硕士研究生课现代分子生物学核酸研究进展李恩民
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SYBR Green I ❖ 结合到双链DNA的小沟部位 ❖ 只有和双链DNA结合后才发荧
光
SYBR Green I 工作原理
核酸实验研究技术进展－1
未结合的SYBR green I
SYBR Green I的优点 ➢ 价格相对便宜 ➢ 使用简便 ➢ 可以用于不同的模板 ➢ 灵敏度很高 SYBR Green I的缺点 ➢ 特异性较差
例三：
Northern blotting 检测缺 氧复氧条件下心 肌细胞EGR1基 因转录mRNA 实 验结果
同位素法 EGR1
核酸实验研究技术进展－1
核酸实验研究技术进展－1
➢ 确保杂交法实验成功的八个关键点： 关键点1：确保实验方案设计合理。 关键点2：确保探针的特异性充分。 关键点3：确保检测的灵敏度足够高。 关键点4：确保样本质量合格。 关键点5：确保实验试剂质量合格。 关键点6：确保实验过程规范。 关键点7：对于编码序列的cDNA，要确保没有RNA的干扰。 关键点8：几种杂交法，或杂交法与其它方法联合使用，相互印证
▪ 起始模板浓度的对数与Ct呈 线性关系，根据样品的Ct值 就可计算出样品中所含的初 始模板数。
核酸实验研究技术进展－1
104 103 102 Threshold
常用的定量PCR荧光探针 ➢ SYBR Green I ➢ Taqman水解探针 ➢ 分子信标
核酸实验研究技术进展－1
核酸实验研究技术进展－1
核酸实验研究技术进展－1
目标片段边缘序列的测定结果有时不准确例子
核酸实验研究技术进展－1
Poly A tail
核酸实验研究技术进展－1
测定实验标本中目标核酸分子的含量
核酸实验研究技术进展－1
核酸实验研究技术进展－1
➢ 通过 Dot blotting，结合斑点光密度扫描分析 ，测定实验标本中目标mRNA分子、目标cDNA分子 或目标DNA分子的含量
确保实验结果可靠。
核酸实验研究技术进展－1
3) 测序法：通过电泳等手段已知实验生物系统中目标核酸的大 致大小，而且是对照生物系统中不存在，或者两者相比在含 量上可能有显著差别，然而序列未知。
优点： 可信度最高。 对于解析鉴定未知核酸分子序列片 段是必需的手段。
缺点：目标片段边缘序列的测定结果有时不准确，在读原初 测序图时要格外小心。
A: 食管癌细胞SHEEC B: 永生化食管上皮细胞SHEE
核酸实验研究技术进展－1
例二：Northern blotting 检测缺氧复氧条件下心肌细胞EGR1基 因转录mRNA 相对含量实验结果(同位素标记法)
1 2 34 5 1 2345
EGR1
-Actin
1 正常 2 缺氧复氧 3 缺氧复氧＋溶剂对照 4 缺氧复氧＋F2 5 缺氧复氧＋钙离子拮抗剂
剂相邻，不发生特异荧光
光
发出特异荧光
延伸时，Taq酶水解探针，荧光基团与荧
Taq
光淬灭剂分离，发出特异荧光。
核酸实验研究技术进展－1
TaqMan Probes的优点： • 定量关系准确。随着扩增循环数增加，TaqMan探
针释放出来的荧光基团成倍增加，荧光强度与扩增 产物的数量呈正比关系。 • TaqMan探针特别适合于病毒定量、基因转录水平 定量、癌细胞基因微突变检测等。 • 敏感性高。 • 特异性高。 TaqMan Probes的缺点： • 只适合于一个特定目标的检测。
➢ 核糖核酸酶保护分析（Ribonuclease Protection Assay，RPA ）是一种 较好的mRNA定量检测技术。
➢ RPA的各项实验指标均优于Northern Blotting。 ➢ 运用RPA可实现对目标RNA分子的高通量定量检测。
核酸实验研究技术进展－1
原理： ➢ 以目标基因DNA为模板，利用32P-（放射法）或生物素（非放
核酸实验研究技术进展－1
➢ 通过 Southern blotting ，结合条带光密度扫描分 析，测定实验标本中目标DNA分子的含量
核酸实验研究技术进展－1
➢ 通过 Southern blotting ，结合条带光密度扫描分 析，测定实验标本中目标DNA分子的含量
核酸实验研究技术进展－1
核糖核酸酶保护分析 Ribonuclease Protection Assay (RPA)
上，针对目标DNA分子或RNA分子进行杂交检测。 Southern blotting：在电泳后，针对目标DNA分子的杂交检测。 Northern blotting：在电泳后，针对目标RNA分子的杂交检测。 目标DNA分子原位杂交检测。 目标RNA分子原位杂交检测。
核酸实验研究技术进展－1
➢ 杂交法的优点与缺点： 优点： Dot blotting：简单实用，适于进行大样本数同时检测。
Northern blotting：如果检测结果阳性，其可信度要远远高于 RT-PCR，因此被誉为评价基因转录的Golden Marker。 Southern blotting：对DNA病毒类病原体等的检测实用性很强 。 缺点： Dot blotting：由于在同一斑点位置，除了目标核酸分子 外，同时还存在其它的成千上万种不同的核酸分子，而这些核酸 分子有可能会与探针分子部分结合，这会促进探针分子与目标核 酸分子的结合，因此将可能导致阳性结果放大，甚至是假阳性结 果。 Northern blotting：对低拷贝mRNA有时检测不出来，容 易导致假阴性结果。
分子信标优点： • 分子信标能特异性地检测目标DNA • 分子信标可用于单核苷酸多态性的检测 • 特别适用于检测点突变
分子信标的缺点 • 只能用于一个特定的目标 • 设计困难 • 价格较高
核酸实验研究技术进展－1
核酸实验研究技术进展－1
❖ 适时荧光定量PCR ❖ Real time fluorescent quantitation PCR
核酸实验研究技术进展－1
适时荧光定量PCR与常规PCR的本质区别 • 常规PCR技术：对PCR扩增反应的终产物进行定性定量或半
定量分析 • 适时荧光定量PCR技术：通过一个特殊的荧光探针，对PCR
B 食管癌细胞
SHEEC
核酸实验研究技术进展－1
➢ 通过 RT-PCR，结合条带光密度扫描分析，测定实验 标本中目标mRNA分子或目标cDNA分子的含量
核酸实验研究技术进展－1
例子：RT-PCR 检测SHEEC食管癌细胞与永生化食管上皮 细胞SHEE中 NGAL基因转录mRNA相对含量实验结果
ABM
ABM
NGAL 600bp
GAPDH 226bp
A: 永生化食管上皮细胞SHEE B: 食管癌细胞SHEEC
M: DNA marker
两个问题： 反转录PCR实验是否需要探针 ？ 反转录PCR的特异性如何保证 ？
核酸实验研究技术进展－1
核酸实验研究技术进展－1
➢ 通过 Northern blotting，结合条带光密度扫描分 析，测定实验标本中目标mRNA分子的含量
分子信标 (发夹型杂交探针)
环（15-30bp）
核酸实验研究技术进展－1
环与目标序列互补
FAM 荧光基团
Texas Red
茎(5-7bp)
茎由互补配对的序 列组成
淬灭剂
分子信标工作原理
光 荧光基团
环
茎 淬灭剂
＋
光
发出荧光
核酸实验研究技术进展－1
单链DNA 模板
探针与DNA模板杂交
核酸实验研究技术进展－1
核酸实验研究技术进展－1
例一：Northern blotting 检测SHEEC食管癌细胞与永生化食管上皮 细胞SHEE中 NGAL基因转录mRNA相对含量实验结果（化学发光）
AB
NGAL
AB
AB
500 -
400 -
300 -
GAPDH
80 60 40 20 -
核酸实验研究技术进展－1
例子：cDNA microarray （反向 Dot blotting） 检测 SHEEC食管癌细胞与永生化食管上皮细胞SHEE中 NGAL基因转录mRNA相对含量实验结果
A 永生化食管 上皮细胞
SHEE
判断标准： B/A 2或 0.5为显著性 差异表达
实际情况： B/A＝3.53
，确保实验结果可靠。
核酸实验研究技术进展－1
2) PCR法：序列已知，同时还要合成一对特异性引物。
优点： 实验的灵敏度很高，理论上可检测实验生物系统 中所存在的1个拷贝目标核酸分子。 阴性结果的可信度很 高。
缺点：由于容易存在样本污染情况，与此同时，毕竟在实验 过程中存在着目标核酸分子拷贝数人为放大这样一个事实， 因此，其阳性结果的可信度不如Northern boltting 或 Southern boltting。
核酸实验研究技术进展－1
例子：
RT-PCR检测 SHEEC食管癌 细胞NGAL基因 转录mRNA实验 结果
SM
NGAL 600bp
S: 食管癌细胞SHEEC
M: DNA marker
核酸实验研究技术进展－1
➢ 确保PCR法实验成功的八个关键点： 关键点1：确保实验方案设计合理。 关键点2：确保引物的特异性充分。 关键点3：确保样本质量合格。 关键点4：确保实验试剂质量。 关键点5：确保实验过程规范。 关键点6：确保PCR变性、退火和延伸温度适度。 关键点7：对于编码序列cDNA，要确保没有RNA的干扰。 关键点8：几种PCR法，或PCR法与其它方法联合使用，相互印证，
射法）作为标记信号，体外转录合成反义RNA探针。 ➢ 将过量的反义RNA探针与样品总RNA杂交，然后进行核糖核酸
酶处理。未与探针杂交的单链RNA和过量的游离探针被降解， 而目标RNA则因与探针结合形成双链而被‘保护’。 ➢ 杂交双链进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，用放射自显影或化学 发光等方法确定目标RNA的量。
硕士研究生课现代分子生物 学核酸研究进展李恩民
核酸实验研究技术进展－1
➢证明目标核酸分子是否存在于实验标本中的基本实验方法 ： ➢1）杂交法，2）PCR法，3）测序法。
核酸实验研究技术进展－1
1) 杂交法：序列已知，同时还要合成一个标记了的特异性探针。 Dot blotting：不经过电泳，直接把检测样本点在一个适宜载体
核酸实验研究技术进展－1
核酸实验研究技术进展－1
TaqMan Probes
荧光素
FAM
TET
JOE
HEX
与目标序列互补
VIC
淬灭剂
TAMRA DABCYL
TaqMan Probes工作原理
荧光基团
淬灭剂 游离的探针
核酸实验研究技术进展－1
光
能量转移
另一波长的荧光
Taq
探针与目标序列配对 ，荧光基团与荧光淬灭
例一： cDNA microarray 检测SHEEC食管 癌细胞NGAL基因 mRNA转录实验 结果
反向 Dot blotting
核酸实验研究技术进展－1
例二：
Northern blotting检测 SHEEC食管癌 细胞NGAL基因 转录mRNA实验 结果
核酸实验研究技术进展－1
化学发光法
NGAL
扩增反应中每一次循环的产物进行适时跟踪定量分析
real time PCR 的扩增曲线
核酸实验研究技术进展－1
核酸实验研究技术进展－1
PE公司在同一台PCR仪上对相同模板进行96次扩增的扩增曲线 图
Ct值极具重现性
Ct与初始模板的关系
▪ 固定循环数后，荧光信号值 与模板数成正比
▪ 固定荧光信号值后，循环数 与初始模板数成反比。初始 模板数越多, 荧光信号达到 阈值时所需要的循环数(Ct 值)越少
光
SYBR Green I 工作原理
核酸实验研究技术进展－1
未结合的SYBR green I
SYBR Green I的优点 ➢ 价格相对便宜 ➢ 使用简便 ➢ 可以用于不同的模板 ➢ 灵敏度很高 SYBR Green I的缺点 ➢ 特异性较差
例三：
Northern blotting 检测缺 氧复氧条件下心 肌细胞EGR1基 因转录mRNA 实 验结果
同位素法 EGR1
核酸实验研究技术进展－1
核酸实验研究技术进展－1
➢ 确保杂交法实验成功的八个关键点： 关键点1：确保实验方案设计合理。 关键点2：确保探针的特异性充分。 关键点3：确保检测的灵敏度足够高。 关键点4：确保样本质量合格。 关键点5：确保实验试剂质量合格。 关键点6：确保实验过程规范。 关键点7：对于编码序列的cDNA，要确保没有RNA的干扰。 关键点8：几种杂交法，或杂交法与其它方法联合使用，相互印证
▪ 起始模板浓度的对数与Ct呈 线性关系，根据样品的Ct值 就可计算出样品中所含的初 始模板数。
核酸实验研究技术进展－1
104 103 102 Threshold
常用的定量PCR荧光探针 ➢ SYBR Green I ➢ Taqman水解探针 ➢ 分子信标
核酸实验研究技术进展－1
核酸实验研究技术进展－1
核酸实验研究技术进展－1
目标片段边缘序列的测定结果有时不准确例子
核酸实验研究技术进展－1
Poly A tail
核酸实验研究技术进展－1
测定实验标本中目标核酸分子的含量
核酸实验研究技术进展－1
核酸实验研究技术进展－1
➢ 通过 Dot blotting，结合斑点光密度扫描分析 ，测定实验标本中目标mRNA分子、目标cDNA分子 或目标DNA分子的含量
确保实验结果可靠。
核酸实验研究技术进展－1
3) 测序法：通过电泳等手段已知实验生物系统中目标核酸的大 致大小，而且是对照生物系统中不存在，或者两者相比在含 量上可能有显著差别，然而序列未知。
优点： 可信度最高。 对于解析鉴定未知核酸分子序列片 段是必需的手段。
缺点：目标片段边缘序列的测定结果有时不准确，在读原初 测序图时要格外小心。
A: 食管癌细胞SHEEC B: 永生化食管上皮细胞SHEE
核酸实验研究技术进展－1
例二：Northern blotting 检测缺氧复氧条件下心肌细胞EGR1基 因转录mRNA 相对含量实验结果(同位素标记法)
1 2 34 5 1 2345
EGR1
-Actin
1 正常 2 缺氧复氧 3 缺氧复氧＋溶剂对照 4 缺氧复氧＋F2 5 缺氧复氧＋钙离子拮抗剂
剂相邻，不发生特异荧光
光
发出特异荧光
延伸时，Taq酶水解探针，荧光基团与荧
Taq
光淬灭剂分离，发出特异荧光。
核酸实验研究技术进展－1
TaqMan Probes的优点： • 定量关系准确。随着扩增循环数增加，TaqMan探
针释放出来的荧光基团成倍增加，荧光强度与扩增 产物的数量呈正比关系。 • TaqMan探针特别适合于病毒定量、基因转录水平 定量、癌细胞基因微突变检测等。 • 敏感性高。 • 特异性高。 TaqMan Probes的缺点： • 只适合于一个特定目标的检测。
➢ 核糖核酸酶保护分析（Ribonuclease Protection Assay，RPA ）是一种 较好的mRNA定量检测技术。
➢ RPA的各项实验指标均优于Northern Blotting。 ➢ 运用RPA可实现对目标RNA分子的高通量定量检测。
核酸实验研究技术进展－1
原理： ➢ 以目标基因DNA为模板，利用32P-（放射法）或生物素（非放
核酸实验研究技术进展－1
➢ 通过 Southern blotting ，结合条带光密度扫描分 析，测定实验标本中目标DNA分子的含量
核酸实验研究技术进展－1
➢ 通过 Southern blotting ，结合条带光密度扫描分 析，测定实验标本中目标DNA分子的含量
核酸实验研究技术进展－1
核糖核酸酶保护分析 Ribonuclease Protection Assay (RPA)
上，针对目标DNA分子或RNA分子进行杂交检测。 Southern blotting：在电泳后，针对目标DNA分子的杂交检测。 Northern blotting：在电泳后，针对目标RNA分子的杂交检测。 目标DNA分子原位杂交检测。 目标RNA分子原位杂交检测。
核酸实验研究技术进展－1
➢ 杂交法的优点与缺点： 优点： Dot blotting：简单实用，适于进行大样本数同时检测。
Northern blotting：如果检测结果阳性，其可信度要远远高于 RT-PCR，因此被誉为评价基因转录的Golden Marker。 Southern blotting：对DNA病毒类病原体等的检测实用性很强 。 缺点： Dot blotting：由于在同一斑点位置，除了目标核酸分子 外，同时还存在其它的成千上万种不同的核酸分子，而这些核酸 分子有可能会与探针分子部分结合，这会促进探针分子与目标核 酸分子的结合，因此将可能导致阳性结果放大，甚至是假阳性结 果。 Northern blotting：对低拷贝mRNA有时检测不出来，容 易导致假阴性结果。
分子信标优点： • 分子信标能特异性地检测目标DNA • 分子信标可用于单核苷酸多态性的检测 • 特别适用于检测点突变
分子信标的缺点 • 只能用于一个特定的目标 • 设计困难 • 价格较高
核酸实验研究技术进展－1
核酸实验研究技术进展－1
❖ 适时荧光定量PCR ❖ Real time fluorescent quantitation PCR
核酸实验研究技术进展－1
适时荧光定量PCR与常规PCR的本质区别 • 常规PCR技术：对PCR扩增反应的终产物进行定性定量或半
定量分析 • 适时荧光定量PCR技术：通过一个特殊的荧光探针，对PCR
B 食管癌细胞
SHEEC
核酸实验研究技术进展－1
➢ 通过 RT-PCR，结合条带光密度扫描分析，测定实验 标本中目标mRNA分子或目标cDNA分子的含量
核酸实验研究技术进展－1
例子：RT-PCR 检测SHEEC食管癌细胞与永生化食管上皮 细胞SHEE中 NGAL基因转录mRNA相对含量实验结果
ABM
ABM
NGAL 600bp
GAPDH 226bp
A: 永生化食管上皮细胞SHEE B: 食管癌细胞SHEEC
M: DNA marker
两个问题： 反转录PCR实验是否需要探针 ？ 反转录PCR的特异性如何保证 ？
核酸实验研究技术进展－1
核酸实验研究技术进展－1
➢ 通过 Northern blotting，结合条带光密度扫描分 析，测定实验标本中目标mRNA分子的含量
分子信标 (发夹型杂交探针)
环（15-30bp）
核酸实验研究技术进展－1
环与目标序列互补
FAM 荧光基团
Texas Red
茎(5-7bp)
茎由互补配对的序 列组成
淬灭剂
分子信标工作原理
光 荧光基团
环
茎 淬灭剂
＋
光
发出荧光
核酸实验研究技术进展－1
单链DNA 模板
探针与DNA模板杂交
核酸实验研究技术进展－1
核酸实验研究技术进展－1
例一：Northern blotting 检测SHEEC食管癌细胞与永生化食管上皮 细胞SHEE中 NGAL基因转录mRNA相对含量实验结果（化学发光）
AB
NGAL
AB
AB
500 -
400 -
300 -
GAPDH
80 60 40 20 -
核酸实验研究技术进展－1
例子：cDNA microarray （反向 Dot blotting） 检测 SHEEC食管癌细胞与永生化食管上皮细胞SHEE中 NGAL基因转录mRNA相对含量实验结果
A 永生化食管 上皮细胞
SHEE
判断标准： B/A 2或 0.5为显著性 差异表达
实际情况： B/A＝3.53
，确保实验结果可靠。
核酸实验研究技术进展－1
2) PCR法：序列已知，同时还要合成一对特异性引物。
优点： 实验的灵敏度很高，理论上可检测实验生物系统 中所存在的1个拷贝目标核酸分子。 阴性结果的可信度很 高。
缺点：由于容易存在样本污染情况，与此同时，毕竟在实验 过程中存在着目标核酸分子拷贝数人为放大这样一个事实， 因此，其阳性结果的可信度不如Northern boltting 或 Southern boltting。
核酸实验研究技术进展－1
例子：
RT-PCR检测 SHEEC食管癌 细胞NGAL基因 转录mRNA实验 结果
SM
NGAL 600bp
S: 食管癌细胞SHEEC
M: DNA marker
核酸实验研究技术进展－1
➢ 确保PCR法实验成功的八个关键点： 关键点1：确保实验方案设计合理。 关键点2：确保引物的特异性充分。 关键点3：确保样本质量合格。 关键点4：确保实验试剂质量。 关键点5：确保实验过程规范。 关键点6：确保PCR变性、退火和延伸温度适度。 关键点7：对于编码序列cDNA，要确保没有RNA的干扰。 关键点8：几种PCR法，或PCR法与其它方法联合使用，相互印证，
射法）作为标记信号，体外转录合成反义RNA探针。 ➢ 将过量的反义RNA探针与样品总RNA杂交，然后进行核糖核酸
酶处理。未与探针杂交的单链RNA和过量的游离探针被降解， 而目标RNA则因与探针结合形成双链而被‘保护’。 ➢ 杂交双链进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，用放射自显影或化学 发光等方法确定目标RNA的量。
硕士研究生课现代分子生物 学核酸研究进展李恩民
核酸实验研究技术进展－1
➢证明目标核酸分子是否存在于实验标本中的基本实验方法 ： ➢1）杂交法，2）PCR法，3）测序法。
核酸实验研究技术进展－1
1) 杂交法：序列已知，同时还要合成一个标记了的特异性探针。 Dot blotting：不经过电泳，直接把检测样本点在一个适宜载体
核酸实验研究技术进展－1
核酸实验研究技术进展－1
TaqMan Probes
荧光素
FAM
TET
JOE
HEX
与目标序列互补
VIC
淬灭剂
TAMRA DABCYL
TaqMan Probes工作原理
荧光基团
淬灭剂 游离的探针
核酸实验研究技术进展－1
光
能量转移
另一波长的荧光
Taq
探针与目标序列配对 ，荧光基团与荧光淬灭
例一： cDNA microarray 检测SHEEC食管 癌细胞NGAL基因 mRNA转录实验 结果
反向 Dot blotting
核酸实验研究技术进展－1
例二：
Northern blotting检测 SHEEC食管癌 细胞NGAL基因 转录mRNA实验 结果
核酸实验研究技术进展－1
化学发光法
NGAL
扩增反应中每一次循环的产物进行适时跟踪定量分析
real time PCR 的扩增曲线
核酸实验研究技术进展－1
核酸实验研究技术进展－1
PE公司在同一台PCR仪上对相同模板进行96次扩增的扩增曲线 图
Ct值极具重现性
Ct与初始模板的关系
▪ 固定循环数后，荧光信号值 与模板数成正比
▪ 固定荧光信号值后，循环数 与初始模板数成反比。初始 模板数越多, 荧光信号达到 阈值时所需要的循环数(Ct 值)越少