蓝细菌制氢研究进展

蓝细菌制氢研究进展
喻国策*王建龙
（清华大学核能与新能源技术研究院环境技术研究室北京100084）
摘要蓝细菌具有很低的营养需求，能够利用太阳能直接光解水产生氢能，利用蓝细菌产氢是理想的生物制氢方式之一。

目前，蓝细菌氢的产率尚未达到实际应用的要求。

蓝细菌产氢依赖于菌株的遗传背景和产氢的环境条件。

对蓝细菌产氢生理、产氢速率、产氢的环境条件、菌株筛选和突变株构建以及在光生物反应器中产氢的特征作了综述，以期有利于蓝细菌产氢水平的提高。

关键词蓝细菌氢环境条件突变株光生物反应器
收稿日期：20050519修回日期：20051008
* 电子信箱：yugc@传统的化石能源日渐枯竭，并且化石燃料的使用会引起温室效应和严重的环境污染，寻找可再生的清洁能源是社会可持续发展的迫切要求。

氢是一种能量密度高、无污染、用途广泛的理想的含能体能源，在将来可能部分甚至完全替代传统的化石能源。

目前，制氢技术主要包括采用化石燃料制氢和电解水制氢两条途径［1］，前者需要消耗大量的石油、天然气和煤炭等不可再生资源，后者需要消耗大量的电能，两种方法成本高昂，难以摆脱对化石燃料的依赖。

生物制氢是一条能够利用可再生资源的环境友好的途径，它具有反应条件温和、过程清洁和不消耗矿物资源等优势。

生物制氢包括利用厌氧和兼性厌氧细菌、光合细菌、蓝细菌和绿藻制氢等几种方式。

其中，利用蓝细菌制氢由于蓝细菌的下述特征而成为理想的生物制氢方式之一：（1）蓝细菌能够直接光解水放氢，将太阳能转化为氢能；（2）蓝细菌生长营养需求低，只需空气（CO2和N2分别作为碳源和氮源）、水（电子和还原剂来源）、简单的无机盐和光（能源）［2］。

蓝细菌制氢作为一种有前途的生物制氢方式多年来一直受到人们的重视。

1蓝细菌放氢生理蓝细菌是一类能够进行放氧光合作用的原核生物，具有在功能和结构上与真核细胞叶绿体相似的光合作用单元，和与革兰氏阴性细菌相似的细胞壁结构和组成。

蓝细菌具有单细胞、丝状和菌落等多种形态。

蓝细菌中参与氢代谢的酶主要有固氮酶、吸氢酶和可逆氢酶（或称双向氢酶），其中，固氮酶在催化固氮的同时催化氢的产生，吸氢酶可氧化固氮酶放出的氢，可逆氢酶既可以吸收也可以释放氢气［2,3］。

蓝细菌放氢是这三种酶共同作用的结果。

固氮酶、吸氢酶和可逆氢酶对氧都非常敏感，它们可被空气中的氧和光合作用放出的氧抑制而失活。

常见的固氮酶是钼固氮酶，由固氮酶（MoFe蛋白）和固氮酶还原酶（Fe蛋白）组成，MoFe 蛋白是约220~240 kDa的杂四聚体（NifD和NifK），Fe蛋白是约60~70 kDa的二聚体（NifH）。

Fe蛋白将外部电子供体的电子传递给MoFe蛋白，MoFe蛋白将氮还原为氨，同时催化质子的还原：N2 + 8H+ + 8e + 16ATP→2NH3 + H2 + 16ADP + 16Pi。

蓝细菌或在无氧条件下固氮，或将固氮和放氧在时间或空间上分离。

有些丝状蓝细菌的营养细胞可以分化成专门进行固氮的异形胞，从而实现固氮和放氧在空间上的分离，有些非异形胞蓝细菌则会将固氮和放氧在时间上分开。

固氮酶除钼固氮酶外，还包括钒固氮酶和铁固氮酶，钒固氮酶和铁固氮酶可以为质子还原分配更多的电子，因而具有比钼固氮酶更强的放氢能力［3］。

氢酶可以催化反应2H+ + 2e H2，蓝细菌吸氢酶和可逆氢酶都是NiFe氢酶。

吸氢酶存在于所有固氮的单细胞和丝状蓝细菌中。

吸氢酶与膜相结合，在一些丝状蓝细菌中仅在异形胞中表达，在营养细胞中没有或仅有极少活性。

吸氢酶至少由约60 kDa和35 kDa的两个亚
基（HupL和HupS）组成。

吸氢酶对氢的回收具有三方面功能：（1）通过氧氢反应（Knallgas 反应）提供ATP；（2）去除氧气，保护固氮酶免于失活；（3）为固氮酶和其它细胞活动提供电子［3］。

在丝状蓝细菌中，吸氢酶和固氮酶具有密切的联系。

可逆氢酶在固氮和不固氮蓝细菌中广泛存在。

可逆氢酶是可溶的或松散地结合在膜上。

可逆氢酶是由氢酶（HoxH和HoxY）和硫辛酰胺脱氢酶（HoxU和HoxF）两部分组成的杂四聚体酶，是组成型酶。

可逆氢酶和固氮作用不相关，可逆氢酶可能是蓝细菌在厌氧环境下释放多余还原力的介导物，或作为摒除光合作用光反应产生的低电势电子的电子阀［3］。

2蓝细菌产氢的速率Benemann等［4］于1974年发现了Anabaena cylindrica在光下氩气环境中的放氢现象。

至今，蓝细菌放氢研究已有30年历史。

目前，蓝细菌氢的产率尚未达到实际应用的要求，光能转化效率一般均小于1%。

一般认为，10%或更高的光能转化效率是大规模制氢所需要的。

用于放氢研究的蓝细菌包括丝状异形胞蓝细菌、丝状非异形胞蓝细菌、单细胞不固氮蓝细菌和海洋蓝细菌等10多个属的蓝细菌。

比较深入的放氢研究主要是针对少数Anabaena属和Nostoc属异形胞蓝细菌，如A. cylindrica、 A. variabilis和Nostoc PCC 73102，以及个别Synechococcus属和Synechocystis属的蓝细菌。

表1列出了一些典型蓝细菌的产氢速率。

异形胞蓝细菌在空气环境中生长和在氩气环境中测定时，比较典型的产氢速率介于0.17~4.2μmol H2 mg chl a 1 h1之间［5］。

不过，蓝细菌产氢受到培养过程和放氢测定过程多种因素的显著影响，同一株蓝细菌在不同的生长和测定条件下，其产氢速率可能相差10倍之多［6］。

A. variabilis ATCC 29413在限制光强90μE m 2 s1下和气相条件25%N2、2%CO2和73%Ar下生长，在氮营养压力下（当N2由25%下降至5%时），产氢速率可达4518μmol H2 mg chl a 1 h1［7］。

丝状异形胞蓝细菌具有比较完善的光合放氧和固氮放氢的分离机制以及较高的产氢速率，是非常有前途的产氢光合微生物之一。

单细胞不固氮蓝细菌能够表现出一定的利用可逆氢酶放氢的能力，尤其是Gloeobacter PCC 7421，其产氢速率可与某些异形胞蓝细菌相当（1.38μmol H2 mg chl a 1 h1）［8］。

蓝细菌在黑暗缺氧条件下发酵产氢的速率比较低［6］。

2005, 25(12)喻国策等：蓝细菌制氢研究进展
中国生物工程杂志 China Biotechnology Vol.25 No.12 2005
表1一些典型蓝细菌产氢的速率
Table 1Rates of hydrogen production by some typical cyanobacteria
菌株〖〗最大产氢速率
(μmol mg chla 1 h1)〖〗生长条件〖〗测定条件〖〗参考文献异形胞蓝细菌〖〗〖〗
〖〗〖〗Anabaena sp. PCC 7120〖〗2.6〖〗空气; 20μE m 2 s1〖〗Ar; 60μE m
2 s1〖〗［5］Anabaena cylindrica IAM M1〖〗2.1〖〗空气; 20μE m 2 s1〖〗Ar; 60μE m 2 s1〖〗Anabaena variabilis IAM M58〖〗4.2〖〗空气; 20μE m 2 s1〖〗Ar; 60μE m 2 s1〖〗Anabaena cylindrica UTEX B 629〖〗0.91〖〗空气; 20μE m 2 s1〖〗Ar; 60μE m 2 s1〖〗Anabaena flos aquae UTEX LB 2558〖〗3.2〖〗空气; 20μE m 2 s1〖〗Ar; 60μE m 2 s1〖〗Anabaenopsis circularis IAM M4〖〗0.31〖〗空气; 20 μEm 2 s1〖〗Ar; 60μE m 2 s1〖〗Nostoc muscorum IAM M14〖〗0.60〖〗空气; 20μE m 2 s1〖〗Ar; 60μE m
2 s1〖〗Nostoc linckia IAM M30〖〗0.17〖〗空气; 20μE m 2 s1〖〗Ar;
60μE m 2 s1〖〗Nostoc commune IAM M13〖〗0.25〖〗空气; 20μE m 2 s
1〖〗Ar; 60μE m 2 s1〖〗Anabaena variabilis ATCC 29413〖〗45.18〖〗Ar+N2(25%)+CO2(2%); 90μE m 2 s1〖〗Ar + N2(5%)+CO2(2%); 90μE m 2 s1〖〗［7］Anabaena azollae 〖〗38.5〖〗空气 + CO2(2%); 113μE m 2 s1〖〗Ar; 140μE m 2 s1〖〗［9］
非异形胞蓝细菌〖〗〖〗〖〗〖〗Synechococcus PCC 6803〖〗0.26〖〗空气; 20μE m 2 s 1〖〗Ar + CO(13.4μmol/L) + C2H2 (1.34 mmol/L); 黑暗〖〗［8］Synechococcus PCC 602〖〗0.66〖〗空气; 20μE m 2 s1〖〗Ar + CO(13.4μmol/L); 2030μE m 2 s1; 或 Ar + CO(13.4μmol/L) + C2H2 (1.34μmmol/L); 黑暗〖〗Microcystis PCC 7820〖〗0.16〖〗空气; 20μE m 2 s1〖〗Ar + CO(13.4μmol/L) + C2H2(1.34 mmol/L);
2030μE m 2 s1〖〗Gloeobacter PCC 7421〖〗1.38〖〗空气; 20μE m 2 s
1〖〗Ar + CO(13.4μmol/L) + C2H2(1.34 mmol/L); 2030μE m 2 s1〖〗Synechocystis PCC 6308〖〗0.13〖〗空气; 20μE m 2 s1〖〗Ar + CO(13.4μmol/L) + C2H2(1.34 mmol/L); 2030μE m 2 s1〖〗Aphanocapsa montana〖〗0.40〖〗空气; 20μE m 2 s1〖〗Ar; 2030μE m 2 s13蓝细菌产氢的环境条件蓝细菌产氢需要适宜的环境条件，包括光强、温度、盐度、气相组成和培养基营养组成等［10］。

对于固氮酶介导的放氢，由于固氮酶活性比最优生长要求更高的饱和光强，适当提高光强往往可以增大产氢。

对于异形胞蓝细菌，由于吸氢酶可消耗固氮酶放出的氢，N2是固氮酶放氢的竞争性抑制剂，O2可导致可逆氢酶失活，并促进氧氢反应。

蓝细菌在空气条件下放氢微弱，难以被检测到，所以蓝细菌放氢一般在氩气环境中进行，或在空气或氮气中补充固氮酶和吸氢酶的气体抑制剂（CO 和C2H2）进行。

另外，添加有机碳化合物往往可以促进放氢，外源氮源的存在则可抑制固氮酶合成和产氢。

固定化培养可以保护蓝细菌细胞及其酶的活性，降低其因受环境条件干扰而导致的失活，从而提高其产氢的速率和稳定性。

蓝细菌固定化培养最常用的载体包括琼脂凝胶、藻酸盐凝胶、聚氨酯泡沫和聚乙烯泡沫。

Park等［11］在一柱式光生物反应器中采用聚乙烯泡沫固定的A. azollae实现了连续6d产氢，Markov等［12］利用中空纤维固定的A. variabilis实现了5个月连续产氢，产氢速率为0.02~0.2 ml H2 mg 1 h1。

采用连续培养也可以提高蓝细菌产氢的速率和稳定性，Lichtl等［13］采用恒化系统对N. flagelliforme进行连续培养，以利用其在对数生长期较高的固氮酶活性，结果在连续培养条件下产氢速率可达分批培养的4倍之多。

采用某些生理生化方法可以显著促进蓝细菌产氢。

异形胞蓝细菌的净放氢是固氮酶放氢和吸氢酶耗氢的结果，提高固氮酶活性或抑制吸氢酶活性都有利于产氢的增加。

含钒不含钼的培养条件可以诱导某些蓝细菌表达放氢效率更高的钒固氮酶，从而可以产生更大量的氢气［14］。

Dawar等［15］发现在培养基中提高镁离子浓度和添加果糖，Nostoc sp. ARM 411异形胞频率可以增大3倍，其固氮酶活性和产氢能力亦相应提高。

蓝细菌吸氢酶辅基中包含镍，镍是吸氢酶合成和具有催化活性的必需组成，采用镍限制条件可以抑制吸氢酶活性，从而显著促进产氢。

另外，同步培养也可能成为促进蓝细菌Synechococcus sp.产氢的途径［16］。

一些主要的有利于蓝细菌产氢的策略见表2。

4菌株筛选和突变株构建蓝细菌具有广泛多样的生存环境和遗传背景，考
表2促进蓝细菌产氢的策略
Table 2Some strategies for improving
cyanobacterial hydrogen production
环境条件〖〗有利于产氢的策略光强〖〗适当高于生长所需的饱和光强温度〖〗随菌种而异盐度〖〗随淡水和海洋蓝细菌而不同pH〖〗6.5~9.0气相组成〖〗氩气；在空气或氮气中添加CO和C2H2培养基营养组成〖〗添加适当的有机碳化合物；不含结合态氮源；加入一定浓度的VO3MoO42Mg2+等金属离子浓度；Ni2+限制菌龄〖〗采用稳定期早期细胞培养方式〖〗固定化培养；连续培养；同步培养察不同生境来源的蓝细菌可能分离获得具有高产氢能力的菌株。

不过，筛选高产菌株的研究还不多见。

Howarth等［8］比较了9
株单细胞不固氮蓝细菌的放氢和吸氢能力。

Kumar等［17］分离了11个属20个种的固氮和不固氮蓝细菌，考察了它们的生理特征和在不同条件下的产氢能力。

结果发现，Nostoc属和Anabaena属各有1个种表现出依赖于光和固氮酶的好氧产氢能力。

在Ar + 1% CO2下培养时，所有检测菌株均可产氢。

3个属（Plectonema、Oscillatoria和Spirulina）的蓝细菌表现出依赖于甲基紫精即依赖于氢酶的产氢能力。

采用化学诱变或基因工程方法，使吸氢酶基因失活，可以使固氮酶放出的氢不被氧化回收，从而提高蓝细菌氢的产率。

Mikheeva等［18］采用亚硝基胍诱变方法获得两株A. variabilis ATCC 29413氢代谢缺陷突变株PK84（吸氢酶和可逆氢酶缺陷）和PK17R（吸氢酶缺陷），它们的生长特征和异形胞频率与野生型相同，但放氢速率显著提高。

在连续培养PK84和PK17R 时，它们产氢的速率分别是野生型的4.3倍和1.4倍，并且在氮营养压力条件下（当N2由25%下降至5%时），其产氢速率分别达到167.60和59.18μmol H2 mg chl a 1 h1［7］。

Happe等［19］构建的hupSL缺失的A. variabilis ATCC 29413吸氢酶缺陷株AVM13，在固氮条件下产氢速率显著增大（68μmol H2 mg chl a 1 h1），比野生型高3倍。

Lindberg 等［20］对缺少可逆氢酶的N. punctiforme ATCC 29133采用插入突变构建了hupL
株，从而获得一不具有任何氢酶的菌株NHM5。

将NHM5在固氮条件下培养，可以观察到其能够在空气条件下放氢（14μmol H2 mg chl a 1 h1），而野生型则不放氢。

Masukawa 等［21］构建了3株Anabaena sp. PCC 7120的氢酶突变株，即吸氢酶缺陷株hupL
逆氢酶缺陷株hoxH hupL/hoxH结果发现，hupL hupL/hoxH
4~7倍，hoxH
低15%~33%。

他们认为，是吸氢酶基因的破坏，而不是可逆氢酶基因的破坏，促进了Anabaena sp. PCC 7120氢的产生。

蓝细菌吸氢酶缺陷突变株的高产氢能力使它们在光生物反应器产氢的研究中获得了应用，其产氢能力亦被进一步证实。

5蓝细菌在光生物反应器中产氢蓝细菌产氢在光生物反应器中的放大是其走向应用的必经环节。

简易高效的光生物反应器的设计是蓝细菌产氢研究的一个重要方面，光生物反应器产氢特征的研究将为蓝细菌大规模产氢提供依据。

关于蓝细菌在光生物反应器中产氢已进行了一些很有意义的探索性研究。

蓝细菌产氢光生物反应器主要采用管式光生物反应器［22,23］，另有采用柱式等光生物反应器的报道［11,12,24］。

反应器培养采用的菌株主要是少数Anabaena属蓝细菌，尤其是A. variabilis及其吸氢酶缺陷突变株PK84。

Tsygankov等［23］采用10 mm内径的聚氯乙烯管制成一实验室规模的4.35 L螺旋状管式光生物反应器，此反应器具备较大的表面积/体积比（200 m1）以及良好的生化和环境参数的计算机控制系统，模型实验证明了反应器高速率产氢的可能性。

Tsygankov等［25］考察了A. variabilis ATCC 29413及其吸氢酶缺陷突变株PK84在上述管式光生物反应器中分批培养时产氢的特征。

Borodin等［26］研究了在此光生物反应器中，在12 h光照（36 ℃）和12 h黑暗（14~30 ℃）交替进行模拟户外自然条件的情况下，利用A. variabilis PK84产氢的特征，结果PK84在2.5个月连续培养过程中可以稳定产氢，对应于细胞密度3.6~4.6μg chl a ml1，最大产氢量为230 ml H2 12h 1 PhBR1。

Fedorov等［27］首次在完全户外条件下在 4.35L螺旋状管式光生物反应器中培养 A. variabilis PK84。

分批培养时，最大产氢速率达到80 ml H2 h 1 PhBR1，反应器最大光能氢能转化效率在阴天和晴天分别为033%和0.14%；连续培养时，产氢速率在36d 实验过程中可以维持在25~35 ml H2 h 1 PhBR1。

Tsygankov等［28］进一步研究了在户外条件下A. variabilis PK84在4.35L光生物反应器中产氢的特征，连续培养时，氢的产量可达1.1LH2 d 1 PhBR1，最高光能氢能转化效率可达到0.094%。

他们发现，产氢速率和光能转化效率主要依赖于温度（在14~30 ℃范围内）和光强，温度提高可明显促进氢的产生和光能转化效率的提高，光强增大对产氢有促进作用，但对光能转化效率有负的影
响。

这些结果证明了利用A. variabilis PK84在户外自然条件下在光生物反应器中产氢的可能性。

另外，Lindblad等［29］在1.9L计算机控制的管式光生物反应器中连续培养Anabaena PCC 7120及其吸氢缺陷突变株AMC414，结果表明，突变株产氢速率高于野生菌株，它们的最大产氢速率分别为45和20μmol H2 mg chl a 1 h1，突变株在通空气条件下仍可产氢，并且产氢速率随光强增大而增大。

他们在4.35L螺旋状管式光生物反应器中在户外条件下培养AMC414，AMC414表现出持续产氢能力，最大产氢为14.9ml H2 l 1 h1,太阳能转化为氢能的最大效率为0.042%。

6结论利用蓝细菌产氢是理想的生物制氢方式之一。

蓝细菌产氢取决于菌株的遗传背景和产氢的环境条件。

目前，蓝细菌氢的产率和光能转化效率尚未达到实际应用的要求，但已进行的研究工作为进一步提高蓝细菌产氢的效率奠定了基础。

蓝细菌产氢的主要障碍在于：产氢的酶受氧的抑制，产生的氢被吸氢酶消耗，以及氢的产率较低［30］。

固氮酶放氢的效率因酶本身的低周转率、高ATP需求和对氧的敏感性而受到严重的影响。

另外，篮细菌细胞因适应低光强条件而具有的较高的色素含量，使其在高光强下光合作用效率降低，产氢效率亦降低。

提高蓝细菌产氢效率需要在蓝细菌遗传、生理和培养等方面进行深入的研究，这包括分离和研究更多新的蓝细菌，如采用时间分离策略进行光合和固氮的蓝细菌、共生固氮的蓝细菌以及具有异养能力的蓝细菌等，以获得具有更高固氮酶或放氢氢酶活性的蓝细菌菌株；对蓝细菌进行基因工程改造，如使吸氢酶失活、使固氮酶和放氢氢酶对氧稳定和高水平表达、降低细胞色素含量等；以及对产氢培养条件进行优化，包括某些生理调节方式的采用和适宜的光生物反应器的设计。

值得注意的是，蓝细菌可逆氢酶在进行催化作用时仅需要较少的代谢能量，在理论上具有比固氮酶更强的放氢能力，蓝细菌可逆氢酶的放氢能力值得深入研究和利用。

可以期望，随着对可再生清洁能源的关注，蓝细菌制氢研究将取得迅速进步。

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Advances in Research on Cyanobacterial Hydrogen Production
YU Guo ceWANG Jian long
(Laboratory of Environmental Technology, Institute of Nuclear and New Energy Technology, Tsinghua UniversityBeijing100084, China)
AbstractCyanobacteria can grow with low nutritional requirements and can produce hydrogen from direct photolysis of water by utilizing solar energy. Hydrogen production by cyanobacteria is one of the ideal methods of biological production of molecular hydrogen. At present the hydrogen productivity achieved is far below what practice requires. Cyanobacterial hydrogen production depends on the genetic background of the strains and the environmental conditions for hydrogen formation. Aiming at the improvement of cyanobacterial hydrogen production, a brief review on the physiology and the rates of hydrogen evolution, the environmental conditions for hydrogen formation, strain screening and mutant construction as well as the characteristics of hydrogen production in a photobioreactor was presented.
Key wordsCyanobacteriaHydrogenEnvironmental conditionsMutantPhotobioreactor。