Bmi1基因在肺腺癌干细胞样细胞自我更新、增殖中作用的在体研究

Bmi1 Regulates Self-Renewal and Tumorigenicity of
Cancer Stem Cells in Non-Small Cell Lung Cancer
Abstract
Background
Non-small cell lung cancer (NSCLC) is the leading cause of cancer death worldwide because of its high incidence and mortality rate. Recurrence happens frequently after chemotherapeutic treatment. According to the cancer stem cell hypothesis, a small population of cells within tumors possesses stem-like properties, and is responsible for the initiation and progression of tumors, but also may be the source of tumor relapse. In recent years, substantial experimental evidence has been generated in support of the existence of lung cancer stem cells (LCSCs). Stem-like cells in lung tissue were first isolated from normal mouse lung using stem-cell surface makers, Sca-1+/CD34+, and were termed BASCs. Subsequently, CD133+ cells, which possess self-renewal capacity and can recapitulate lung tumors in immuno-deficient mice, were identified in human lung cancer samples. Refined investigation into the mechanisms required for NSCLC tumorigenesis and chemoresistance may lead to an improved survival rate for lung cancer patients.
LCSCs have been enriched by three different methods, including sorting for CD133+ cell, selecting for side-population (SP) cells that efflux Hoechst dyes, or isolating cellular clusters which resemble self-replicating cells (“tumor spheres”) from suspension cultures. However, these methods purify both LCSCs and some early precursor cells. LCSCs are believed to be resistant to chemotherapy, in part, due to over-expression of an ATP-binding cassette half-transporter, ABCG2, which pumps drugs out of the cells and provides a selective survival advantage. Thus, CSCs are rendered resistant to drug treatment, including chemotherapeutic drugs, and ABCG2 might serve as a marker for stem cells from various sources. Since LCSCs are relatively resistant to chemotherapy, we attempted to enrich LCSCs by consecutive passaging of a NSCLC cell line, A549, in mice treated with Paclitaxel. We also investigated the mechanisms regulate the self-renewal and tumorigenicity of LCSCs.
Bmi1is a member of the Polycomb group (PcG) genes, which are transcriptional repressors that play essential roles in the maintenance of appropriate gene expression during development. Previous studies have identified that Bmi1 was over-expressed in NSCLC and some other epithelial malignancies. In particular, Bmi1 over-expression is correlated with poor prognosis for lung cancer patients. It has recently been reported that Bmi1 is required for the proliferation of various types of differentiated cells and for the self-renewal of stem cells. Some studies have shown that Bmi1 was highly enriched in tumor-initiating stem cells. However, whether the requirement for Bmi1 in lung tumor development correlates with a requirement for Bmi1 to maintain the function of LCSCs has not yet been fully investigated.
In our present study, we provide evidence that the expression of Bmi1 in NSCLC could be stably down-modulated by intratumoral injections with lentivirus-delivered Bmi1-shRNA into xenografts in NOD/SCID mice. The remarkably decreased expression of Bmi1 is associated with the impaired key characteristics of LCSCs-self-renewal in vitro and initiating tumors in vivo. Down-regulation of Bmi1 paralleled increased p16INK4A, known as Bmi1 target. These observations lead us to conclude Bmi1 regulates self-renewal and tumorigencity of LCSCs by silencing some targets proteins including p16INK4A in NSCLC.
Objective
To observe the effect of down-modulation Bmi1 by intratumoral injecting with lentivirus-delivered Bmi1 shRNA into xenografts on the self-renewal in vitro and tumorigenicity in vivo of lung cancer stem cells (LCSCs).
Methods
1. Mouse xenograft models were made by injecting subcutaneously with A549 cells in NOD/SCID mice. To enrich LCSCs in A549-3rd cells by consecutive passaging of A549 in mice treated with Paclitaxel. The proportion of CD133+ cells been determined by fluorescence activated cell sorting (FACS) and the expression levels of Bmi1 and ABCG2 were detected by real-time quantitative RT-PCR and western blotting.
2. Downregulation of Bmi1 in LCSCs by RNA interference. Bmi1 small hairpin RNA (shRNA) sequence and a nonspecific shRNA were designed and packaged into the recombinant lentivirus, named vsh-Bmi1 and vsh-NC respectively. Tumors were injected with vsh-Bmi1, vsh-NC or PBS. The transfection efficency was confirmed by fluorescence
microscope. And the expression of Bmi1 was detected by real-time PCR and western blotting.
3. The spheres formation and xenograft formation ability of A549 cells, A549-3rd cells, A549-4th cells, A549-4th-Bmi1 cells and A549-4th-NC cells has been tested.
Results
1. There is a 12-fold increase (p=0.01) in the number of cells that are able to form spheres in A549-3rd cells compared with parental A549 cells, (15.6% ± 1.5% )and (1.2% ± 0.4%), respectively. Furthermore, spheres from A549-3rd cells could be passaged for at least 8 to 10 generations, while spheres from A549 cells could only be passaged 2 to 3 generations. Eight weeks after been injected, only one of the six mice injected with A549 cells had tumors, while five out of six mice injected with A549-3rd cells had tumors. Similarly, the proportion of CD133+ cells was higher in A549-3rd compared to A549 cells after chemotherapy. And expression of Bmi1 and ABCG2 were both significantly increased (p=0.02) in A549-3rd cells compare to A549 cells.
2. GFP expression was detected in the xenografted tumors 24 hours after lentivirus injection. The expression of Bmi1 in A549-4th-Bmi1 cells was significantly reduced (p=0.02) compared to A549-4th-NC cells and control A549-4th cells. Knockdown of Bmi1 expression resulted in a decrease in the levels of Bmi1 protein compared to the control cells, while the protein level of p16INK4A was significantly increased.
3. After about 7 days of culture in serum-free medium, (0.9% ± 0.2%) of A549-4th-Bmi1 cells, (13.9% ± 1.1%) of A549-4th-NC cells, and (1
4.7% ± 1.3%) of A549-4th cells formed spheres. There was a 14-fold decrease (p=0.01) in the sphere-forming capacity in cells without Bmi1. Although two out of six mice injected with A549-4th-Bmi1 cells developed tumors, there were still significantly fewer tumors overall compared to mice injected with A549-4th-NC and A549-4th cells.
Conclusion
1. These results show that the self-renewal and xenograft formation potential of the A549-3rd cells has increased compared to A549 cells. Therefore, chemotherapeutic treatment selectively enhanced the number of LCSCs in the tumor by the third generation.
2. The expression of Bmi1 in A549-4th-Bmi1 cells was significantly reduced by RNA interference, and knockdown of Bmi1 expression resulted in a decrease in the levels of
Bmi1 protein compared to the control cells. While the increase level of p16INK4A was associated with the reduction of Bmi1 expression.
3. Downregulation of Bmi1 in NSCLC reduces the ability of self-renewal in vitro and tumorigenicity in NOD/SCID mice of LCSCs by silencing some targets proteins including p16INK4A.
Key word: Bmi1, RNA interference, intratumoral injection, cancer stem cells,non- small cell lung cancer.
英文缩略词
英文缩写英文全称中文名称
NSCLC Non-small cell lung cancer 非小细胞肺癌
LCSC Lung cancer stem cell 肺癌干细胞
BASC Bronchioalveolar stem cells 支气管肺泡干细胞
SP Side
populations 侧群细胞
NOD/SCID mice Non-obese diabetes-SCID mic e 非肥胖糖尿病/重症联合
免疫缺陷小鼠
CSC Cancer stem cell 癌干细胞
DEPC Diethypyrocarbonate 二乙基焦碳酸盐
FCS Flow
cytometry 流式细胞术
Real-time PCR Real-time polymerase chain react ion 实时定量聚合酶链反应Western blotting Western blotting 蛋白免疫印迹
GFP Green fluorescent protein 绿色荧光蛋白
PTX Paclitaxel 紫杉醇
Bmi1 B-cell-specific Moloney murine
leukemia virus integration site 1 B细胞特异的莫洛尼白血病毒插入位点1基因
ABCG2 A TP-binding cassette superfamily
G member 2
A TP结合盒G超家族成员2 CD133 Cluster of differentiation 133 白细胞抗原133
EGF Epithelial growth factor 上皮生长因子
bFGF Basic fibroblast growth factor 碱性成纤维细胞生长因子P16 Protein 16P16蛋白
P14 Protein
14 P14
蛋白
RNAi RNA
interference RNA干扰
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Bmi1基因在肺腺癌干细胞样增殖中作用的在体研究
前言
肺癌是目前世界上对人类健康与生命危害最大的恶性肿瘤，且近年来其发病率不断提高。

根据病理类型和治疗策略的不同，肺癌被分为小细胞肺癌(small cell lung cancer ,SCLC)和非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)。

NSCLC约占全部肺癌的85%左右，主要包括鳞癌、腺癌和支气管肺泡细胞癌等，其中，肺腺癌的淋巴结和血行转移发生率显著高于鳞癌，其预后也更差〔1〕，大部分初诊肺癌患者已属中晚期(ⅢB/Ⅳ期)，失去了根治性手术治疗机会，总5年生存率不足15%〔2〕。

因此，更深入地研究肺癌发生、发展、转移、复发过程中的细胞与分子生物学特性，对提高肺癌的早期诊断率及治疗效果具有重要意义。

肿瘤干细胞理论的提出，无疑为恶性肿瘤的根治提供了新的思路〔3-5〕。

肿瘤干细胞是肿瘤组织中存在的一小部分具有干细胞性质的肿瘤细胞，众多研究表明，肿瘤干细胞与正常的干细胞具有相似的自我更新能力和多向分化增殖潜能，并具有相似的细胞表面标志，接受相似的细胞信号通路(如Wnt/ß-Catenin、Notch、Hedgehog、Bmi1、EGFR等)调节〔6〕。

肿瘤干细胞的这些特性使其成为肿瘤发生、转移、复发以及耐药的根源。

自Lapidot等〔7〕首先在急性髓细胞样白血病研究中发现白血病干细胞以来，人们陆续在人的脑胶质瘤、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌等实体瘤中发现了肿瘤干细胞的存在。

虽然肿瘤干细胞已在多种肿瘤中得到分离与鉴定，但目前仍未发现公认的肺癌干细胞标志物。

在肺腺癌有关的干细胞研究中，2005年Kim等〔8〕首次报道的支气管肺泡干细胞(bronchioal veolar stem cells, BASC)被认为是肺腺癌的起源细胞，定位于细支气管肺泡连接处，可以分化成II型肺泡上皮细胞和Clara细胞，在K-ras突变活化的终末支气管、肺泡上皮的不典型增生和腺癌中大量增生。

2007年Eramo等〔9〕在人肺癌组织中发现一群CD133+细胞，具有自我更新、多向分化能力，同时具有恶性肿瘤的表现特征，但由于此类型干细胞的体内成瘤性较弱，且CD133表达过于广泛，以CD133作为肺癌干细胞标志尚有待进一步确认。

Ho等〔10〕于2007年首次发现从人肺癌临床样本和多种人肺癌细胞系中分离出的侧群细胞(SP细胞)具有干细胞特性，高表达包括ABCG2等与耐药相关的ABC跨膜转运蛋白。

在多种人肺癌细胞系中，发现SP细胞表现出显著的体外侵
袭、体内成瘤和对化疗药物抵抗特征，从而认为肺癌组织中SP细胞具有干细胞特性。

但是，正常细胞如何发生恶性转化成为肺癌干细胞，肺癌干细胞在肺癌发生、转移、复发中的作用与调控分子机制，目前尚未明确。

Bmi1属于多梳基因家族(polycomb of genes, PcG)成员，是与细胞周期转换和细胞增殖相关的重要转录抑制因子。

参与Bmi1调控的基因包括INK4a/ARF、端粒酶逆转录酶(hTERT)和HOX家族〔11〕。

在人类，Bmi1在染色体水平作为转录抑制因子负性调控INK4a/ARF位点编码的两种抑癌基因P16INK4a和P14Arf。

许多研究表明在包括非小细胞肺癌在内的多种上皮细胞源性恶性肿瘤中Bmi1呈过表达，并且其表达量与病人的预后存在明显的负相关〔12-15〕。

近来研究表明Bmi1在多种细胞增殖和干细胞自我更新中也有重要作用〔16-19〕。

但是Bmi1是否在维持肺癌干细胞特性中也扮演有重要作用，目前尚未见文献报道。

本课题组在前期的研究中发现肺腺癌组织的Bmi1表达水平显著升高，通过RNA 干扰抑制肺腺癌细胞Bmi1的表达，可以显著抑制其细胞增殖与迁移，但其具体作用靶点尚不清楚〔20〕。

鉴于Bmi1在恶性肿瘤发生、发展中所发挥的重要作用，推测在肺腺癌的形成与转移过程中，Bmi1很可能是调控肺腺癌干细胞干性的重要分子之一。

为了验证这一推测，本研究拟从肺腺癌干细胞入手，首先建立人肺腺癌A549细胞荷瘤小鼠模型，利用肿瘤干细胞相对耐药的特性，通过给予小鼠低剂量化疗药物负荷，在体富集肺腺癌干细胞，并对富集的细胞加以鉴定；利用RNA干扰技术抑制肺腺癌干细胞内Bmi1表达水平，测定Bmi1下调后肺腺癌干细胞悬浮培养“干细胞球”形成能力、体内致瘤能力的变化，并研究了P16INK4a在Bmi1下调后的表达变化，初步探讨Bmi1在肺腺癌干细胞样自我更新、增殖中的作用机制。

第一部分肺癌干细胞的富集、验证及相关基因的检测
肺癌的发生率近年来逐年上升，其中肺腺癌的是非小细胞肺癌的主要类型，淋巴结和血行转移发生率显著高于鳞癌，预后较差〔21〕。

要提高肺腺癌的生存率及临床疗效，需要从其发生、发展、转移、复发的分子机制研究入手，这样才能为临床诊断和治疗提供有效靶点。

2005年Kim首次报道的支气管肺泡干细胞(bronchioal veolar stem cells, BASC)被认为是肺腺癌的起源细胞，在K-ras突变活化的终末支气管、肺泡上皮的不典型增生和腺癌中大量增生。

2007年Ho等从人肺癌临床样本和多种人肺癌细胞系和中分离出的SP 细胞，表现出显著的体外侵袭、体内成瘤和化疗药物抵抗能力，高表达包括ABCG2等与耐药相关的ABC跨膜转运蛋白，被认为是肺癌中具有干细胞特性的一群细胞〔22〕。

利用肿瘤干细胞相对耐药的特性，本实验从建立人肺腺癌细胞系A549的荷瘤小鼠入手，通过给予小鼠低剂量化疗负荷，在体富集肺腺癌干细胞，为下一步研究肺腺癌干细胞在肺癌发生、发展过程中可能的分子机制提供实验基础。

材料和方法
一、材料
1. 细胞系和动物来源
1.1 人肺腺癌细胞系A549细胞来源于ATCC细胞库(American Type Culture Collection，ATCC)，经传代保存于本实验室液氮罐内。

1.2 4~ 6周龄非肥胖型糖尿病联合重症免疫缺陷 (NOD /SCID) 小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司, 按SPF级标准饲养。

2. 主要实验仪器与设备
设备名称生产商或提供者
三气培养箱德国Heraeus
超净工作台苏州净化设备公司
倒置相差显微镜日本Olympus
高速冷冻离心机德国Labofuge400R
纯水系统美国Millipore
激光共聚焦显微镜德国LEICA公司
精密电子天平德国ME215S
细胞培养板新桥医院中心实验室
冻存管新桥医院中心实验室
微孔滤器新桥医院中心实验室
微量可调移液器新桥医院中心实验室
6孔细胞培养板新桥医院中心实验室
24孔细胞培养板新桥医院中心实验室
96孔细胞培养板新桥医院中心实验室
光学显微镜日本Olympus
电热恒温水箱上海BHW-IV
PH计德国P5500
流式细胞仪美国Beckman公司
蒸汽灭菌器上海LDZX-40BI
低温冰箱北京医用低温设备厂DXZ25-370
细胞计数板新桥医院中心实验室
200目滤网新桥医院中心实验室
台式水浴恒温振荡摇床江苏太仓市实验设备厂
稳流稳压电泳仪DYY-Ⅲ8B 北京六一仪器厂
ABI-7500 real-time定量 PCR仪美国应用生物系统公司
Bio-rad垂直电泳仪美国Bio-rad公司
Bio-rad半干转膜仪美国Bio-rad公司
生物安全柜苏州净化设备公司
3. 主要实验试剂
试剂名称生产商或提供者
Corp.) RPMI-1640 培养基 Gibco(Invitrogen
Ltd 重组人表皮生长因子(EGF) PeproTech
EC
EC
Ltd
重组人碱性成纤维生长因子(bFGF) PeproTech
10mM HEPES Gibco(Invitrogen Corp.)
Inc 特级胎牛血清(FBS) HyClone
Laboratories,
左旋谷氨酰胺 Ameresco,Inc.
Corp.分装
胰岛素 Sigma-Aldrich
Corp.) 青霉素、链霉素 Gibco(Invitrogen
0.05% trypsin-EDTA Gibco(Invitrogen Corp.)
Corp.
二甲基亚砜(DMSO) Sigma-Aldrich
紫杉醇注射液江苏豪森药业
Biotec
PE标记鼠抗人CD133单克隆抗体 Miltenyi
台盼蓝上海捷倍思技术有限公司
胰酶上海化学试剂有限公司
DMEM Gibco
胰酶抑制剂Sigma
IV型胶原酶Sigma
DNase I Sigma
Western及IP细胞裂解液碧云天生物技术公司
PMSF 碧云天生物技术公司
RNAstore 天根生物有限公司
RNAprep pure组织总RNA提取试剂盒天根生物有限公司
Quant cDNA第一链合成试剂盒天根生物有限公司
2.5×RealMasterMix试剂盒天根生物有限公司
兔抗人Bmi-1 多克隆抗体Santa Cruz
兔抗人α-tublin 多克隆抗体Santa Cruz
兔抗人ABCG2 多克隆抗体Santa Cruz
4. 主要液体配制
4.1试剂配置
(1) A549细胞培养基
在超净工作台内将RPMI-1640培养基完全溶于超纯水中(millipore)，负压抽滤，
调节pH值，分装于500ml无菌玻璃盐水瓶中，4℃保存备用。

使用时每90mlRPMI-1640
培养基内加入胎牛血清10ml，得到完全培养基。

(2) 无血清培养基(SFM)
用DMEM/F12培养基将EGF和bFGF分别稀释至2µg/ml，将稀释液以50µl/支分
装置于-20℃冰箱备用。

临用时将DMEM/F12培养基500ml中添加上述EGF、bFGF 和营养物质稀释液各一支，再添加5ml青霉素/链霉素储存液，混匀、封装后置4℃备用。

以上操作在超净台内进行，严格无菌操作。

培养基一般新鲜配制，随配随用，如超过30天需要重新加入EGF和bFGF生长因子。

(3) PBS液(0.01 mol/L,PH 7.4):NaCl 8.00g，KCL 0.20g，KH2PO4 0.20g，NaH2PO.H2O 1.56g，1000ml ddH2O溶解，高温高压灭菌。

(4) 0.25%胰蛋白酶: 0.25g精制胰蛋白酶粉溶于100mlPBS液中，混匀，0.22µm无菌过滤器过滤除菌，分装后-20℃保存。

(5) 0.4%台盼蓝溶液：台盼蓝4g,加少量蒸馏水研磨，加双蒸水100ml，用滤纸过滤，配制成4%的储存液，4℃保存。

使用时，用PBS稀释至0.4%。

(6) 细胞冻存液：DMSO: 含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基=1 : 9
(7) 紫杉醇：药物原液浓度为30mg/5ml。

取其中0.5ml，加入2.5mlNaCl，配置成1mg/1ml的液体，4℃保存冰箱避光保存，每次现用现配。

(8) 胶原酶：取0.1g胶原酶，溶于100mlPBS液体内，配成浓度为0.1%的液体。

用1mlEP管分装后，-20℃保存冰箱保存。

(9) 1mg/ml碘化丙啶：在100 mg碘化丙啶中加入100 ml PBS，混匀完全溶解后4℃保存。

(10) 10mg/ml RNaseA：10 mg RNaseA溶于1 ml的超纯水中，4℃保存。

4.2 其他实验相关试剂
(1) 30％丙稀酰胺甲叉双丙稀酰胺液(29：1)
丙稀酰胺 29g
甲叉双丙稀酰胺1g
溶于100ml双蒸水中，4℃储存。

(2) TBST溶液(pH7.0-7.2)
TBS(磷酸盐缓冲溶液) 10mmol/L
Tween20 0.5%
加入Tween-20 10ml，最后定容至1L，于4℃保存备用。

(3) 2×SDS凝胶加样缓冲液
Tris-Cl (pH6.8) 50mmol/L
二硫苏糖醇(DTT) 100mmol/L
2% SDS (电泳级)
0.1% 溴酚蓝
10% 甘油
不含DTT的上样缓冲液保存于室温，临用时加入DTT达100mmol/L。

(4) 12%分离胶
30%丙稀酰胺甲叉双丙稀酰胺液 2.0ml
1.5mmol/L Tris-Cl(pH8.8) 1.3ml
10%SDS 50µl
双蒸水 1.6ml
10%过硫酸铵50µl
TEMED 2µl
混匀后立即灌胶，整个胶块不能有气泡，胶上层双蒸水封闭。

室温放置至自然凝固。

(5) 5%浓缩胶
30%丙稀酰胺甲叉双丙稀酰胺液0.33ml
1.0mol/L Tris-HCl(pH6.8) 0.25ml
10%过硫酸铵 20µl
10%SDS 20µl
双蒸水 1.4ml
TEMED 2µl 灌胶后迅速插入梳子，并保证梳子与胶之间没有气泡，于室温凝固。

临用前拔出梳子，用双蒸水冲洗未完全聚合的丙稀酰胺液，灌入电泳缓冲液，上样。

(6) 5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液(pH8.3)
Tris 15.1g
甘氨酸 94g
SDS 5g
双蒸水调整pH至8.3后定容至 1L，室温保存。

临用时以1：5与双蒸水混和用。

(7) 考马斯亮兰脱色液配置
无水甲醇 45ml
冰乙酸10ml
双蒸水 45ml
配好后于棕色瓶内、室温保存。

(8) 考马斯亮兰染色液
考马斯亮兰(R-250) 0.25g
脱色液100ml
用Whatman 1号滤纸过滤后于室温保存，可回收后反复用。

(9) 转移缓冲液(pH7.4)
Tris 3.9g
甘氨酸 2.9g
SDS 5.8g
无水甲醇200ml
双蒸水定容至1L，于4℃保存。

(10) 10×丽春红S染色液
丽春红S 2g
三氯乙酸30g
磺基水杨酸30g
双蒸水定容至100ml,室温保存。

(11) 终止液
0.5mol/L EDTA-2Na 200ul
0.01mol/L PBS 50ml
室温保存。

(12) 50×TAE电泳液
Tris 242.2g Na2EDTA·2H2O 37.2g
醋酸 57.1ml 定容至1L后，室温保存。

(13) 1mg/ml碘化丙啶
在100 mg碘化丙啶中加入100 ml PBS，混匀完全溶解后4℃保存。

(14) 1mg/ml RNaseA
10 mg RNaseA溶于1 ml的超纯水中，4℃保存。

二、方法
1. A549细胞培养
1.1 A549细胞的复苏
从液氮罐中取出冻存管内的A549细胞，直接投入37℃的温水中，并不时摇动使其尽快融化。

待冻存液完全溶解，从37℃的温水中取出冻存管，酒精消毒冻存管，用吸管吸出细胞悬液，注入10ml离心管，再加入9ml RPMI-1640培养液，轻轻吹打混匀，1000rpm×5min离心5min，弃上清，再用培养液洗一次。

弃上清，加入5ml RPMI-1640完全培养液，轻轻吹打混匀，移入25ml培养瓶，置于含5%CO2、37℃培养箱中培养。

每2-3日更换培养基。

1.2 A549细胞的传代
细胞融合90%左右进行传代。

倒掉培养液，向培养瓶中加入0.25%的胰蛋白酶0.5ml，轻轻摇动培养瓶，30s后倒置显微镜下观察，见细胞间隙增大、胞质回缩。

立即加入少量胰酶抑制剂，终止消化。

将消化下的单细胞悬液1000rpm×5min离心，去上清，加入新的培养基，分装至3个新培养瓶内，继续培养。

1.3 A549细胞的冻存
选取对数生长期的A549细胞，以胰酶消化细胞后，置于10ml的离心管内，1000rpm ×5min离心，弃上清，加入细胞冻存液重悬细胞，计数板计数，调整细胞浓度约为1×106/ml。

每只冻存管内加入调整好的细胞悬液1.5ml，旋紧管盖，胶布封固，标注细胞名称、冻存时间。

细胞按照在4℃，30min→ -20℃，2h→ -80℃，过夜→液氮中保存的顺序放置冻存。

1.4 A549细胞计数及活力测试
将血球计数板及盖片用擦试干净，并将盖片盖在计数板上。

将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。

镜下观察，记录计数板四大格细胞总数，如有压线的细胞只计方格左侧和上方的。

然后按下式计算：细胞数/ml＝4大格细胞总数/ 4×10000。

活力测试：将细胞悬液以0.5ml加入试管中。

加入0.5ml 0.4%台盼蓝染液，染色2-3分钟。

吸取少许悬液涂于载玻片上，加上盖片。

镜下取几个视野分别计数死细胞和活细胞数量，计算细胞活力。

活细胞不被染色，镜下呈无色透明状，死细胞能被台盼蓝染上色，镜下可见深兰色的细胞。

2. 肺腺癌干细胞的富集
2.1 A549细胞荷瘤小鼠模型的建立及化疗富集肺腺癌干细胞
选取对数生长期的A549细胞，以胰酶消化细胞后，镜下观察，见细胞间隙增大、胞质回缩，立即加入少量胰酶抑制剂，终止消化。

置于10ml的离心管内，1000rpm×5min离心，弃上清，重悬于1mlPBS缓冲液中，用巴斯德吸管吹打，成单细胞悬液，
显微镜下计数，调整细胞浓度为1×109/ml，将悬液用6号针头皮下接种到6只4-5周龄的NOD/SCID鼠左侧腋下，每只注射0.2ml，即2×108个细胞。

游标卡尺测量移植瘤最大径达到0.5cm起，小鼠腹腔注射化疗药物紫杉醇, 1次/周。

药物剂量按25mg/kg体重计算。

直至肿瘤长至2.0cm左右传代。

2.2 移植瘤细胞的传代、保存
小鼠皮下移植瘤直径达2.0cm时，脱颈法处死小鼠。

迅速取出瘤块。

用0.1%DEPC 溶液浸泡过夜的无菌器械将瘤块剪成3部分：一部分剪碎成厚度小于0.5cm的小块后放入含RNAstore的液体的EP管内，保证组织体积：RNAstore体积<1:10，4℃放置过夜后，-20℃冰箱保存，用于下一步行real-time RT-PCR。

一部分组织液氮速冻，放入 -20℃冰箱保存，下一步行Western blotting检测。

一部分组织用PBS反复漂洗后，剪刀充分剪碎，加入适量0.1%胶原酶以及0.002%的DNA酶，37℃放置约30min，每5分钟用吸管轻柔吹打一次，直至镜下可见大量单细胞悬液。

200目滤网过滤，收集过滤液于10ml的离心管内，1000rpm×5min离心，去上清，PBS重悬，1000rpm×5min再次离心，PBS液体重悬。

倒置显微镜下细胞计数并测定细胞活力。

取出部分细胞做“干细胞球”培养，部分细胞冻存，剩余细胞调整浓度为1×108/ml单细胞悬液，用6号针头接种到4-5周龄的NOD/SCID鼠腋下(共6只，每只0.2ml，即2×107个细胞)。

待瘤块直径达到0.5cm时，给予小鼠腹腔化疗，方法同2.1。

移植瘤共传3代，消化过滤第二代、第三代瘤块，分别得到A549-2nd、A549-3rd细胞。

3. 体内成瘤能力比较
将一定量的A549细胞、A549-3rd细胞，分别置于10ml的离心管内，1000rpm×5min 离心，弃上清，重悬于2ml PBS缓冲液中，用巴斯德吸管吹打，成单细胞悬液，显微镜下计数，调整细胞浓度分别为1×106/ml、1×105/ml，6号针头皮下注射到4-5周龄的NOD/SCID鼠腋下，每只注射0.2ml，即分别注射2×105、2×104个细胞。

每组6只。

每3天观察一次NOD/SCID小鼠一般情况，游标卡尺测量肿瘤直径。

移植瘤体积(V)计算公式：V=a2×b×0.4(其中a为最长径，b为最短径)。

4. 有限稀释法无血清培养A549、A549-3rd细胞
将A549细胞、A549-3rd细胞离心后重悬于PBS液中制成单细胞悬液，台盼蓝染色计数后，梯度稀释成1000个/ml的细胞悬液，在96孔板内每孔加入2µl左右细胞悬液，每孔再加入150µl无血清培养基。

置于含5%CO2、37℃培养箱中培养。

4小时后观察每个孔的细胞接种数目，计数含有单个细胞的孔。

每3天加入10µl新鲜培养基。

1周后镜下观察单细胞形成克隆样生长的比例，每个克隆的细胞个数≥10个细胞可认为
是“细胞球”形成。

计算“细胞球”形成率：
有细胞球形成的孔数
成球率= ———————————————×100%
单细胞的孔总数
5. 流式细胞仪检测A549、A549-2nd、A549-3rd中CD133+细胞比例
收集A549、A549-2nd、A549-3rd细胞，加入PBS，制成单细胞悬液，计数不少于105个细胞。

1000rpm×5min离心，去上清，重悬于含有0.5%BSA及2mMEDTA PBS 中，加入PE标记的鼠抗人单克隆CD133抗体，4℃避光孵育10min，离心后弃上清，以PBS溶液洗涤2次。

充分吹打成单细胞悬液后，流式细胞仪进行分析检测。

同时以PE标记的小鼠IgG作为同型对照。

6. Western blotting检测A549、A549-3rd细胞移植瘤组织中Bmi1、ABCG2表达量
6.1 组织蛋白质的抽提
称取约250mg剪刀剪碎后的组织，加入1ml含1mM PMSF蛋白裂解液。

置于冰上玻璃匀浆器匀浆,充分裂解约20min，将裂解后所得组织至于EP管内，12000g×5分钟离心，取上清，-70℃保存。

6.2 蛋白定量
BCA方法测定提取蛋白的浓度。

取1.2ml蛋白标准配制液加入到30mg BSA的蛋白标准中，配制成25mg/ml的蛋白标准溶液，再稀释至终浓度为0.5mg/ml，制成0.5mg/ml蛋白标准。

标准品用与样品相同的溶液稀释。

取2000µl BCA试剂A加40µl BCA试剂B (50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀。

将标准品按0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20 µL加到96孔板的标准品孔中，加标准品稀释液补足到20 µL。

加适当体积样品到96孔板的样品孔中，加标准品稀释液到20 µL。

每孔加入200 µL BCA工作液，37℃放置30分钟。

设3个复孔。

测定562nm波长。

根据标准曲线计算出样品的蛋白浓度。

6.3 SDS-PAGE凝胶电泳
凝胶由5％浓缩胶和12％的分离胶所组成，其中浓缩胶1cm，分离胶5cm。

取出保存于-70℃中的蛋白，用RIPA缓冲液稀释至1µg/µl，取10µl稀释液与适量的DTT混和，与振荡器上混匀。

放置于沸水中10min，然后于冰上放置2min左右。

以1000rpm短暂离心使液体沉到离心管底，再加入适量的DTT，于振荡器上混匀，上样。

以恒压90V电泳150min。

电泳结束后，切下蛋白Marker所在胶条进行考马斯亮兰染色，样品所在部分经上下缘各切去0.5cm后做蛋白质转印。

6.4 蛋白质印记
采用半干式转移装置转移蛋白。

胶和滤纸直接于转移缓冲液中浸泡30min。

孔径0.45µm的PVDF膜先用无水甲醇处理30s，然后置于转移缓冲液中浸泡30min。

先做“三明治”夹心：按照三层滤纸－胶－膜－三层滤纸的顺序排列，并排完夹层之间的气泡。

以1mA/1cm2电转印40min，胶进行考马斯亮兰染色观察转印效率，膜进行蛋白质杂交。

6.5 蛋白质免疫杂交
转印结束后，PVDF膜置于瓶皿中干燥约1min以使蛋白质“固定”。

于0.1%PBST 中洗涤10min；用立春红溶液浸泡10min染色，观察转印初步情况满意后。

然后在0.1％PBST中洗涤3次，每次10min；用0.1％PBST以1：1000稀释兔抗人Bmi1多克隆抗体，ABCG2、α-tublin抗体于4℃过夜(约10小时)，然后于室温温育1h；剪开封闭袋，于室温，用0.1％PBST中洗涤膜5次，每次10min；用0.1％PBST以1：2000稀释辣根过氧化物酶二抗，于室温和PVDF膜共同温育1h；取出PVDF膜，用0.1％PBST 中洗涤膜5次，每次10min；显色。

将膜放入辣根过氧化物酶显色液中显色5～10min，待目的条带清晰可见时将膜放入终止液中终止反应。

PVDF膜于室温晾干，用FR-200凝胶图像成像分析系统照相，应用Quantity One软件分析目的条带结果以灰度×面积(积分光密度 IOD)表示，并和内参比较得出目的基因表达的相对比值。

7. Real-time 实时荧光定量PCR检测A549、A549-3rd细胞中Bmi1、ABCG2表达量
7.1 引物设计
参照人Bmi-1基因(NM_005180.6)，ABCG2基因(NM_004827.2)cDNA 序列，使用primer premier 5 软件设计引物，ABCG2引物为5’- CAGGTGGAGGC AAATCTTCGT -3’ (上游)，5’- ACACACCACGGATAAACTGA -3’(下游); Bmi1引物为5’- CTGGTTGCCCATTGACAGC-3’(上游)，5’- CAGAAAATGAATGCGAGCCA-3’ (下游);β-actin内参引物5’-CCTGGCACCCAGCACAA T-3’ (上游) ， 5’–GCCGA TCCACACGGAGT ACT-3’ (下游). 所有引物由上海生物工程有限公司合成。

7.2 RNA提取及纯度测定
7.2.1 样品前处理
从RNAstore液体中取出组织，取约20mg组织中加入约300µl裂解液，用研磨棒充分研磨。

7.2.2 裂解和吸附
向匀浆液中加入590µl RNase-free ddH2O和10µl蛋白酶K，混匀后56℃处理。