阿奇霉素对铜绿假单胞菌Ⅲ型分泌系统exoS和exoU基因表达的影响
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2021,42(13):1584-1588.
国际检验医学杂志2021年7月第42卷第13期 IntJLabMed,July2021,Vol.42,No.13
· 1585 ·
sionofexoU gene. Keywords:pseudomonasaeruginosa; type Ⅲ secretionsystems; exoS; exoU; azithromycin
1.2 抗菌药物药敏试验 通过 K-B 法测定 PA 对10 种抗菌药物 的 耐 药 率。 药 敏 纸 片:头 孢 他 啶、头 孢 吡
肟、左氧氟沙星、环丙沙星、阿 米 卡 星、庆 大 霉 素、哌 拉
西林、哌拉西 林/他 唑 巴 坦、亚 胺 培 南、美 罗 培 南 均 为
英国 Oxoid公 司 产 品。MH 培 养 基 由 重 庆 庞 通 医 疗 器械有限公司提供。
sionofexou mRNAinpseudomonasaeruginosaexospositivestrainstreated withdifferentconcentrationsof
azithromycinwassignificantlylowerthanthatoftheblankcontrol.Conclusion TheprevalenceratesofisolatescarryingexoUislowerinthepseudomonasaeruginosaclinicalisolates,buttheresisitancerateishigher.
· 1584 ·
国际检验医学杂志2021年7月第42卷第13期 IntJLabMed,July2021,Vol.42,No.13
·论 著·
阿奇霉素对铜绿假单胞菌Ⅲ型分泌系统exoS和exoU 基因表达的影响*
常 彦 斌 ,游 灵 玲 ,张 晓 兵 △ 重庆医科大学附属第一医院检验科,重庆 400016
据报道,群体感应(QS)系统抑制剂能减弱 PA 的 毒力[11],阿 奇 霉 素 能 够 影 响 PA 的 QS 系 统 信 号 分 子 。 [12-13] 本研究中,选择 对 PA 毒 力 机 制 更 为 关 键 的 毒 力 基 因 exoS 和 exoU 作 为 研 究 对 象 ,通 [14-15] 过 PCR 分析细菌 T3SS毒力基因exoS和exoU 的分布。 用 K-B 纸片 法 研 究 细 菌 耐 药 情 况,选 取 exoS、exoU 阳性株通过 RT-PCR 方 法 研 究 阿 奇 霉 素 对 铜 绿 假 单 胞菌exoS、exoU mRNA 表达的影响。 1 材料与方法 1.1 菌株来 源 从 本 实 验 室 自 2010-2019 年 保 存 的临床菌株库 中 随 机 选 择 50 株 PA,其 中 38 株 来 自 痰液,6 株 来 自 尿 液,5 株 来 自 分 泌 物,1 株 来 自 血 液。 使用 VITEK-2Compact全自动微生物鉴定系统鉴定 所有菌株到种。
物序列见表1。 各 靶 基 因 PCR 扩 增 体 系:10μmol/L 上 、下 游 引 物 各 1.25μL,10 mmol/LdNTPs0.5μL, 5×PCR 反应缓冲液 5μL,DNA 聚 合 酶 0.25μL,总 反应体积25μL(其中模板5μL),其余用双蒸 水 补 足 至25μL。PCR 检测 exoS 热 循 环 参 数:93 ℃ 预 变 性 5 min,然后93 ℃ 60s,55 ℃ 60s,72 ℃ 60s,共 35 个循环,最后72 ℃延伸5 min。PCR 检测exoU 热循 环参数:93 ℃ 预 变 性 5 min,然 后 93 ℃ 45s,57 ℃ 45s,72 ℃ 60s,共35个循环,最后72 ℃延伸5min。 对 PCR 扩增产物进 行 2.00% 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳,于 紫 外 凝 胶 电 泳 成 像 仪 下 观 察 ,并 记 录 结 果 。 1.4 阿奇霉素处理细 菌 T3SS毒 素 诱 导 培 养 基[16]: 胰蛋白胨(Tryptone)10g,酵母浸膏粉(Yeastextract)5 g,氯 化 钠 (NaCl)10g,乙 二 醇 二 乙 醚 二 胺 四 乙 酸 (EGTA)1.902g溶于1L 蒸馏水,调节 pH 值至 7.0,
高压(1.034×105 Pa)灭菌20 min。随机选择exoS、exoU 阳性菌株各1株,在 LB培养基中37 ℃水浴震荡培 养 过 夜 ,次 日 取 0.1 mL 菌 液 加 入 含 不 同 药 物 浓 度 的 诱 导培养 基 5 mL 中 37 ℃ 水 浴 震 荡 6~8h,细 菌 生 长 OD600 为0.6~1.0,取1.0 mL 菌 液 加 入 1.5 mL 无 菌 离 心 管 ,6000r/min离 心 5 min,收 集 细 菌 。
exosmRNAinpseudomonasaeruginosaexospositivestrainstreatedwithdifferentconcentrationsofazithromycin washigherthanthatoftheblankcontrol,andreachedthehighestlevelat4μg/mL.withtheincreaseof drugconcentration,theexpressionofexosmRNAgraduallydecreasedtothatoftheblankcontrol;theexpres-
CHANG Yanbin,YOU Lingling,ZHANG Xiaobing△ DepartmentofLaboratory Medicine,theFirstAffiliated HospitalofChongqing
MedicalUniversity,Chongqing 400016,China Abstract:Objective ThisstudyfocusonthedistributionofexoS,exoUinthepseudomonasaeruginosa clinicalisolates,thesusceptibilitytocommonlyusedantibioticsandtheeffectofazithromyeinonthetranscriptionofexoSandexoU,whichprovidedatheoreticalbasisonazithromycinclinicaltreatment.Methods The
effectsofdifferentconcentrationsofazithromycinonthemRNAexpressionofexosandexouinpseudomonas aeruginosawereanalyzedbyreversetranscriptionPCR (RT-PCR).Results Among50clinicalisolatesof pseudomonasaeruginosa,36(72.00%)wereexospositiveand14(28.00%)wereexoupositive.Theresistance rate of exou positive strains to 10 kinds of antibiotics was higher than that of exos positive strains,and the differencebetweenciprofloxacinandlevofloxacin wasstatisticallysignificant (P <0.05).Theexpressionof
摘 要:目的 通过研究铜绿假单胞菌临床株Ⅲ型分泌系统 基 因 exoS、exoU 的 分 布 情 况 与 耐 药 性 的 关 系
以及阿奇霉素对 菌 株 exoS、exoU mRNA 表 达 的 影 响,为 临 床 在 相 应 菌 株 中 应 用 阿 奇 霉 素 提 供 理 论 依 据。
方法 运用 PCR 检测50株临床分离的铜绿假单胞 菌 exoS、exoU 基 因 分 布 情 况,K-B 法 研 究 这 些 细 菌 对 常 用
铜绿假单胞菌(PA)是 医 院 内 感 染 和 呼 吸 机 相 关 性 肺 炎 最 常 见 的 细 菌 [1-5]。PAⅢ型 分 泌 系 统 (T3SS)的 发现是细菌致病机制研究的突出进展,其 T3SS主要分 泌4 种 毒 力 蛋 白,即 胞 外 酶 (Exo)S、ExoT、ExoY、ExoU,细菌通过Ⅲ型分泌系统的导管装置把 T3SS毒力因 子注入细胞,诱导细胞坏死、凋亡 。 [6-10]
LowerconcentrationsofazithromycinpromotethemRNAexpressionofexoSandsuppressthemRNAexpres-
* 基金项目:重庆市科委面上项目(cstc2019jcyj-msxmX0253)。 作者简介:常彦斌,医师,主要从事铜绿假单胞菌的感染与治疗方面的研究。 △ 通信作者,E-mail:xhpg85@。 本文引用格式:常彦斌,游灵玲,张晓兵.阿奇霉素对铜绿假单胞 菌 Ⅲ 型 分 泌 系 统 exoS和 exoU 基 因 表 达 的 影 响[J].国 际 检 验 医 学 杂 志,
distributionofexosandexougenesin50clinicalisolatesofpseudomonasaeruginosawasdetectedbyPCR.
Thedrugresistancerateofthesebacteriatocommonlyusedantibiotics wasstudiedby K-B method.The
文 章 编 号 :1673-4130(2021)13-1584-05
文 献 标 志 码 :A
Regulationofexpressionoftype Ⅲsecretionsystem-encodedexoSandexoU genes of psuedomonas aeruginosa by azithromycin*
抗菌药物的耐药率,用逆转录 PCR(RT-PCR)分析不同浓度阿奇霉素对铜绿假单胞菌exoS、exoU mRNA 表达
的作用。结果 50株临床分离的铜绿假单胞菌中36株(72.00%)为exoS阳性,14株(28.00%)为exoU 阳性,
无同时携带两种基因的菌株。exoU 阳性株对10种抗菌药物的耐药率高于exoS阳性株,环丙沙星和左氧氟沙
星的耐药率差异有统计学意义(P<0.05)。用不同浓度阿奇霉素处理铜绿假单胞菌exoS阳性株后,exoS mR-
NA 相对表达水平高于空白对照水平,4μg/mL 时最高,随着药物浓度的增加,exoS mRNA 的相对表达水平逐
渐下降至空白对照水平;不同浓度阿奇霉素处 理 exoU 阳 性 株 后,exoU mRNA 相 对 表 达 水 平 较 空 白 对 照 组 明
显减低。结论 铜绿假单胞菌中毒力基因exoU 的检出率低,exoU 阳性株耐药性相对较强,低浓度阿奇霉素能
促进铜绿假单胞菌毒力基因exoS mRNA 的表达,而抑制exoU mRNA 的表达。
关键词:铜绿假单胞菌; Ⅲ型分泌系统; exoS.3969/j.issn.1673-4130.2021.13.012 中图法分类号:R378;R446.5
1.3 exoS、exoU 基 因 检 测 以 煮 沸 法 制 备 细 菌 总 DNA。用 PCR 方法检测exoS、exoU 基 因。依 据 exoS(GenBankno.AE004091)和 exoU(GenBankno. AAC16023)的完 整 基 因 序 列,采 用 Primer3Plus在 线软件设计引物,引物由 上 海 生 工 生 物 公 司 合 成。 引
国际检验医学杂志2021年7月第42卷第13期 IntJLabMed,July2021,Vol.42,No.13
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sionofexoU gene. Keywords:pseudomonasaeruginosa; type Ⅲ secretionsystems; exoS; exoU; azithromycin
1.2 抗菌药物药敏试验 通过 K-B 法测定 PA 对10 种抗菌药物 的 耐 药 率。 药 敏 纸 片:头 孢 他 啶、头 孢 吡
肟、左氧氟沙星、环丙沙星、阿 米 卡 星、庆 大 霉 素、哌 拉
西林、哌拉西 林/他 唑 巴 坦、亚 胺 培 南、美 罗 培 南 均 为
英国 Oxoid公 司 产 品。MH 培 养 基 由 重 庆 庞 通 医 疗 器械有限公司提供。
sionofexou mRNAinpseudomonasaeruginosaexospositivestrainstreated withdifferentconcentrationsof
azithromycinwassignificantlylowerthanthatoftheblankcontrol.Conclusion TheprevalenceratesofisolatescarryingexoUislowerinthepseudomonasaeruginosaclinicalisolates,buttheresisitancerateishigher.
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国际检验医学杂志2021年7月第42卷第13期 IntJLabMed,July2021,Vol.42,No.13
·论 著·
阿奇霉素对铜绿假单胞菌Ⅲ型分泌系统exoS和exoU 基因表达的影响*
常 彦 斌 ,游 灵 玲 ,张 晓 兵 △ 重庆医科大学附属第一医院检验科,重庆 400016
据报道,群体感应(QS)系统抑制剂能减弱 PA 的 毒力[11],阿 奇 霉 素 能 够 影 响 PA 的 QS 系 统 信 号 分 子 。 [12-13] 本研究中,选择 对 PA 毒 力 机 制 更 为 关 键 的 毒 力 基 因 exoS 和 exoU 作 为 研 究 对 象 ,通 [14-15] 过 PCR 分析细菌 T3SS毒力基因exoS和exoU 的分布。 用 K-B 纸片 法 研 究 细 菌 耐 药 情 况,选 取 exoS、exoU 阳性株通过 RT-PCR 方 法 研 究 阿 奇 霉 素 对 铜 绿 假 单 胞菌exoS、exoU mRNA 表达的影响。 1 材料与方法 1.1 菌株来 源 从 本 实 验 室 自 2010-2019 年 保 存 的临床菌株库 中 随 机 选 择 50 株 PA,其 中 38 株 来 自 痰液,6 株 来 自 尿 液,5 株 来 自 分 泌 物,1 株 来 自 血 液。 使用 VITEK-2Compact全自动微生物鉴定系统鉴定 所有菌株到种。
物序列见表1。 各 靶 基 因 PCR 扩 增 体 系:10μmol/L 上 、下 游 引 物 各 1.25μL,10 mmol/LdNTPs0.5μL, 5×PCR 反应缓冲液 5μL,DNA 聚 合 酶 0.25μL,总 反应体积25μL(其中模板5μL),其余用双蒸 水 补 足 至25μL。PCR 检测 exoS 热 循 环 参 数:93 ℃ 预 变 性 5 min,然后93 ℃ 60s,55 ℃ 60s,72 ℃ 60s,共 35 个循环,最后72 ℃延伸5 min。PCR 检测exoU 热循 环参数:93 ℃ 预 变 性 5 min,然 后 93 ℃ 45s,57 ℃ 45s,72 ℃ 60s,共35个循环,最后72 ℃延伸5min。 对 PCR 扩增产物进 行 2.00% 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳,于 紫 外 凝 胶 电 泳 成 像 仪 下 观 察 ,并 记 录 结 果 。 1.4 阿奇霉素处理细 菌 T3SS毒 素 诱 导 培 养 基[16]: 胰蛋白胨(Tryptone)10g,酵母浸膏粉(Yeastextract)5 g,氯 化 钠 (NaCl)10g,乙 二 醇 二 乙 醚 二 胺 四 乙 酸 (EGTA)1.902g溶于1L 蒸馏水,调节 pH 值至 7.0,
高压(1.034×105 Pa)灭菌20 min。随机选择exoS、exoU 阳性菌株各1株,在 LB培养基中37 ℃水浴震荡培 养 过 夜 ,次 日 取 0.1 mL 菌 液 加 入 含 不 同 药 物 浓 度 的 诱 导培养 基 5 mL 中 37 ℃ 水 浴 震 荡 6~8h,细 菌 生 长 OD600 为0.6~1.0,取1.0 mL 菌 液 加 入 1.5 mL 无 菌 离 心 管 ,6000r/min离 心 5 min,收 集 细 菌 。
exosmRNAinpseudomonasaeruginosaexospositivestrainstreatedwithdifferentconcentrationsofazithromycin washigherthanthatoftheblankcontrol,andreachedthehighestlevelat4μg/mL.withtheincreaseof drugconcentration,theexpressionofexosmRNAgraduallydecreasedtothatoftheblankcontrol;theexpres-
CHANG Yanbin,YOU Lingling,ZHANG Xiaobing△ DepartmentofLaboratory Medicine,theFirstAffiliated HospitalofChongqing
MedicalUniversity,Chongqing 400016,China Abstract:Objective ThisstudyfocusonthedistributionofexoS,exoUinthepseudomonasaeruginosa clinicalisolates,thesusceptibilitytocommonlyusedantibioticsandtheeffectofazithromyeinonthetranscriptionofexoSandexoU,whichprovidedatheoreticalbasisonazithromycinclinicaltreatment.Methods The
effectsofdifferentconcentrationsofazithromycinonthemRNAexpressionofexosandexouinpseudomonas aeruginosawereanalyzedbyreversetranscriptionPCR (RT-PCR).Results Among50clinicalisolatesof pseudomonasaeruginosa,36(72.00%)wereexospositiveand14(28.00%)wereexoupositive.Theresistance rate of exou positive strains to 10 kinds of antibiotics was higher than that of exos positive strains,and the differencebetweenciprofloxacinandlevofloxacin wasstatisticallysignificant (P <0.05).Theexpressionof
摘 要:目的 通过研究铜绿假单胞菌临床株Ⅲ型分泌系统 基 因 exoS、exoU 的 分 布 情 况 与 耐 药 性 的 关 系
以及阿奇霉素对 菌 株 exoS、exoU mRNA 表 达 的 影 响,为 临 床 在 相 应 菌 株 中 应 用 阿 奇 霉 素 提 供 理 论 依 据。
方法 运用 PCR 检测50株临床分离的铜绿假单胞 菌 exoS、exoU 基 因 分 布 情 况,K-B 法 研 究 这 些 细 菌 对 常 用
铜绿假单胞菌(PA)是 医 院 内 感 染 和 呼 吸 机 相 关 性 肺 炎 最 常 见 的 细 菌 [1-5]。PAⅢ型 分 泌 系 统 (T3SS)的 发现是细菌致病机制研究的突出进展,其 T3SS主要分 泌4 种 毒 力 蛋 白,即 胞 外 酶 (Exo)S、ExoT、ExoY、ExoU,细菌通过Ⅲ型分泌系统的导管装置把 T3SS毒力因 子注入细胞,诱导细胞坏死、凋亡 。 [6-10]
LowerconcentrationsofazithromycinpromotethemRNAexpressionofexoSandsuppressthemRNAexpres-
* 基金项目:重庆市科委面上项目(cstc2019jcyj-msxmX0253)。 作者简介:常彦斌,医师,主要从事铜绿假单胞菌的感染与治疗方面的研究。 △ 通信作者,E-mail:xhpg85@。 本文引用格式:常彦斌,游灵玲,张晓兵.阿奇霉素对铜绿假单胞 菌 Ⅲ 型 分 泌 系 统 exoS和 exoU 基 因 表 达 的 影 响[J].国 际 检 验 医 学 杂 志,
distributionofexosandexougenesin50clinicalisolatesofpseudomonasaeruginosawasdetectedbyPCR.
Thedrugresistancerateofthesebacteriatocommonlyusedantibiotics wasstudiedby K-B method.The
文 章 编 号 :1673-4130(2021)13-1584-05
文 献 标 志 码 :A
Regulationofexpressionoftype Ⅲsecretionsystem-encodedexoSandexoU genes of psuedomonas aeruginosa by azithromycin*
抗菌药物的耐药率,用逆转录 PCR(RT-PCR)分析不同浓度阿奇霉素对铜绿假单胞菌exoS、exoU mRNA 表达
的作用。结果 50株临床分离的铜绿假单胞菌中36株(72.00%)为exoS阳性,14株(28.00%)为exoU 阳性,
无同时携带两种基因的菌株。exoU 阳性株对10种抗菌药物的耐药率高于exoS阳性株,环丙沙星和左氧氟沙
星的耐药率差异有统计学意义(P<0.05)。用不同浓度阿奇霉素处理铜绿假单胞菌exoS阳性株后,exoS mR-
NA 相对表达水平高于空白对照水平,4μg/mL 时最高,随着药物浓度的增加,exoS mRNA 的相对表达水平逐
渐下降至空白对照水平;不同浓度阿奇霉素处 理 exoU 阳 性 株 后,exoU mRNA 相 对 表 达 水 平 较 空 白 对 照 组 明
显减低。结论 铜绿假单胞菌中毒力基因exoU 的检出率低,exoU 阳性株耐药性相对较强,低浓度阿奇霉素能
促进铜绿假单胞菌毒力基因exoS mRNA 的表达,而抑制exoU mRNA 的表达。
关键词:铜绿假单胞菌; Ⅲ型分泌系统; exoS.3969/j.issn.1673-4130.2021.13.012 中图法分类号:R378;R446.5
1.3 exoS、exoU 基 因 检 测 以 煮 沸 法 制 备 细 菌 总 DNA。用 PCR 方法检测exoS、exoU 基 因。依 据 exoS(GenBankno.AE004091)和 exoU(GenBankno. AAC16023)的完 整 基 因 序 列,采 用 Primer3Plus在 线软件设计引物,引物由 上 海 生 工 生 物 公 司 合 成。 引