3.烟草愈伤组织的诱导及细胞悬浮培养体系的建立

基金项目:河南省科技厅“烟草细胞和发状根培养中茄尼
醇的合成研究”
(524420033)项目和郑州大学青年骨干教师资助项目“烟草中萜烯类次生代谢物的合成研究”资助。

作者简介:岳彩鹏(1974-),女,博士,郑州大学讲师,主要从事烟草生理研究。

E 2mail:yuecai peng@zzu .edu .cn 收稿日期:2007-05-21
责任编辑:董志坚　E 2mail:yckj2256@yahoo 电话:0371267672650
烟草愈伤组织的诱导及细胞悬浮培养体系的建立
岳彩鹏,李　品,黄象男,朱大恒
郑州大学生物工程系,郑州市科学大道100号　450001
关键词:烟草;愈伤组织;悬浮培养;白肋烟;鄂烟1号
摘要:以鄂烟1号无菌苗的叶为材料进行愈伤组织的诱导,筛选出生长培养基的最佳激素配比,初步建立了烟草细胞悬浮培养体系。

结果表明,愈伤组织诱导的最优基本培养基为MS 培养基,以MS +NAA 110mg /L +6-BA 0.5mg/L 为最佳配方;愈伤组织最佳生长培养基为MS +2,4-D 011mg/L +NAA 115mg/L +6-BA 013mg/L,愈伤组织培养第6天进入对数生长期,第14天干重增至最初干重的12.536倍,并以此配方建立了烟草细胞悬浮培养体系。

中图分类号:S572.01　文献标识码:B 文章编号:1002-0861(2007)10-0056-04Tobacco Ca llus I nducti on and Est ablish m en t of Cell Suspen si on Culture Syste m Y UE CA I 2PENG,L I P I N ,HUANG X I A NG 2NAN,and Z HU DA 2HENG B i oengineering Depart m ent,Zhengzhou University,Zhengzhou 450001,China Keywords:T obacco;Callus;Sus pensi on culture;Burley t obacco;E ’yan 1
Abstract:The callus inducti on was carried out with the leaves of asep tic seedling of t obacco E ’yan 1,and the op ti m al hor mone p r oporti on in culture medium was screened out,and the syste m of t obacco cell sus pensi on culture was established p reli m inarily .The results showed thatMS was the op ti m al basic mediu m for callus inducti on,and the op ti m al f or mula was MS +NAA 1.0mg/L +62BA 0.5mg/L;while the op ti m al f or mula for culture mediu m of callus wasMS +2,42D 0.1mg/L +NAA 1.5mg/L +62BA 0.3mg/L.On the 6th day of callus culturing,the l ogarith m gr owth peri od started;and on the 14th day,the dry weight increased t o 12.536ti m es of its initial dry weight .The syste m of t obacco cell sus pensi on culture was established based on this f or mula .
组织培养不仅是一种植物快速繁殖的手段,同时也是植物改良、种质保存和次生物质生产的
理想途径[1]。

有关烟草组织和细胞培养已有不
少报道[225]
,近年来在抗性研究、基因转化和次生
物质生产等方面也取得一些进展[629]。

有研究表
明
[10]
,以植物悬浮培养细胞为材料生产次生代谢
物具有培养周期短、材料均一、重复性好等优点。

烟草中含有大量次生代谢物,因此,建立稳定而具
有高活力的烟草悬浮培养细胞体系对次生代谢物的生产有重要意义。

到目前在白肋烟的愈伤组织培养和细胞悬浮培养方面的研究报道较少。

本试验以白肋烟鄂烟1号的叶为材料进行了愈伤组织的诱导,确定获得脆散性愈伤组织的最佳激素配比,并以此为基础建立起烟草细胞悬浮培养体系,旨在为烟草中次生物质的生物开发利用提供依据。

1　材料与方法
1.1　试验材料
鄂烟1号烟草种子,由郑州烟草研究院提供。

1.2　试验方法
1.2.1　无菌苗的获得
将烟草种子用70%酒精浸泡1m in,10% NaCl O消毒10m in,经无菌水漂洗后接种于无激素的MS固体培养基,28℃下暗培养,之后将未污染的发芽种子转接到MS
固体培养基上,于28℃下光照培养16h,得无菌种子幼苗。

1.2.2　初始愈伤组织诱导和基本生长培养基的筛选
取无菌苗叶片外植体,切成5mm×5mm的小块,接种在加有激素的3种基本培养基上,各处理见表1。

28℃下暗培养,15d后得到初始愈伤组织。

1.2.3　愈伤组织的继代和最佳生长培养基激素配比的筛选
在基本培养基筛选的基础上,筛选出最优基本培养基为MS培养基,其对激素配比做进一步的调整细化,见表2,选取长势较好的愈伤组织继代培养,筛选最佳生长培养基。

1.2.4　脆散性愈伤组织的获得
按已确定的生长培养基配方配制固体生长培养基,选择长势较好、黄白色的愈伤组织进行继
代,28℃下暗培养,第4代后获得脆散性愈伤组织。

1.2.5　愈伤组织的鲜重、干重生长倍增曲线的绘制
按已确定的最优生长培养基配方配制固体培养基,灭菌分装于三角瓶中。

将切好的脆散性愈伤组织称重后接种于编号的三角瓶中,记录m
1
;于28℃下暗培养,每2d取样1次,每次取样3
瓶,称取愈伤组织鲜重,记录m
2
;将愈伤组织烘干
至恒重,称重记录m
3。

每次取样的愈伤组织鲜重与干重倍增值的计算方法:
愈伤组织鲜重倍增值F=m
2
/m1
愈伤组织干重倍增值D=m
3
/(m1・115%)
式中:115%为接种愈伤组织的生物干重百分率。

依据愈伤组织鲜重与干重倍增值的平均值绘制生长曲线。

1.2.6　烟草细胞悬浮培养体系的建立
按已确定的生长培养基配方配制液体生长培养基,将疏松愈伤组织用玻璃棒碾碎,每瓶加入一定量的愈伤组织,pH值为5.7～518,28℃下摇床暗培养,摇床转速110r pm。

表1　诱导培养基的激素配比
激素(mg/L)
M S①B5②NT③
MS1M S2MS3MS4B51B52B53B54NT1NT2NT3NT4NT5NT6NT7
2,4-D④3.01.0——1.0———2.01.02.0————KT⑤0.20.5——0.5———0.20.50.5————NAA⑥——1.00.5—0.51.00.5———0.51.02.00.5 6-BA⑦——0.51.0—0.50.51.0———0.50.50.51.0
　注:①M urashige-Skoog培养基;②Ga mborg培养基;③Nagata-Takebe培养基;④2,4-二氯苯氧乙酸;⑤激动素;⑥萘
乙酸;⑦6-苄基氨基嘌呤。

表2　生长培养基的激素配比
编号2,4-D
(mg/L)
KT
(mg/L)
NAA
(mg/L)
6-BA
(mg/L)
MS5——0.50.3 MS6——0.50.5 MS4——0.51.0 MS7——0.750.5 MS8——0.750.75 MS9——1.00.3 MS3——1.00.5 M S10——1.00.75 M S11——1.50.3 M S12——2.00.3 M S130.10.02——M S140.10.05——M S150.10.1——编号
2,4-D
(mg/L)
KT
(mg/L)
NAA
(mg/L)
6-BA
(mg/L) MS160.10.2——MS170.10.3——MS180.50.1——MS190.50.2——MS200.50.3——MS210.30.02——MS221.00.2——MS232.00.2——MS240.1—0.50.5 MS250.1—0.50.3 MS260.1—1.50.3 MS270.3—1.50.3 MS280.1—2.00.3
2　结果与讨论
2.1　烟草愈伤组织的诱导和基本培养基的筛选
将烟草外植体接种到基本培养基上,28℃下
暗培养15d,观察外植体生长分化的情况,获得一系列不同分化程度的烟草愈伤组织,见表3。

由表3可见,3种基本培养基中激素组合NAA+6-BA的烟草愈伤组织诱导率优于2,4-D+KT,NT基本培养基上烟草愈伤组织的诱导率很低。

MS培养基的各种处理诱导出愈伤组织最快,约6～8d;B
5
基本培养基约为10～12d;在NT 基本培养基上的诱导时间较长,约35～40d,而且
外植体的死亡率也比MS和B
5
基本培养基高。

因此NT培养基不适合本实验材料愈伤组织的诱
导。

在MS培养基和B
5
培养基上,加2,4-D激素虽然有抑制芽分化的作用,但是浓度高于1.0 mg/L时会使愈伤组织变黑,对细胞生长不利。

MS培养基上,MS3(NAA1.0mg/L+6-BA0.5mg/L)的效果最好,烟草胚性愈伤组织的诱导率较高,没有褐化,MS4(NAA0.5mg/L+6-BA 1.0mg/L)次之,MS1(2,4-D3.0mg/L+KT0.2 mg/L)褐化严重;B5基本培养基上,B53(NAA 1.0mg/L+6-BA0.5mg/L)的效果最好,B54 (NAA0.5mg/L+6-BA1.0mg/L)次之。

可见, 3种培养基中MS基本培养基适合本实验材料外植体的诱导。

2.2　最佳生长培养基激素配比的筛选和脆散性愈伤组织的获得
在基本培养基中选择烟草细胞脱分化程度高、生长快的培养基配方MS+NAA1.0mg/L+6 -BA0.5mg/L、MS+NAA0.5mg/L+6-BA 1.0mg/L和MS+2,4-D1.0mg/L+KT0.5mg/ L,以此为基础对激素配比作进一步的调整(表2),选择长势较好,淡黄色的愈伤组织切成小块,接种到新鲜的培养基上。

28℃下暗培养15d,观察结果见表4。

表3　不同基本培养基烟草外植体愈伤组织的诱导
项目
MS B5NT
MS1MS2M S3MS4B51B52B53B54NT1NT2NT3NT4NT5NT6NT7
外植体数(个)2319141418991412161413141218愈伤组织数(个)231614141789120204120颜色发褐数(个)23801238010000000诱导率(%)10084.210010094.488.910085.7012.5030.87.116.70
表4　M S培养基上愈伤组织的生长状况
编号褐化程度①分化程度②愈伤组织体积大小
MS5+++++ MS6+++++ MS4+++++++++ MS7++++ MS8++++++ MS9++++ MS3+++++ M S10+++++ M S11++++ M S12++ M S13++++ M S14+++++ M S15+++++编号褐化程度①分化程度②
愈伤组织
体积大小MS16++++++ MS17+++++++ MS18++++ MS19+++ MS20++++++ MS21++++ MS22++++
MS23++++++ MS24+++++ MS25+++++ MS26+++++ MS27++++ MS28+++
　注:①“+”表示程度的高低。

愈伤组织体积大小是以愈伤块直径大小为依据,+:直径≤0.5c m;“++”:0.5c m<直径≤1cm;②+++:1c m<直径≤2c m;“++++”:2c m<直径≤4c m。

②分化程度是以分化率(长根长芽数与愈伤总数的比例)为依据,“+”:0<分化率≤20%;“++”:20%<分化率≤40%;“+++”:40%<分化率≤60%;“+++ +”:60%<分化率≤80%;“+++++”:80%<分化率≤100%。

颜色发褐程度是以黄白色为基准,“+”:浅褐色;“+ +”:褐色;“+++”:深褐色;“++++”:黑色。

由表4可以看出:2,4-D 和KT 组合中,KT 浓度一定时,2,4-D 比例越大,愈伤组织褐化有加重的趋势;2,4-D 一定时,KT 比例越大,愈伤组织分化程度越高。

并且该组合愈伤组织生长较慢,体积较小。

NAA 和6-BA 组合中,愈伤组织褐化不明显,在一定浓度范围内,NAA 有利于愈伤组织的生长,可一定程度地抑制愈伤组织分化;在一定的NAA 浓度下,6-BA 比例增大,愈伤组织分化程度加重。

总体来看,培养基配方中以MS26即MS +2,4-D 0.1mg/L +NAA 1.5mg/L +6-BA 0.3mg/L 的配比最佳,在该培养基上的愈伤组织生长快、疏松程度较好、脱分化程度较高。

该培养基可作为建立细胞悬浮系的生长培养
基。

这与刘卫群[11]
报导的MS +2,4-D 2mg/L +6-BA 0.5mg/L 烟草愈伤组织诱导效果最好和MS +NAA 1.5mg/L +6-BA 0.5mg/L 、MS +NAA 2.0mg/L +6-BA 0.5mg/L 愈伤组织生长最快不一致,可能是由于烟草品种和培养条件的不同所致。

2.3　愈伤组织生长倍增曲线的绘制
以MS +2,4-D 0.1mg/L +NAA 1.5mg/L +6-BA 0.3mg/L 配方配制固体培养基,选择长势较好、淡黄色的愈伤组织切成小块接种培养,每2d 取样1次,称鲜重和干重。

以愈伤组织鲜重、干重生长倍增值的平均值为纵坐标,取样时间为横坐标绘图(图1)。

由图1可见,在MS24(MS +2,4-D 0.1mg/L +NAA 1.5mg/L +6-BA 0.3mg/L )培养基上愈伤组织生长快,第6d 起开始快速生长,14d 时鲜重增至接种时鲜重的131269倍,干重增重121536倍,达到最高,16d 时有所下降,需要更换培养基再次继代。

该培养基可作为建立细胞悬浮系的生长培养基。

2.4　烟草细胞悬浮培养体系的建立
按已确定的最优配方即MS +2,4-D 0.1
mg/L +NAA 1.5mg/L +6-BA 0.3mg/L 制备液体生长培养基,在接种量10%、蔗糖浓度3%、
水
图1　烟草愈伤组织增长倍数曲线
解酪蛋白浓度0.1%、pH5.8、摇床转速110r pm 、28℃下暗培养,培养瓶中的悬浮系能够迅速生
长。

每15d 继代1次,每次继代时,将培养瓶静
置几分钟后,倒掉2/3原培养液,然后更换新培养瓶,加入新的培养液。

连续继代4代后,愈伤组织建立的细胞悬浮系生长迅速,颜色淡黄、分散性和均一性均较好,且能够较长期保存,可作为次生代谢物生产的培养体系。

3　小结
白肋烟鄂烟1号愈伤组织诱导的3种基本培养基中,MS 培养基优于B 5培养基,而NT 培养基不适合鄂烟1号愈伤组织的诱导。

MS +2,4-D 011mg/L +NAA 1.5mg/L +6-BA 0.3mg/L 为愈伤组织生长的最优配方,该配方愈伤组织脱分化程度高、颜色黄白、疏松、生长快,第6d 进入对数快速生长期,14d 重量达到最高。

以此配方进行细胞悬浮培养,继代4代后,建立了生长迅速、颜色淡黄、分散性和均一性均较好的细胞悬浮系。

参考文献
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