蛋白质等电点的测定2讲课文档
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4 .固定染色
取出凝胶条放在一块洁净的玻板上，用尺量出固定前的凝胶条长度。
放入带盖试管中加入固定液。固定20min2后，倒掉固定液后用脱色液 漂洗2次，再染色1h，用蒸馏水漂洗数次后用脱色液脱色，直至蛋 白质区带清晰，量出蛋白带距正极端的距离。
现在十六页，总共十八页。
5 .蛋白质条带聚焦位置的计算
10%TEMED
0.1
蛋白质混合样品
0.1
混匀后置真空干燥器中抽气
10 min
现在十四页，总共十八页。
（3）将配好的凝胶溶液用细长头滴管加到预先准备好的玻管中，至离上端
1 cm处，再用注射器缓缓加水3-5 mm高。
（4）待凝胶聚合
2. 电泳
将装有胶的玻管固定到电泳槽上槽的洞中（安装时要保证凝胶管垂 直且橡胶塞孔密封不漏）在上槽中装入0.1mol/L氢氧化钠溶液，在下
求出蛋白质聚焦部位距凝胶条正极端的实际长度为： 蛋白区带中心距凝胶条正极端的距离
固定染色前凝胶条长度
固定染色后凝胶条长度
现在十七页，总共十八页。
三、浊度、分光光度法
溶液的pH值与蛋白质等电点相同时，静电荷为0，当溶液pH值大于蛋 白质等电点时，则羧基游离，蛋白质带负电荷。反之，溶液的pH值小 于蛋白质等电点时，则氨基电离，蛋白质带正电荷。溶液的pH值距蛋 白质等电点越远，蛋白质的电荷越多。反之则越少。
试管号
1 2 3 4
蒸馏水 （ml）
8.4
0.01M醋酸（ ml）
0.6
8.7
—
8.0
—
7.4
—
0.1M醋酸（ ml） —
0.3
1.0
—
1M醋酸 （ml）
—
—
—
1.6
现在八页，总共十八页。
(2) 向以上试管中各加酪蛋白的醋酸钠溶液1毫升 ，加一管，摇句一管。此时1、2、3、4管的pH值 依次为5.9、5.3、4.7、3.5。观察其混浊度。静置 10分钟后，再观察其混浊度。最混浊的一管的pH即 为酪蛋白的等电点。
槽中加入0.1mol/L磷酸缓冲液。连接到电泳仪，接通电源，调电压
至160 V，聚焦过夜，至电流降为0，则可关闭电源。
现在十五页，总共十八页。
3．剥胶
电泳结束后，取下凝胶管，用蒸馏水洗净两端电极液，在凝 胶条的正极端作上标记。用灌满水的注射器长针头插入凝胶与玻 管管壁之间，边压水边慢慢转动玻管，推针前进，同时注入水， 靠水流压力和润滑力将玻璃管内壁与凝胶分开，凝胶条即可流出 。
现在十二页，总共十八页。
图 聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图 (A为正面,B为剖面)
现在十三页，总共十八页。
四、操作方法
1. 凝胶柱的制备
（1）玻璃管的一端插在橡皮帽中
（2）配胶
表 10mL 7.5%凝胶的配制
试剂名称
体积(mL)
凝胶贮液
2.5
两性电解质载体
0.5
蒸馏水
6.75
10%过硫酸铵
0.05
现在十八页，总共十八页。
溶液的pH值称为此种蛋白质的等电点。不同 蛋白质各有其特异的等电点。在等电点时， 蛋白质的理化性质都有变化，可利用此种性 质的变化测定各种蛋白质的等电点。
现在四页，总共十八页。
最常用的方法是：
①测其溶解度最低时的溶液pH值。
②等电聚焦电泳测其净电荷为零时的PH
③浊度、分光光度法
④基于蛋白质与离子交换的作用
现在五页，总共十八页。
一、测定溶解度最低时的溶液PH
实验原理：
借观察在不同pH溶液中的溶解度以测定酪 蛋白的等电点。用醋酸与酷酸钠(醋酸钠混合 在酪蛋白溶液中)配制成各种不同pH值的缓冲液 。向诸缓冲溶液中加入酪蛋白后，沉淀出现 最多的缓冲液的pH值即为酪蛋白的等电点。
现在六页，总共十八页。
实验器材与试剂：
蛋白质等电点的测定
现在一页，总共十八页。
主要内容
(1)了解蛋白质的两性解离性质。 (2)学习测定蛋白质等电点的方法。
现在二页，总共十八页。
蛋白质的解离性质
• 蛋白质是两性电解质。在蛋白质溶液中存在 下列平衡：
现在三页，总共十八页。
蛋白质的等电点
• 蛋白质分子的解离状态和解离程度受溶液的酸 碱度影响。当溶液的pH达到一定数值时，蛋白 质颗粒上正负电荷的数目相等，在电场中，蛋 白质既不向阴极移动，也不向阳极移动，此时
以聚丙烯酰胺凝胶为电泳支持介质，并在凝胶中加
入两性电解质载体，在电场作用下，蛋白质在此pH梯 度的凝胶中泳动，当迁移至pH值等于pI处时，就 不再泳动，而被浓缩成狭窄的区带。
现在十一页，总共十八页。
三、实验试剂与仪器 1）两性电解质 2）30％丙烯酰胺溶液 3）TEMED 4）10％过硫酸铵溶液 5）负极缓冲液：0.1M NaOH 6) 正极缓冲液：0.1M 磷酸或硫酸 7) 固定液：10％（W/V）三氯乙酸 8) 染色液 9) 脱色液 10) 蛋白质等电点标准 11) 电泳仪 12) 圆盘电泳槽
现在九页，总共十八ຫໍສະໝຸດ 。二、等电聚焦电泳原理：1）有一类两性电解质：它具有依次递变而又相 差不大的等电点，在电场下形成递变而又连续的pH梯度 ，故在电泳介质中加入这种物质则能造成介质pH由酸
到碱逐步变化。
现在十页，总共十八页。
2)各种蛋白质pI不同 3）两性电解质载体在电场作用下，按各自pI形成 从阳极到阴极逐渐增加的连续而稳定的pH梯度
器材： • 水浴锅、温度计、200毫升锥形瓶、100毫升容量瓶
、吸管、试管、试管架、乳钵
试剂：
(1)0.4％酪蛋白醋酸钠溶液 (2)1.00摩尔／升醋酸溶液 (3)0.10摩尔／升醋酸溶液 (4)0.01摩尔／升醋酸溶液
现在七页，总共十八页。
实验步骤：
(1) 取同样规格的试营4支，按下表颠序分别精确地加入 各试剂，然后混匀。
取出凝胶条放在一块洁净的玻板上，用尺量出固定前的凝胶条长度。
放入带盖试管中加入固定液。固定20min2后，倒掉固定液后用脱色液 漂洗2次，再染色1h，用蒸馏水漂洗数次后用脱色液脱色，直至蛋 白质区带清晰，量出蛋白带距正极端的距离。
现在十六页，总共十八页。
5 .蛋白质条带聚焦位置的计算
10%TEMED
0.1
蛋白质混合样品
0.1
混匀后置真空干燥器中抽气
10 min
现在十四页，总共十八页。
（3）将配好的凝胶溶液用细长头滴管加到预先准备好的玻管中，至离上端
1 cm处，再用注射器缓缓加水3-5 mm高。
（4）待凝胶聚合
2. 电泳
将装有胶的玻管固定到电泳槽上槽的洞中（安装时要保证凝胶管垂 直且橡胶塞孔密封不漏）在上槽中装入0.1mol/L氢氧化钠溶液，在下
求出蛋白质聚焦部位距凝胶条正极端的实际长度为： 蛋白区带中心距凝胶条正极端的距离
固定染色前凝胶条长度
固定染色后凝胶条长度
现在十七页，总共十八页。
三、浊度、分光光度法
溶液的pH值与蛋白质等电点相同时，静电荷为0，当溶液pH值大于蛋 白质等电点时，则羧基游离，蛋白质带负电荷。反之，溶液的pH值小 于蛋白质等电点时，则氨基电离，蛋白质带正电荷。溶液的pH值距蛋 白质等电点越远，蛋白质的电荷越多。反之则越少。
试管号
1 2 3 4
蒸馏水 （ml）
8.4
0.01M醋酸（ ml）
0.6
8.7
—
8.0
—
7.4
—
0.1M醋酸（ ml） —
0.3
1.0
—
1M醋酸 （ml）
—
—
—
1.6
现在八页，总共十八页。
(2) 向以上试管中各加酪蛋白的醋酸钠溶液1毫升 ，加一管，摇句一管。此时1、2、3、4管的pH值 依次为5.9、5.3、4.7、3.5。观察其混浊度。静置 10分钟后，再观察其混浊度。最混浊的一管的pH即 为酪蛋白的等电点。
槽中加入0.1mol/L磷酸缓冲液。连接到电泳仪，接通电源，调电压
至160 V，聚焦过夜，至电流降为0，则可关闭电源。
现在十五页，总共十八页。
3．剥胶
电泳结束后，取下凝胶管，用蒸馏水洗净两端电极液，在凝 胶条的正极端作上标记。用灌满水的注射器长针头插入凝胶与玻 管管壁之间，边压水边慢慢转动玻管，推针前进，同时注入水， 靠水流压力和润滑力将玻璃管内壁与凝胶分开，凝胶条即可流出 。
现在十二页，总共十八页。
图 聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图 (A为正面,B为剖面)
现在十三页，总共十八页。
四、操作方法
1. 凝胶柱的制备
（1）玻璃管的一端插在橡皮帽中
（2）配胶
表 10mL 7.5%凝胶的配制
试剂名称
体积(mL)
凝胶贮液
2.5
两性电解质载体
0.5
蒸馏水
6.75
10%过硫酸铵
0.05
现在十八页，总共十八页。
溶液的pH值称为此种蛋白质的等电点。不同 蛋白质各有其特异的等电点。在等电点时， 蛋白质的理化性质都有变化，可利用此种性 质的变化测定各种蛋白质的等电点。
现在四页，总共十八页。
最常用的方法是：
①测其溶解度最低时的溶液pH值。
②等电聚焦电泳测其净电荷为零时的PH
③浊度、分光光度法
④基于蛋白质与离子交换的作用
现在五页，总共十八页。
一、测定溶解度最低时的溶液PH
实验原理：
借观察在不同pH溶液中的溶解度以测定酪 蛋白的等电点。用醋酸与酷酸钠(醋酸钠混合 在酪蛋白溶液中)配制成各种不同pH值的缓冲液 。向诸缓冲溶液中加入酪蛋白后，沉淀出现 最多的缓冲液的pH值即为酪蛋白的等电点。
现在六页，总共十八页。
实验器材与试剂：
蛋白质等电点的测定
现在一页，总共十八页。
主要内容
(1)了解蛋白质的两性解离性质。 (2)学习测定蛋白质等电点的方法。
现在二页，总共十八页。
蛋白质的解离性质
• 蛋白质是两性电解质。在蛋白质溶液中存在 下列平衡：
现在三页，总共十八页。
蛋白质的等电点
• 蛋白质分子的解离状态和解离程度受溶液的酸 碱度影响。当溶液的pH达到一定数值时，蛋白 质颗粒上正负电荷的数目相等，在电场中，蛋 白质既不向阴极移动，也不向阳极移动，此时
以聚丙烯酰胺凝胶为电泳支持介质，并在凝胶中加
入两性电解质载体，在电场作用下，蛋白质在此pH梯 度的凝胶中泳动，当迁移至pH值等于pI处时，就 不再泳动，而被浓缩成狭窄的区带。
现在十一页，总共十八页。
三、实验试剂与仪器 1）两性电解质 2）30％丙烯酰胺溶液 3）TEMED 4）10％过硫酸铵溶液 5）负极缓冲液：0.1M NaOH 6) 正极缓冲液：0.1M 磷酸或硫酸 7) 固定液：10％（W/V）三氯乙酸 8) 染色液 9) 脱色液 10) 蛋白质等电点标准 11) 电泳仪 12) 圆盘电泳槽
现在九页，总共十八ຫໍສະໝຸດ 。二、等电聚焦电泳原理：1）有一类两性电解质：它具有依次递变而又相 差不大的等电点，在电场下形成递变而又连续的pH梯度 ，故在电泳介质中加入这种物质则能造成介质pH由酸
到碱逐步变化。
现在十页，总共十八页。
2)各种蛋白质pI不同 3）两性电解质载体在电场作用下，按各自pI形成 从阳极到阴极逐渐增加的连续而稳定的pH梯度
器材： • 水浴锅、温度计、200毫升锥形瓶、100毫升容量瓶
、吸管、试管、试管架、乳钵
试剂：
(1)0.4％酪蛋白醋酸钠溶液 (2)1.00摩尔／升醋酸溶液 (3)0.10摩尔／升醋酸溶液 (4)0.01摩尔／升醋酸溶液
现在七页，总共十八页。
实验步骤：
(1) 取同样规格的试营4支，按下表颠序分别精确地加入 各试剂，然后混匀。