏死亡脂肪变供肝移植模型的建立及分组 随机抽取30只SD 大鼠，高脂饲料(88%普通饲料、10%猪油、2%胆固醇)喂养8周形成中-重度脂肪肝模型作为供体。

大鼠心脏死亡的诱导：于肝上下腔静脉上方膈肌处剪开造成气胸，大鼠呼吸功能受限，缺氧致心脏逐渐停跳，此过程密切监测动脉血压变化，当血压为零时视为心脏停跳，约为9 min ，腹主动脉插管，4 ℃乳酸钠林格式液(不含肝素)灌注肝脏至完全黄白色。

供受体的其余手术操作同改良的kamada “二袖套法”大鼠原位肝移植[6]。

抽取30只SD 大鼠作为受体，随机分为3组：①对照组(n =10)：心脏死亡脂肪变供肝移植；②阴性对照组(n =10)：心脏死亡脂肪变供肝移植移植，术中经门静脉注射生理盐水1 mL ；③实验组(n =10)：心脏死亡脂肪变供肝移植，术中经门静脉注射1 mL (约1.0×106个细胞)PBS 配备的骨髓间充质干细胞悬液。

1.5 主要观察指标 ①移植后1，3，7天经眼眶或尾静脉采血0.8-1.0 mL 检测血清转氨酶活性；②移植后48 h ，取大鼠肝组织，采用Tunel 法检测肝细胞凋亡情况。

细胞核被染成深棕色为阳性凋亡细胞。

高倍显微镜下(×200)随机选取5个不重复视野，计数阳性细胞数，以凋亡阳性细胞数占整个视野总细胞数的百分比作为肝细胞的凋亡指数，取平均值。

1.6 统计学分析 数据用SPSS 13.0统计软件包进行分析，正态分布计量数据用x _
±s 表示，经方差齐性检验，再进行两独立样本均数的t 检验和不同时间点组内的单向方差分析，检验水准α=0.05。

2 结果 Results
2.1 骨髓间充质干细胞的分离培养、鉴定结果 原代细胞生长缓慢，可见圆形细胞，14 d 左右细胞贴壁达90%进行传代，传代细胞生长良好，3-5 d 即可传下一代，随着传代次数的增多，细胞纯度增加，细胞梭形明显，并呈漩涡状生长，见图1。

利用流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞的表面标志物，结果显示培养的细胞均一性良好，细胞抗原CD44、CD90、CD45的阳性率分别为87.4%，97.1%，1.1%，见图2。

第3代细胞经过成软骨诱导后，细胞形态开始发生改变，由原来的长梭形转变为多角形、不规则形，诱导分化3周细胞呈现结节状，表现出成软骨细胞的特征，用阿辛蓝染色后细胞呈蓝色，见图3A 。

第3代细胞经过成脂诱导后，个别细胞中开始出现小的脂肪滴、排列无序，随着诱导时间的延长，含有脂肪滴的细胞逐渐增多，脂肪滴相互
融合增大，诱导2周用油红O 染色后可见分化成的脂肪细胞呈红色，见图3B 。

A 图注：图中A 为原代骨髓间充质干细胞，呈梭形、圆形或颗粒状；B
为第1代骨髓间充质干细胞，呈梭形或圆形；C 为第2代骨髓间充质干细胞，呈梭形，偶见圆形；D 为第3代骨髓间充质干细胞，呈长梭形，排列整齐。

图1 不同代次的大鼠骨髓间充质干细胞(×100)
Figure 1 Rat bone marrow mesenchymal stem cells of different
generations (×100) A ：CD44(87.4%) B ：CD90(97.1%)
C ：CD45(1.1%)
图2 骨髓间充质干细胞表面标志流式细胞仪鉴定结果 Figure 2 Identification results of bone marrow mesenchymal stem cells by flow cytometry
A 图注：图中A 为阿辛蓝染色后软骨细胞呈蓝色；
B 为油红O 染色后脂肪细胞呈红色。

图3 骨髓间充质干细胞的成软骨和成脂分化能力(×100) Figure 3 Chondrogenic and adipogenic differentiation of bone
marrow mesenchymal stem cells (×100)
蔡秋程，范洪凯，熊日晖，江艺. 骨髓间充质干细胞对心脏死亡脂肪变供肝移植后肝功能的保护[J]. 中国组织工程研究，2019，23(17):2625-2629. DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.1683
ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH
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2.2 实验动物数量分析 参加实验的SD 大鼠64只，其中4只用于获取骨髓间充质干细胞，30只制作脂肪肝模型用于获取供肝，30只用于肝移植手术，分为3组，对照组和阴性对照组分别死亡1只、2只，其余大鼠均进入结果分析。

2.3 各组大鼠移植后血清转氨酶活性的比较 与对照组相比，实验组移植后1 d 转氨酶变化不明显，3组转氨酶活性比较差异无显著性意义(P > 0.05)。

随着时间的延长，移植后3，7 d 实验组转氨酶活性明显低于对照组(P < 0.05)。

结果表明联合骨髓间充质干细胞移植，有利于脂肪变供肝移植后肝功能的恢复，见表1。

2.4 Tunel 法检测各组肝组织中的细胞凋亡情况 与对照组(11.03±5.19)和阴性对照组(10.65±5.78)比较，实验组移植后48 h 肝细胞凋亡指数(6.24±1.33)明显降低(P < 0.01)，对照组和阴性对照组间比较差异无显著性意义(P > 0.05)。

说明骨髓间充质干细胞能够明显抑制移植肝的细胞凋亡，促进供肝移植后肝功能的恢复，见图4。

3 讨论 Discussion
心脏死亡器官捐献者在心脏停止跳动过程中，机体器官必然要经历缺血缺氧性损伤的过程，且不同器官对缺氧的耐受能力不同，引起的损伤也不一样。

肝脏对热缺血时间尤为敏感，心脏死亡器官捐献供者在等待心脏停跳的过程中，不可避免的经历一段较长的热缺血时间，尤其是合并有脂肪变的肝脏，对缺血更为敏感，严重影响获取供肝的质量。

为提高心脏死亡器官捐献供肝的利用率，要求加强对供肝获取前及移植后的保护。

针对心脏死亡器官捐献供肝移植后功能的保护，目前国内外仍少有研究报告。

Hashimoto 等[7]报道使用组织纤维蛋白溶酶原激活剂能够减少心脏死亡器官捐献供肝移植后移植物无功能的发生率。

间充质干细胞是可以从骨髓、脂肪、胎盘、脐血中分离出来的一类成体干细胞，这类细胞处于未分化或低分化状态，具有自我更新、免疫调节、炎症趋化、组织修复、低免疫原性等生物特性[8-10]。

成体干细胞注入体内后，在趋化因子的作用下，能够相对集中到受损伤部位，在局部微环境的作用下，间充质干细胞可以通过自分泌和旁分泌机制，降低炎症因子的表达[11-12]，促进细胞凋亡抑制蛋白Bcl-2和抗炎症因子白细胞介素10等的分泌[13-14]，从而降低过度炎症反应引起的损伤，减少细胞凋亡，促进内源性细胞增殖，改善和促进损伤组织的修复[15]。

该实验应用密度梯度离心法分离、培养纯化大鼠骨髓间充质干细胞，通过流式细胞仪检测细胞表面标志物，并成功诱导其分化成软骨细胞和脂肪细胞。

心脏死亡器官捐献脂肪变供肝移植后，由于供肝经历了较长的热缺血时间和冷保存时间，以及复流后的缺血再灌注损伤，因此供肝移植后经历一个急性肝损伤的过程，血清转氨酶释放入血。

血清转氨酶活性是反映肝功能急性损害的重要指标。

该研究表明，大鼠心脏死亡器官捐献肝移植术中经门静脉注射骨髓间充质干细胞，移植后3，7 d 肝功能损伤程度明显轻于对照组，血清转氨酶活性低于对照组(P < 0.01)。

结果表明联合骨髓间充质干细胞移植可以减轻缺血再灌注引起的肝细胞损伤，保护肝功能。

肝脏急性损伤的另一个重要特征为短期内大量的肝细胞凋亡。

肝
细胞凋亡指数的高低可以间接反映肝急性损害的程度[16]。

通过对心脏死亡器官捐献脂肪变供肝移植后48 h 肝细胞凋亡进行分析，实验组移植后48 h 细胞凋亡指数明显低于对照组和阴性对照组。

结果显示骨髓间充质干细胞移植可以抑制肝细胞凋亡有利于移植后肝功能恢复。

综上所述，心脏死亡器官捐献供肝因脂肪变比率高及较长的热缺血时间，供肝受损害程度明显加重，移植后的并发症显著升高。

骨髓间充质干细胞对移植器官功能具有保护作用。

因此，积极推进骨髓间充质干细胞在心脏死亡器官捐献肝移植领域的转化应用，不仅有利于提高心脏死亡器官捐献供肝的利用率，拓宽供者来源，一定程度缓解
表1 各组大鼠移植后不同时间血清转氨酶活性的比较 (x _
±s ，U/L)
Table 1 Intergroup comparison of serum transaminase activity in rats at different time after transplantation
组别 动物数量 移植后1 d 移植后3 d 移植后7 d
对照组 10(9) 958.3±95.01 1 089.9±144.9 224.6±60.53
阴性对照组 10(8)
906.2±108.6 1 116.4±180.4 205.2±52.38
实验组 10(10) 898.6±118.5 830.9±126.3 142.8±31.63 F 值 0.91 10.74 3.93 P 值
> 0.05
< 0.01
< 0.05
表注：()内为存活大鼠数量，术后1 d 各组大鼠血清转氨酶活性比较差异无显著性意义(P > 0.05)。

术后3，7 d 阴性对照组与对照组比较差异无显著性意义，
实验组转氨酶活性明显低于对照组、阴性对照组(P < 0.05)。

A
B
C D
图注：图中A 为正常对照，细胞核染成蓝色；B 为实验组，部分细胞(50%)核染成浅棕色，强度为(+)；C 为对照组，大部分细胞(80%)核
染成深棕色，强度为(++)-(+++)；D 为阴性对照组，大部分细胞(80%)
核染成深棕色，强度为(++)-(+++)。

图4 各组移植后48 h TUNEL 法检测肝细胞凋亡(×200)
Figure 4 Apoptosis of hepatocytes detected by TUNEL at 48 hours after transplantation (×200)
Cai QC, Fan HK, Xiong RH, Jiang Y. Intravenous administration of bone marrow mesenchymal stem cells protects liver function following fatty liver transplantation
from donors after cardiac death. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2019;23(17):2625-2629. DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.1683
P .O. Box 10002, Shenyang 110180
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器官短缺的问题，还可能为移植后的难治性并发症提供全新的治疗措施。

作者贡献：实验设计为蔡秋程，实验实施为蔡秋程、范洪凯、熊
日晖，实验评估为江艺，资料收集为范洪凯、熊日晖。

经费支持：该文章接受了“福建省自然科学基金面上项目
(2016J01585)”的资助。

所有作者声明，经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道。

利益冲突：文章的全部作者声明，在课题研究和文章撰写过程中
不存在利益冲突。

机构伦理问题：实验方案经中国人民解放军联勤保障部队第900
医院动物实验伦理委员会批准，批准号为SYXK （闽）2013-0004。

实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。

写作指南：该研究遵守国际医学期刊编辑委员会《学术研究实验
与报告和医学期刊编辑与发表的推荐规范》。

文章查重：文章出版前已经过专业反剽窃文献检测系统进行3次
查重。

文章外审：文章经小同行外审专家双盲外审，同行评议认为文章
符合期刊发稿宗旨。

生物统计学声明：文章统计学方法已经通过中国人民解放军联勤
保障部队第900医院生物统计学专家审核。

文章版权：文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关
协议。

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