笔记7微生物的培养技术与应用

笔记7.微生物的培养技术及应用1.微生物的基本培养技术（1）培养基的配制
①概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。

②类型：A.按物理状态分类
培养基种类特点用途液体培养基不含凝固剂，呈液体状态工业生产固体培养基含凝固剂(如琼脂)，呈固体状态微生物的分离、鉴定，活菌计数，菌种保藏
B.按化学成分分类
C.按功能分类
③成分
成分含义
作用
来源
碳源提供碳元素的物质构成生物体的细胞的物质和一些代谢产物，有些也是异养生物的能源物质
无机碳源：CO 2、NaHCO 3等；有机碳源：糖类、牛肉膏(来源于动物，含有糖、维生素和有机氮等营养物质)等氮源提供氮元素的物质
合成蛋白质、核酸等物质无机氮源：N 2、NH 3、铵盐、硝酸盐等；有机氮源：蛋白胨等无机盐为微生物提供除碳、氮之外的各种重要元素，包括大量元素和微量元素为微生物提供无机营养，调节培养基的pH 等
无机化合物：KH 2PO 4、K 2HPO 4、NaCl 等
水
生物体含量最高的无机化合物
良好的溶剂，参与化学反应等
培养基、代谢产物
【特别提醒】除了上述主要营养物质外，还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的需求。

例如，在培养乳酸杆菌时，需要在培养基中添加维生素；在培养霉菌时，一般需要将培养基调至酸性；在培养细菌时，一般需要将(2)无菌技术
①目的：获得纯净培养物。

②关键：防止外来杂菌的入侵。

培养基种类特点用途天然培养基
含
化学成分不明确
的天然物质
工业生产
合成培养基培养基成分明确
(用化学成分已知的化学物质配成)微生物的分类、鉴定种类
制备方法
原理
用途
举例
选择培养基培养基中加入某些化学物质
依据微生物对某些物质的特殊需求或抗性从众多微生物中分离所需的微生物加入青霉素分离得到
酵母菌和霉菌
鉴别培养基培养基中加入某种指示剂或化学药品
产生特定的颜色或其他变化鉴别不同种类的微生物用伊红—亚甲蓝
培养基
鉴别大肠杆菌
③区别：消毒与灭菌的比较比较项目条件结果
常用方法应用范围消毒
较为温和的
物理或化学方法杀死物体表面或内部的部分微生物煮沸消毒法日常用品巴氏消毒法不耐高温的液体
化学药物消毒法操作空间、操作者的衣物和手等紫外线消毒法接种室、接种箱或超净工作台
灭菌
强烈的理化因素
杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子
高压蒸汽灭菌法培养基、容器等
干热灭菌法玻璃器皿、金属用具等
灼烧灭菌法接种工具等
【特别提醒】选择无菌技术的原则：一要考虑无菌技术的效果，灭菌的效果比消毒要好；二要考虑操作对象的承受能力，活体生物材料、操作者的手等只能采用消毒，而不能用灭菌。

④其他操作
A.做好消毒和灭菌工作后，要注意避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品接触。

B.为了避免周围环境中微生物的污染，接下来的许多操作都应在超净工作台上并在酒精灯火焰附近进行。

教材隐性知识：源于选择性必修3P10“相关信息”：生物消毒法是指利用生物或其代谢物除去环境中的部分微生物的方法。

（3）微生物的纯培养①概念:由单一个体
繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物,获得纯培养物的过程就是纯培养。

②过程:配制培养基、灭菌、接种、分离和培养等步骤。

③常用方法:平板划线法和稀释涂布平板法。

④实例——酵母菌的纯培养
固体培养基
一定形态结构
协调
高压蒸汽灭菌干热灭菌
50℃
倒平板解读：
(1)培养基要冷却到50℃左右时开始倒平板。

温度过高会烫手，过低培养基又会凝固。

(2)要使锥形瓶的瓶口通过酒精灯火焰。

通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。

(3)倒平板时，要用左手的拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，不要完全打开，以免杂菌污染培养基。

(4)平板冷凝后，要将平板倒置。

因为平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，平板倒置后，既可避免培养基表面的水分过快地挥发，又可防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。

【特别提醒】区别培养物、纯培养物、纯培养。

2.微生物的选择培养和技术
（1）选择培养基（见第20页）
常见选择培养基举例：①缺少氮源的培养基可以筛选能利用大气中N2的微生物。

②含青霉素的培养基可淘汰细菌，筛选出真菌。

③无有机碳源的培养基可筛选出自养微生物。

（2）微生物的选择培养(稀释涂布平板法)
平板划线法解读：
(1)实验成功关键点。

(2)平板划线法操作中几次灼烧接种环的目的
教材隐性知识：
源于选修1P 18“旁栏小资料”
A.微生物的接种方法除平板划线法和稀释涂布平板法外，还包括斜面接种、穿刺接种等方法。

B.微生物接种的核心是防止杂菌污染，保证培养物的纯度。

C.细胞计数板和血细胞计数板的设计原理相同，血细胞计数板比细菌计数板厚，常用于相对较大的酵母菌细胞，霉菌孢子等的计数。

用细菌计数板可对细菌等较小的细胞进行观察和计数。

（3）微生物的数量测定
①稀释涂布平板法：除用于分离微生物外，也常用来统计样品中活菌的数目。

（见右上）
特别提醒关于“选择菌落数在30～300的平板”的两个理解误区：
A.只得到1个菌落数在30～300
的平板:不符合实验的重复原则,易受到偶然因素的影响。

B.得到3个或3个以上菌落数在30～300的平板:也不一定正确,如得到3个平板,菌落数分别为230、34、240,虽然菌落数均在30～300之间,但由于34与另外两个平板上的菌落数差异较大,应找出原因并重新实验。

②显微镜直接计数法
回答以下问题：
A.为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。

B.为什么用此种方法统计的菌落数目往往比活菌的实际数目低？
答案:因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。

C.某同学在稀释倍数为106的培养基中测得平板上菌落数的平均值为234个(涂布平板时所用稀释液的体积为0.1mL)，那么稀释倍数为106的试管中细菌的浓度是2.34×103个/mL ，稀释倍数为10的锥形瓶中细菌的浓度为2.34×108个/mL ，所以每克样品中的细菌数是2.34×109个。

（4）菌种的保存方法主要方法临时保藏法甘油管藏法保藏对象频繁使用的菌种
长期保藏的菌种
方法步骤
先接种到试管的固体斜面培养基上培养，然后放入4℃的冰箱中转入灭菌后的甘油中，混匀后放在－20℃冷冻箱中保存
【归纳总结】平板划线法和稀释涂布平板法的比较项目
平板划线法
稀释涂布平板法
分离结果
关键操作接种环在固体培养基表面连续划线①一系列的梯度稀释；②涂布平板操作接种用具
接种环
涂布器
注意事项
(1)接种环的灼烧：①第一次划线前，避免接种环上可能存在的微生物污染培养基；②再次划线前，杀死上次划线结束后接种环上残留的菌种，使每次划线的菌种直接来源于上次划线的末端；③划线结束后，杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。

(2)接种环灼烧后，要冷却后才能接触菌液，以免温度太高杀死菌种。

(3)划线时用力要大小适当，防止用力过大将培养基划破
(1)在进行稀释操作时，
每支试管及其中的9mL 水、移液管均需灭菌；操作时，试管口和移液管应在离酒精灯火焰1～2cm 处。

(2)涂布平板时：①涂布器用体积分数为70%的酒精消毒，取出时要让多余酒精在烧杯中滴尽，然后将沾有少量酒精的涂布器在酒精灯火焰上引燃；②不要将过热的涂布器放在盛放酒精的烧杯中，以免引燃其中的酒精；③酒精灯与培养皿距离要合适，移液管头不要接触任何其他物体
优点可以观察菌落特征，对混合菌进行分离可以计数，可以观察菌落特征
缺点不能计数
操作较麻烦，平板不干燥效果不好，容易蔓延
共同点
都要用到固体培养基；都需进行无菌操作；都会在培养基表面形成单个的菌落；都可用于观察菌落特征
（5）土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
A.实验原理
B.实验流程
C.实验结果分析与评价
教材隐性知识：
选择性必修3P19“探究·实践”：本活动初步筛选了能分解尿素的细菌，请进一步借助于生物化学的方法来鉴定所分离的菌种分解尿素的细菌合成的脲酶可以将尿素分解成氨，氨会使培养基的碱性增强，在培养基中加入酚红指示剂培养细菌，若指示剂变红，可确定该细菌能够分解尿素。

(选择性必修3P18“探究·实践”)利用稀释涂布平板法纯化分解尿素的细菌时,经培养后发现培养基上出现多种菌落,可能的原因有哪些?
提示:出现杂菌污染的可能原因:培养基制备过程中被杂菌污染;接种过程中,无菌操作不符合要求;系列稀释时,无菌操作不符合要求等。