助孕胶囊对多囊卵巢综合征大鼠性激素含量及胰岛素样生长因子_1(精)

・30・成都中医药大学学报JournalofChengduUniversityofTCM2006年6月第29卷第2期Jun12006,Vol129,No12
助孕胶囊对多囊卵巢综合征大鼠性激素含量
及胰岛素样生长因子-1表达的影响
刘艳巧刘润侠党慧敏康小玲
(西安交通大学第二医院中西医结合科,陕西西安710004)
摘要:目的:探讨中药助孕胶囊(ZYJN)(PC机制。

方法:采用皮下埋植左旋18-、助孕胶囊组、克罗米酚组、联合用药+),运用放免法测定血性激素水平的变化,光镜观察卵巢、,-1的表达水平。

结果:,卵泡膜细胞层变薄,血清T、LH水平均明显下降,并下调卵-1的表达。

结论:助孕胶囊能够通过调整内分泌及影响卵巢胰岛素样生长因子-I的表达,在中枢及卵巢局部协调发挥作用,从而调整性腺功能,促进卵泡的发育成熟及排卵。

关键词:多囊卵巢综合征;助孕胶囊;性激素;胰岛素样生长因子-1
中图分类号:R28316;R711175文献标识码:A文章编
号:100420668(2006)022*******EffectofZhuyunjiaonangonGonadalHormoneandInsuli n-like
GrowthFactor-1ofPolycysticOvarySyndromeRats
LIUYan2qiao,LIURun2xia,DANGHui2min,KANGXiao2ling (DepartmentofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicine,SecondHospitalofXi’a nJiaotongUniversity,Xi’an,710004,China)Abstract:Objective:Toinvestigatetheeff ectsofz huyunjiaonang(ZYJN)onratswithpolycysticovaryandtoan2alyzethepossiblemechanism. Methods:PolycysticovaryratmodelswereestablishedbyimbeddedL182methylnorethin2dr onesubcutaneously.Theratsweredividedintothemodelgroup,ZYJNgroup,chloramipheneg roup,associatedmedi2cationgroup(ZYJNandchloramiphene)andvehiclegroup.Thelevelso fserumgonadalhormoneweredetectedbyra2dioimmunoassay.Theeffectsonovariesandova ingtheimmunohistochemic alstainingtechniquedetectedtheexpressedlevelofinsulin2likegrowthfactor21(IGF21)Resu lts:ZYJNcouldincreasethethicknessofgranularcelllayerovaryanddecreasethethicknessoft hecacelllayer,ZYJNgreatlydecreasedthelevelofTandLHinratserumaswellasthe
expressofinsulin2likegrownfactor21(IGF21)inratovary.Conclusion:ZYJNcouldplayarole coherentlyincenterandovarybyregulatingtheendocrinefunctionofratandaffect2ingtheexpr essionoftheIGF2Iinratovarythusadjustinggeniticalglandandpromotingthematureandovul ationoffollic2ular.
Keywords:polycysticovariansyndrome;zhuyunjiaonang;gonadalhormone;insulin2likegr owthfactor21
多囊卵巢综合征(PCOS)是一组发病多因性,
临床表现多态性的综合征,以雄激素过多和持续性无排卵为临床特征。

中药调经促排卵临床疗效确切,助孕胶囊为临床经验方,对PCOS、各种无排基金项目:陕西省中医管理局资助项目(编号:2003-156)
作者简介:刘艳巧,女,1963年生;副教授;研究方向:中医妇科学。

第2期刘艳巧肋孕胶囊对多囊卵巢综合征大鼠性激素含量及胰岛素样生长因子-1表达的影响・31・
卵及排卵障碍导致的月经不调、不孕不育有良好的
疗效。

本试验通过建立PCOS大鼠模型,研究助孕胶囊对PCOS大鼠卵泡发育、性激素水平,卵巢胰岛素样生长因子21(IGF21)表达的影响,以期阐明助孕胶囊对PCOS的治疗作用及可能的分子生物学作用机制,为中药调经助孕提供科学依据。

1材料和方法111材料11111动物
健康SD雌性大鼠,体重50g左右,由西安交通大学医学院动物实验中心提供。

11112药品
中药助孕胶囊制剂室提供(脾、熟地、、红花、半夏、胆南星等),01胶囊,1g胶囊含生药11575g;克罗米酚由上海衡山药业有限公司生产,产品批号040301,50mg/粒。

112方法11211动物模型的制作
参照K1Bogovich[1]、朱辉等[2]的方法,选用24日龄未成年雌性SD大鼠,皮下埋植左旋18-甲基炔诺酮硅胶棒(3mm),在27日龄时每d2次皮下注射115IUHCG,正常对照组每日两次皮下注射注射用水,共注射9d。

37日龄连续阴道涂片2个性周期。

采血,测雄激素(T)、胰岛素(INS)水平。

观察到阴道角化细胞持续出现及结合血清T、INS测定,符合标准者作为PCOS大鼠模型,不符合者剔除。

对照组连续阴道涂片2个性周期全部呈现完整的动情周期,血清T、INS测定在正常范围。

11212动物分组及给药方法1121211动物分组
共分5组,正常对照组10只。

PCOS模型自47龄日起,称体重,分组观察。

将40只模型大鼠随机分为模型组、助孕胶囊组、克罗米酚组、联合用药(助孕胶囊+克罗米酚)组,每组10只。

1121212给药方法
助孕胶囊组生药每日6g/kg体重,克罗米酚组按人与大鼠公斤体重折算系数给药,每日20mg/kg。

联合用药组每日灌服助孕胶囊及克罗米酚(剂量同上)。

对照组和模
型组大鼠同期灌服同体积蒸馏水1mL/100g体重,各组1次/d,共14d。

11213观察指标1121311血清学测定
末次给药后24h,2%戊巴比妥钠013mL腹腔麻醉,打开腹腔,腹主动脉取血,离心、
分离血
清,采用放射免疫法检测血清性激素(FSH、LH、E2、T)水平,由西安交通大学第二医院放免检验科按操作程序测定,批内批间误差<10%。

性激素放射免疫分析药盒购自拉尔文生物工程技术有限公司。

1121312病理观察
双侧卵巢大体解剖观察,并取下双侧卵巢组织、用10%的甲醛液固定,、切片,待做HE,光镜观察卵巢。

1IG1IGF21表达,免SP法。

SP试剂盒和IGF21单克隆抗体购自福州迈新生物技术开发公司,应用DAB显色,均进行抗原修复、HE染色,切片厚4mm,并行阴性和阳性对照。

免疫组化结果判定:阳性染色为棕黄色颗粒,特异性位于细胞膜周围。

对综合染色强度和分布范围进行半定量评分。

评分标准:阴性为0分;染色弱但明显强于阴性对照者为1分;染色清晰者为2分;染色强者为3分。

阳性细胞数者为0分;<10%为1分;20%～30%为2分;>30%为3分。

上述两种评分相加为表达强度评分。

11214统计学方法
所有数据均以均数±标准差(x
±s)表示,各测量值间的比较用One2wayANOVA方差分析,相关性检验用两变量的相关性分析方法,P<0105为具有显著性差异。

2结果211光镜观察结果
对照组镜下见多个黄体及不同发育阶段的卵泡,颗粒细胞呈多层(多为6～8层),形态完整,排列整齐,卵泡膜细胞呈梭形排列。

模型组镜下见卵泡囊性扩张,少量卵巢内有黄体组织,颗粒细胞层数减少,仅为2～3层,颗粒细胞排列疏松,泡膜细胞层明
显增厚。

克罗米芬组镜下见颗粒细胞层数增加,泡膜细胞层变薄,黄体组织数量较模型组明显增多。

助孕胶囊组镜下见颗粒细胞层数较模型组增多,泡膜细胞层变薄,黄体组织数量增多,与克罗米芬组类似。

联合用药组镜下见颗粒细胞层数明显增加,约为4～5层,形态完整,排列整齐。

泡膜细胞层明显变薄,黄体组织数量较模型组明显增多。

212性激素变化
治疗前各组大鼠血清性激素水平有显著差异(P<0105)。

表现为对照组LH、T水平低于其余4组,而E2水平明显高于其余4组,而其余4组组
・32・成都中医药大学学报2006年第29卷
间无显著差别。

治疗后助孕胶囊组、克罗米芬组及联合用药组大鼠血E2、FSH 水平显著高于模型组(P<0105),而3组大鼠之间相比则无显著性意义(P>0105)。

助孕胶囊组血清T、LH水平明显降低,与模型组相比有显著性意义(P<0105),助孕胶囊组及联合用药组与克罗米芬组大鼠相比,血清T水平有显著性差异(P<0105),克罗米芬组及联合用药组大鼠血清LH水平与模型组之间则无显著性差异(P>0105),治疗前后相比,助孕胶囊组各项检测值均有显著性差异(P<0105)。

结果见表1。

组别
E2(dl)108±01060109±01043149±11633151±1177
213卵巢组织IGF-1表达的变化
用药前各组大鼠卵巢组织IGF-1的表达有显
著差异(P<0105)。

表现为对照组值相应低于其它各组,而其它各组组间相比无显著差别(P>0105)。

治疗前后相比,助孕胶囊组及联合用药组IGF-1的表达均有显著性差异(P<0105)。

用药后助孕胶囊和联合用药组大鼠IGF-1的表达显著低于模型组(P<0105),(P>0105)。

,IGF-1的表达01051。

(ml)0122±01110121±01160111±01130110±0117
表1-1表达的影响
LH(mIU/ml)2196±11312198±11737121±11337120±1137
IGF-10162±01350160±01892178±01162181±014532179±017114305433#
2180±01222420902181±01143
3#△
△
对照组模型组助孕胶囊组
克罗米芬组联合用药组
治疗前治疗后治疗前治疗后治疗前治疗后治疗前治疗后
41141281861136±11231131±1187
1135±11143175±11971134±11363151±112334120±11451131±1128
33△33△
3154±1164183132
3151±11763251543149±114433#△33#△
0110±0112019030
0111±011630110±0113
33△33△
7121±1182420050
7120±11546081757121±11466103±0183
33△
3△3△
模型组与对照组比较3P<0105;助孕胶囊组、克罗米芬组及联合用药组与模型组比较
治疗前与治疗后比较△P<0105
3P<0105;助孕胶囊组、联合用药组与克罗米
3讨论
多囊卵巢综合征(PCOS)是妇科内分泌系统
最常见的疾病,占育龄妇女的5%～10%[3],以双侧卵巢呈多囊性改变,伴不孕、多毛、痤疮、肥胖月经紊乱等一组疾病。

本实验采用孕激素联合HCG的造模方法,基本原理在于皮埋左旋18-甲基炔诺酮可使E2、P、FSH、LH均呈现低水平,导致不排卵。

而HCG在卵泡早期使用可致卵泡闭锁,从而形成多囊卵巢综合征。

本实验结果表明,模型组大鼠与对照组大鼠相比T、LH水平明显升高,同时模型组镜下可见卵泡囊性扩张,颗粒细胞层变薄甚至消失,颗粒细胞排列疏松,膜间质细胞增生。

说明本实验所采用的动物模型发现无论是病理形态学变化还是激素水平均与PCOS非常相似。

正常妇女卵泡发育经历募集、选择、优势化及排卵等一系列生理过程。

并且卵泡中只有一部分被募集并选择最后有一个发育成优势卵泡而排卵[4]。

PCOS患者生殖功能障碍的主要特征是卵泡发育障碍和无排卵,高雄激素血症是PCOS的基本病理生理改变之一。

卵泡成熟障碍与高雄激素血症关系密切。

已知适量的雄激素可提高颗粒细胞芳香化酶活性及雌激素的产生。

反之过高浓度的雄激素转化为不能芳香化的双氢睾酮,而且抑制FSH诱导的芳香
化酶活性及颗粒细胞LH受体生成,抑制优势卵泡的发育,促进卵泡的闭锁,这就是PCOS卵泡不能成熟,持久无排卵,闭经,形成多囊卵巢形态的原因[3]。

本研究中治疗前PCOS各组大鼠均有排卵功能障碍,表现为阴道涂片持续角化细胞出现的同时T、LH水平明显升高。

在助孕胶囊治疗组连续两个性周期有3只发生排卵,克罗米芬治疗组有2只发生排卵,联合用药组3只发生排卵。

实验结果表明助孕胶囊可以使多囊卵巢大鼠的颗粒细胞层增厚,卵泡膜细胞层变薄,并且显著降低大鼠血清T 水平,其作用机制可能是通过对颗粒细胞和卵泡膜细胞的作用以及降低多囊卵巢大鼠血清雄激素水平,调整内分泌,卵泡发育抑制因此得到缓解从而促使卵巢排卵,表
现为自发排卵。

而促排卵药克罗米芬为人工合成的非甾体制剂,它是一种具有较强的抗雌激素效应和较弱的雌激素作用的药物。

其作用机制与助孕胶囊相比,无直接促排卵作用,也无抗雄性化作用。

IGF-I是一种结构和功能与胰岛素相似,分子量为7471ku,具有广泛的胰岛素样作用的生长激素依赖性多肽,在人类卵巢可以由卵泡膜细胞和颗粒细胞合成,主要功能是:①促进颗粒细胞的复制和分化、促进蛋白多糖和甾体激素的产生,协同促
第2期刘艳巧肋孕胶囊对多囊卵巢综合征大鼠性激素含量及胰岛素样生长因子-1表达的影响・33・
性腺激素提高颗粒细胞上芳香化酶活性和诱导LH
受体的合成。

②协同胰岛素和LH促进雄激素的生成。

过高的IGF-I可导致雌、雄激素的合成过多和卵泡发育障碍,与PCOS的发病可能有关[5]。

本研究发
现,PCOS大鼠卵巢组织中IGF-1的表达及血清中雄激素水平明显高于正常大鼠,故可推测IGF-1可能通过促进雄激素的合成在PCOS的发病中起一定作用,而助孕胶囊治疗后,PCOS大鼠卵巢组织IGF-1的表达明显下降,同时血清雄激素水平也显著下降,部分大鼠出现排卵,表明助孕胶囊可以通过降低卵巢IGF-1表达水平从而进一步调整内分泌,起到了显著的治疗作用。

PCOS属种中医学“瘕”范畴,、肾、脾三脏功能失调及痰、湿。

助孕胶囊主要组成有紫河车、鹿角胶、仙灵脾、熟地、女贞子、旱莲草、桃仁、红花、半夏、胆南星等,具有补肾活血,化痰散结之功效。

本实验研究了助孕胶囊对PCOS大鼠卵巢卵泡发育、血清性激素水及卵巢组织IGF-I表达水平的影响,其结果提示助孕胶囊可以使PCOS大鼠的卵巢颗粒细胞层增厚,卵(上接第29页)
含腺上皮细胞和内膜间质可随经血逆流,经输卵管进入腹腔,种植于卵巢和邻近的盆腔腹膜,但异位灶在腹腔种植成功后,必须有新生血管的建立才能维持内膜的生存与发展。

因此,血管生成是子宫内膜异位症发生发展的重要环节。

VEGF是血管生长中重要的一个血管生长因子,它具有增加微血管的通透性、促进不同来源的内皮细胞分裂增殖和血管的构建、促使内皮细胞的迁移等多种作用,是已知的最强的血管通透剂。

目前研究证实,子宫内膜异位症患者腹腔液、组织和血清中VEGF呈高水平表达[2-5]。

本实验结果显示,模型组种植异位内膜组织VEGF表达水平明显高于假手术组,提示VEGF过度表达对内异症病情的发展有重要的作用与文献报道一致;异位宁能显著的抑制异位内膜组织VEGF过度表达与达那唑差异无显著性。

医学认为瘀血是产生子宫内膜异位症痛经症状和体征的关键,冲任胞脉因瘀血而功能失调,经络阻滞,冲任气血不通,故见痛经,在此学术思想指导下,我们以活血化瘀消、理气止痛而立论,组方异位宁,方中三棱、莪术破血运气,化瘀消;丹参破血散血,镇静止痛;赤芍清热凉血,行瘀止痛;牡蛎软坚散结;元胡行气活血止痛;当归补泡膜细胞层变薄,使血清T、LH及卵巢组织中IGF-I的表达水平均明显下降,并且能恢复排卵。

本研究提示助孕胶囊能够通过调整内分泌及影响卵巢胰岛素样生长
因子-I的表达,在中枢及卵巢局部协调发挥作用,从而调整性腺功能,促进卵泡的发育成熟及排卵,为中药治疗多囊卵巢综合征不孕提供实验依据的同时也为中医痰湿血瘀症本质的探讨提供了新的思路。

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(收稿日期:2006201206)
血、活血,寓有祛瘀不忘扶正之意。

如此组方用药,使下焦瘀血消散,气畅痛止。

本实验证明,异位宁可改善高E2状态,明显减少异位内膜组织VEGF表达水平,使异位内膜的增殖速度降低,血管生成减少,血供减少,使异位内膜萎缩,由此达到改善内异症患者盆腔内环境,抑制异位内膜组织的生长。

异位宁治疗内异症的机制是多方面的,是综合作用的结果。

中医药治疗子宫内膜异位症充不但有标本兼治的功效,而且副作用少,值得推广应用。

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(收稿日期:2006201229)。