克老素抑制地塞米松诱导的MC3T3-E1成骨细胞凋亡
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科研计划项目 （Ｎｏ２０１４２０７９）；重 庆 市 卫 生 计 生 委 医 学 科研项目（Ｎｏ２０１６ＭＳＸＭ０８０）；重庆市渝中区科技计划项 目（Ｎｏ２０１５０１３９）；国家临床重点专科建设项目 ［国卫办 医函（２０１３）５４４号］ 作者简介：黄 倩（１９９１），女，硕士生，研究方向：老年心血管疾病基 础与临床，Ｅｍａｉｌ：ｈｕａｎｇｑｉａｎ１９９１１２＠１６３．ｃｏｍ； 马厚勋（１９６６－），男，博士，教授，硕士生导师，研究方向： 老年心血管疾 病基础与 临床，通 讯作者，Ｅｍａｉｌ：ｍａｈｏｕｘ ｕｎ１９６６＠１６３．ｃｏｍ
关键词：克老 素；地 塞 米 松；ＭＣ３Ｔ３Ｅ１成 骨 细 胞；凋 亡；Ｂｃｌ ２；Ｂａｘ；ｃａｓｐａｓｅ９
地塞米松（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ，ＤＥＸ）等糖皮质激素
收稿日期：２０１８－０１－１５，修回日期：２０１８－０２－１４ 基金项目：国家自然科学基金资助项目（Ｎｏ３０６７２２１２）；重庆市医学
作为临床上极为常用的抗炎药、免疫抑制药，广泛用 于诸如类风湿性关节炎、炎症性肠病、慢性阻塞性肺 疾病等疾病的治疗。大剂量或者长期低剂量的使用 糖皮质激素可能导致多种骨相关性不良反应，包括 骨质疏松和骨坏死，该效应具有剂量与时间依赖性。 尽管糖皮质激素诱导性骨质疏松已经成为临床上最 常见的继发性骨质疏松，然而就其治疗干预性研究 仍需做深入 探 讨 ［１－２］。 已 有 研 究 表 明，糖 皮 质 激 素 诱导性骨质疏松及其并发骨折的原因在于糖皮质激 素使成骨细胞数量减少，其具体机制是抑制成骨细 胞形成，促使其凋亡［３］。
克老素（Ｋｌｏｔｈｏ，ＫＬ）基因及其表达与人类包括 骨质疏 松 在 内 的 数 种 衰 老 表 型 关 系 极 为 紧 密［５］。 本课题组前期就携带 ＫＬ基因的腺相关病毒感染骨 质疏松模型大鼠进行体内实验研究，发现大鼠骨质 疏松病情及其骨微结构的破坏可通过上调 ＫＬ表达 得以缓解［４］；同 时，通 过 上 调 大 鼠 原 代 成 骨 细 胞 的 ＫＬ基因表达水平的体外实验研究，发现 ＫＬ可以增 强成骨细胞活性［６］。而有关人类 ＫＬ基因研究结果 还证实，在老年人群中，血浆 ＫＬ浓度较低人群更易 致骨量丢失，这与骨矿物质密度降低致使骨折风险 增加密切相关［７］。尽管已有研究证实 ＫＬ基因表达 调节在原发性骨质疏松的发生、发展中发挥了极其 重要作用，但有关 ＫＬ基因表达在以糖皮质激素诱 导性骨质疏松为代表的继发性骨质疏松发生、发展 中的分子生物学机制研究报道甚少。为此，本研究 通过转染携带 ＫＬ基因的重组腺病毒（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｃｏｎｔａｉｎｉｎｇＫＬｇｅｎｅ，ＡｄＫＬ）于 ＭＣ３Ｔ３Ｅ１ 成骨细胞，并构建 ＤＥＸ诱导性骨质疏松的细胞模 型，探究 ＫＬ表达上调对 ＭＣ３Ｔ３Ｅ１成骨细胞凋亡的 影响，为糖皮质激素诱导性骨质疏松的预防及治疗 提供新的依据及基础。 １ 材料与方法 １．１ 材料 １．１．１ 细 胞 与 试 剂 ＭＣ３Ｔ３Ｅ１细 胞 购 自 上 海 和 元生物。ＤＥＸ（５ｇ·Ｌ－１）购自重庆太极集团西南药 业，相对分子质量 ５１６４１，批次：１７０１０９；带绿色荧 光蛋白（ｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ，ＧＦＰ）基因的重组
克老素抑制地塞米松诱导的 ＭＣ３Ｔ３Ｅ１成骨细胞凋亡
黄 倩１，李宝善２，梁 霄１，刘 丹１，马厚勋１
（１．重庆医科大学附属第一医院老年病科，重庆 ４０００１６；２．重庆市急救医疗中心老年病科，重庆 ４０００１４）
ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００１－１９７８．２０１８．０４．０２５ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００１－１９７８（２０１８）０４－０５７０－０７ 中国图书分类号：Ｒ３２９２５；Ｒ３７３９；Ｒ３９４２；Ｒ６８１；Ｒ９７７１１； Ｒ９７７６ 摘要：目的 探究体外 转 染 克 老 素 （Ｋｌｏｔｈｏ，ＫＬ）基 因 对 地 塞 米松（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎ，ＤＥＸ）诱导的 ＭＣ３Ｔ３Ｅ１成骨细胞凋亡 的影响。方法 用携带 ＫＬ基因的重组腺病毒（ＡｄＫＬ）及携 带绿色荧光蛋白基 因 的 重 组 腺 病 毒 （ＡｄＧＦＰ）感 染 细 胞，并 建立 ＤＥＸ诱导凋亡的细胞模型。运用荧光倒置显微镜观察 重组腺病 毒 的 转 染 效 果，ｑＰＣＲ与 Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法 分 析 ＫＬ ｍＲＮＡ和蛋白表达情况；ＣＣＫ８法检测不同浓度 ＤＥＸ作用 于 ＭＣ３Ｔ３Ｅ１细胞后的存活率及各研究组细胞的生存情况； 流式细胞仪分析各研究组细胞的凋亡率；ｑＰＣＲ与 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析凋 亡 标 志 物 的 ｍＲＮＡ、蛋 白 表 达；免 疫 荧 光 分 析 ｃａｓｐａｓｅ９的荧光蛋白表达情况。结果 重组腺病毒成功感 染 ＭＣ３Ｔ３Ｅ１成骨细胞，ＫＬ组和 ＫＬ＋ＤＥＸ组的 ＫＬｍＲＮＡ 与蛋白表达量较非转染组明显升高。ＣＣＫ８法检测出 ＤＥＸ 的适宜干预浓度为 ２０ｍｍｏｌ·Ｌ－１。ＤＥＸ组、ＧＦＰ＋ＤＥＸ组 较其余组细胞存活率明显降低、凋亡率明显增加，Ｂａｘ、Ｂｃｌ２ 的 ｍＲＮＡ与蛋白表达分别表现出增加和降低趋势；ＫＬ组细 胞存活率、凋 亡 率，以 及 Ｂｃｌ２、ＢａｘｍＲＮＡ与 蛋 白 表 达 较 ＤＥＸ组及 ＫＬ＋ＤＥＸ组均明显改善。结论 大剂量 ＤＥＸ的 运用能够诱发 ＭＣ３Ｔ３Ｅ１成骨细胞凋亡，上调 ＫＬ表达具有 抵抗 ＤＥＸ诱导成骨细胞凋亡的作用，提示上调 ＫＬ表达可改 善糖皮质激素诱导性骨质疏松，为大剂量使用糖皮质激素所 致医源性骨质疏松的治疗提供新ｓｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ ２０１８Ａｐｒ；３４（４）：５７０～６
网络出版时间 ２０１８－３－２８９：２８ 网络出版地址：ｈｔｔｐ：／／ｋｎｓ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／３４．１０８６．Ｒ．２０１８０３２７．１５４２．０５０．ｈｔｍｌ
关键词：克老 素；地 塞 米 松；ＭＣ３Ｔ３Ｅ１成 骨 细 胞；凋 亡；Ｂｃｌ ２；Ｂａｘ；ｃａｓｐａｓｅ９
地塞米松（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ，ＤＥＸ）等糖皮质激素
收稿日期：２０１８－０１－１５，修回日期：２０１８－０２－１４ 基金项目：国家自然科学基金资助项目（Ｎｏ３０６７２２１２）；重庆市医学
作为临床上极为常用的抗炎药、免疫抑制药，广泛用 于诸如类风湿性关节炎、炎症性肠病、慢性阻塞性肺 疾病等疾病的治疗。大剂量或者长期低剂量的使用 糖皮质激素可能导致多种骨相关性不良反应，包括 骨质疏松和骨坏死，该效应具有剂量与时间依赖性。 尽管糖皮质激素诱导性骨质疏松已经成为临床上最 常见的继发性骨质疏松，然而就其治疗干预性研究 仍需做深入 探 讨 ［１－２］。 已 有 研 究 表 明，糖 皮 质 激 素 诱导性骨质疏松及其并发骨折的原因在于糖皮质激 素使成骨细胞数量减少，其具体机制是抑制成骨细 胞形成，促使其凋亡［３］。
克老素（Ｋｌｏｔｈｏ，ＫＬ）基因及其表达与人类包括 骨质疏 松 在 内 的 数 种 衰 老 表 型 关 系 极 为 紧 密［５］。 本课题组前期就携带 ＫＬ基因的腺相关病毒感染骨 质疏松模型大鼠进行体内实验研究，发现大鼠骨质 疏松病情及其骨微结构的破坏可通过上调 ＫＬ表达 得以缓解［４］；同 时，通 过 上 调 大 鼠 原 代 成 骨 细 胞 的 ＫＬ基因表达水平的体外实验研究，发现 ＫＬ可以增 强成骨细胞活性［６］。而有关人类 ＫＬ基因研究结果 还证实，在老年人群中，血浆 ＫＬ浓度较低人群更易 致骨量丢失，这与骨矿物质密度降低致使骨折风险 增加密切相关［７］。尽管已有研究证实 ＫＬ基因表达 调节在原发性骨质疏松的发生、发展中发挥了极其 重要作用，但有关 ＫＬ基因表达在以糖皮质激素诱 导性骨质疏松为代表的继发性骨质疏松发生、发展 中的分子生物学机制研究报道甚少。为此，本研究 通过转染携带 ＫＬ基因的重组腺病毒（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｃｏｎｔａｉｎｉｎｇＫＬｇｅｎｅ，ＡｄＫＬ）于 ＭＣ３Ｔ３Ｅ１ 成骨细胞，并构建 ＤＥＸ诱导性骨质疏松的细胞模 型，探究 ＫＬ表达上调对 ＭＣ３Ｔ３Ｅ１成骨细胞凋亡的 影响，为糖皮质激素诱导性骨质疏松的预防及治疗 提供新的依据及基础。 １ 材料与方法 １．１ 材料 １．１．１ 细 胞 与 试 剂 ＭＣ３Ｔ３Ｅ１细 胞 购 自 上 海 和 元生物。ＤＥＸ（５ｇ·Ｌ－１）购自重庆太极集团西南药 业，相对分子质量 ５１６４１，批次：１７０１０９；带绿色荧 光蛋白（ｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ，ＧＦＰ）基因的重组
克老素抑制地塞米松诱导的 ＭＣ３Ｔ３Ｅ１成骨细胞凋亡
黄 倩１，李宝善２，梁 霄１，刘 丹１，马厚勋１
（１．重庆医科大学附属第一医院老年病科，重庆 ４０００１６；２．重庆市急救医疗中心老年病科，重庆 ４０００１４）
ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００１－１９７８．２０１８．０４．０２５ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００１－１９７８（２０１８）０４－０５７０－０７ 中国图书分类号：Ｒ３２９２５；Ｒ３７３９；Ｒ３９４２；Ｒ６８１；Ｒ９７７１１； Ｒ９７７６ 摘要：目的 探究体外 转 染 克 老 素 （Ｋｌｏｔｈｏ，ＫＬ）基 因 对 地 塞 米松（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎ，ＤＥＸ）诱导的 ＭＣ３Ｔ３Ｅ１成骨细胞凋亡 的影响。方法 用携带 ＫＬ基因的重组腺病毒（ＡｄＫＬ）及携 带绿色荧光蛋白基 因 的 重 组 腺 病 毒 （ＡｄＧＦＰ）感 染 细 胞，并 建立 ＤＥＸ诱导凋亡的细胞模型。运用荧光倒置显微镜观察 重组腺病 毒 的 转 染 效 果，ｑＰＣＲ与 Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法 分 析 ＫＬ ｍＲＮＡ和蛋白表达情况；ＣＣＫ８法检测不同浓度 ＤＥＸ作用 于 ＭＣ３Ｔ３Ｅ１细胞后的存活率及各研究组细胞的生存情况； 流式细胞仪分析各研究组细胞的凋亡率；ｑＰＣＲ与 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析凋 亡 标 志 物 的 ｍＲＮＡ、蛋 白 表 达；免 疫 荧 光 分 析 ｃａｓｐａｓｅ９的荧光蛋白表达情况。结果 重组腺病毒成功感 染 ＭＣ３Ｔ３Ｅ１成骨细胞，ＫＬ组和 ＫＬ＋ＤＥＸ组的 ＫＬｍＲＮＡ 与蛋白表达量较非转染组明显升高。ＣＣＫ８法检测出 ＤＥＸ 的适宜干预浓度为 ２０ｍｍｏｌ·Ｌ－１。ＤＥＸ组、ＧＦＰ＋ＤＥＸ组 较其余组细胞存活率明显降低、凋亡率明显增加，Ｂａｘ、Ｂｃｌ２ 的 ｍＲＮＡ与蛋白表达分别表现出增加和降低趋势；ＫＬ组细 胞存活率、凋 亡 率，以 及 Ｂｃｌ２、ＢａｘｍＲＮＡ与 蛋 白 表 达 较 ＤＥＸ组及 ＫＬ＋ＤＥＸ组均明显改善。结论 大剂量 ＤＥＸ的 运用能够诱发 ＭＣ３Ｔ３Ｅ１成骨细胞凋亡，上调 ＫＬ表达具有 抵抗 ＤＥＸ诱导成骨细胞凋亡的作用，提示上调 ＫＬ表达可改 善糖皮质激素诱导性骨质疏松，为大剂量使用糖皮质激素所 致医源性骨质疏松的治疗提供新ｓｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ ２０１８Ａｐｒ；３４（４）：５７０～６
网络出版时间 ２０１８－３－２８９：２８ 网络出版地址：ｈｔｔｐ：／／ｋｎｓ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／３４．１０８６．Ｒ．２０１８０３２７．１５４２．０５０．ｈｔｍｌ