安可胶对BALBc小鼠的免疫原性影响

基础研究
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安可胶对BALB/c小鼠的免疫原性影响
司　玮1　许辞中2　刘　晶3
1南京市食品药品监督检验院 江苏省南京市 210000 2南京市餐饮服务食品安全监督所 江苏省南京市 210000
3江苏省药物研究所 江苏省南京市 210000
【摘　要】目的：研究安可胶的免疫原性和免疫效果，为该药物安全评价和进一步优化提供实验依据。

方法：安可胶是模仿凝血机制的最后共同通路设计成的止血制剂，自2015年2月至2015年8月，本研究在江苏省药物安评中心进行，按临床等效剂量设高中低剂量组及空白对照，通过对32例BALB/c小鼠免疫器官质量及脏器指数分析、噻唑蓝(MTT)比色法检测脾淋巴细胞增殖、氯化硝基四氮唑蓝(NTB)还原法检测中性粒细胞吞噬能力，揭示安可胶对小鼠免疫系统的影响。

结果：小鼠免疫器官质量及脏器指数均未发生明显改变；与对照组相比，各组小鼠淋巴细胞增殖指数无明显差异，试验组中性粒细胞吞噬功能显著性增强，粒细胞吞噬百分率升高，与阴性组相比，有极显著统计学差异。

结论：安可胶可增加脾细胞的转化能力，并对小鼠免疫器官重量有影响，但在小鼠体内未表现出特异性免疫反应。

【关键词】安可胶；免疫原性抗体；抗凝
安可胶是模仿凝血机制的最后共同通
路设计成的止血制剂，由两种成分组成，
A液含较高浓度的纤维蛋白原和XIII因子，
B液含钙离子和凝血酶，两液混合后纤维
蛋白原和凝血酶接触，形成类似外凝血过
程的最后阶段，产生可溶性多聚体纤维蛋
白网，发挥止血封闭作用，并能有效促进
创面愈合[1、2]。

但由于本品来源于哺乳动
物的血清，因此其免疫原性研究对该品种
在临床上的安全应用及推广显得尤为重要。

自2015年2月起，至2015年8月，本研
究对安可胶进行免疫原性试验，观察其对
32例BALB/c小鼠免疫系统的影响，为临
床用药安全提供参考依据。

1 材料
1.1 实验动物
BALB/c小鼠：SPF级32只18-21g，
随机分成4组，每组8只，雌雄各半。

1.2 主要试剂
刀豆蛋白A（ConA）：SIGMA公司
提供；脂多糖（LPS）：SIGMA公司提供；
四甲基偶氮唑兰（MTT）：Amresco公司
提供；氯化硝基四氮唑蓝（NBT）：上海
灵锦精细化工有限公司提供；十二烷基磺
酸钠（SDS）：Amresco公司提供；番红
花红T：上海灵锦精细化工有限公司提供。

2 试验方法
2.1 给药方法及检测
采用安可胶100 mg/kg、 50 mg/kg、
25 mg/kg、阴性对照4组，注射给药后第7
天，采抗凝血0.5 ml，加入等量的NBT溶液。

番红花红T染色，洗涤，干燥，油镜检测。

血涂片中嗜中性粒细胞能还原NBT10%以
下，为NBT试验阴性，10%以上则为阳性。

2.2 免疫器官重量
给药第7天称体重，取胸腺、脾脏称重，
计算免疫器官指数[3]。

胸腺或脾脏指数 =
2.3 小鼠T、B淋巴细胞转化试验
给药第7天，脾脏剪碎后过200目不
锈钢筛网，用PBS预冷冲洗后收集细胞悬
液，以1000 rpm离心5min，弃上清液，
用 NH4Cl 裂解红细胞，重复离心弃上清
后，用完全培养基调细胞浓度至1.0×106/
ml， 96孔板内每孔加入180ul。

每只动物
设PBS 对照孔、ConA刺激孔(ConA终
浓度10ug/ml)、LPS刺激孔(LPS终浓度
10ug/ml)。

在37℃下孵育48 h，弃上清
100ul，加入10ul MTT工作液，加入100ul
10% SDS裂解结晶紫颗粒，于570 nm波
长紫外测A570值，并计算细胞增殖指数
（Proliferation index，Prol.）[3、4]。

Prol. (%) = (-1)×100%
2.4 统计方法
采用SPSS12.0软件中one-way
ANOV A进行统计学分析。

结果P<0.05 表
示有统计学意义。

3 结果
3.1 安可胶对免疫器官指数的影响
由表1可以看出，给于安可胶后，小
鼠的胸腺和脾脏重量有一定程度的增加，
但与阴性对照组相比，差异不很明显。

3.2 安可胶对脾细胞转化的影响
细胞增殖实验表明，给于安可胶后，
脾细胞在ConA诱导下，增殖能力增强，
增殖指数有一定程度的增加，但与阴性对
照组相比，无统计学差异（见表2）。

3.3 安可胶对嗜中性粒细胞功能的影响
嗜中性粒细胞还原NBT试验结果表
明，安可胶能明显增强嗜中性粒细胞的吞
噬功能，与空白组相比，差异极显著（见
表3）。

4 结论
在临床上安可胶可与凝血酶混合使用
形成纤维蛋白，在临床外科止血、组织创
伤修复等都有非常好的作用。

因有生物相
容性好，缓释作用强和无毒性等优点已被
广泛应用[5]。

安可胶作为类似生物制品发
展前景乐观，但尚有许多问题待解决：其
中最重要是对其有效性和安全性的研究。

本试验采用了BALB/C小鼠动物模型来评
价其对免疫原性和免疫系统的刺激情况。

雷静等研究表明，小鼠体内的纤维蛋
白胶主要影响凝血系统，对免疫系统的脾
脏也有影响，可能存在潜在的免疫毒性[6]。

本研究为了有效的考量安可胶的安全性，
设计通过小鼠腹腔局部注射安可胶并测定
免疫后动物脏器指数，以了解相应免疫原
性及免疫毒性强弱。

给药后小鼠主要免疫
器官脏器增重及指数与阴性对照组相比变
化不明显，均无统计学差异。

表明在小鼠
体内该制剂对其免疫器官的影响程度不髙，
且与剂量无关。

在前期的研究中有结果提示，纤维蛋
白可主要通过淋巴细胞介导特异性免疫反
应[7]，纤维蛋白原对小鼠成纤维细胞以及
兔皮肤可能有一定的毒性作用[8]。

但在本
研究中，ConA作为一种有丝分裂原，可
诱导淋巴细胞产生细胞毒性作用。

再通过
MTT试验进行检测其增殖转化程度，用酶
标仪测定ConA和LPS等指标，其光吸收
值即可间接反映活细胞数量。

MTT结晶形
成的量与细胞数在一定细胞数范围内，也
可以反应与该细胞的增殖程度成正比。

在
本实验最终结果中，各组小鼠脾脏淋巴细
胞增殖能力和阴性对照组小鼠脾脏淋巴细
胞增值能力基本相当。

与阴性对照组相比，
对脾脏器官重量及脾细胞转化均稍有升高，
但无统计学差异。

说明安可胶刺激小鼠免Copyright©博看网 . All Rights Reserved.
2016.07
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疫应答不明显，对其特异性免疫影响很小，且与用药具体剂量无关性，从而也说明了其具有一定的安全性。

中性粒细胞在体内发挥吞噬病菌的功能，小鼠体内的中性粒细胞吞噬功能增强，在本研究的结果中，安可胶对可使嗜中性粒细胞功能明显增强，各给药组粒细胞吞噬百分率与阴性对照组相比显著增加，统计结果有极显著差异。

这也提示安可胶是异源蛋白，在小鼠体内可引起非特异性免疫作用。

小鼠试验安可胶在体内所表现的特异性免疫反应不明显。

综上所述，本研究在小鼠体内未表现出特异性免疫反应，但可部分预测安可胶对人的免疫原性反应，对于临床应用亦可作为参考和提示。

参考文献
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作者简介
司玮（1981-），女，江苏省南京市人。

硕士学位。

现为南京市食品药品监督检验院工程师，主要从事食品药品安全研究工作。

通讯作者简介
刘晶（1973-），男，江苏省盐城市人。

硕士学位。

现为南京市餐饮服务食品安全监督所研究员，主要从事食品药品安全研究工作。

表1：安可胶对小鼠免疫器官的影响)
组 别剂 量(mg/kg)
胸腺重(mg)脾脏重（mg ）胸 腺 指 数(mg/g)脾脏指数 (mg/g)阴性对照组-37.625±9.96789.875±10.148 1.737±0.502 4.155±0.770低剂量组25.042.563±13.58991.250±10.964 1.970±0.674 4.193±0.456中剂量组50.039.063±8.65797.875±15.094 1.753±0.419 4.400±0.826高剂量组
100.0
45.000±9.815
101.500±13.887
2.060±0.505
4.643±0.768
表2：安可胶对脾细胞转化的影响)
组 别剂 量(mg/kg)
A 570(ConA)A 570(LPS)增殖指数(ConA)增殖指数(LPS)阴性对照组-0.415±0.1510.308±0.058169.6±88.0100.3±27.3低剂量组25.00.478±0.1270.305±0.096230.9±82.1111.6±69.8中剂量组50.00.576±0.2330.360±0.063254.3±88.2130.1±38.2高剂量组
100.0
0.601±0.441
0.342±0.163
246.9±171.0
109.4±65.6
表3：安可胶对嗜中性粒细胞功能的影响)
组 别剂 量(mg/kg)
吞噬百分率（%）
阴性对照组-8.33±4.69低剂量组25.032.50±12.56***中剂量组50.035.82±6.11***高剂量组
100.0
37.50±17.44***
与阴性对照组比：*** p<0.001Copyright©博看网 . All Rights Reserved.。