激光扫描共聚焦显微镜

1、 选择好适宜的荧光探针。 原则上讲,无论是荧光素还是荧光标记抗体均 可用于LSCM 。如果打算用2种以上荧光标记物,要 注意它们是否激发光波长及发射光波长能区别开， 还要注意是否与LSCM的激发器相匹配，要根据现有 的激发波长来选择荧光标记物。
• 不同的荧光探针在不同标本的效果常有差异，故除综合 考虑以上因素以外，有条件者应进行染料的筛选，以找 出最适的荧光探针。
6.观察活细胞、活组织：ＬＳＣＭ在不损伤
细胞的前提下，对活组织、活细胞进行观 察和测量，这不仅省去了繁琐的样品前期 处理过程(如脱水、脱蜡、染色等);而且观 察过的样品还可以继续用于其他的研究。 这种功能对于细胞培养、转基因研究尤为 重要。这可以说是ＬＳＣＭ最大的优势。
7. 生化成分精确定位观察配合专用的分子探 针，对于要检测的成分不仅可以定位到细 胞水平，还可以定位到亚细胞水平和分子 水平。
2015/6/12
激光扫描共聚焦显微镜：以激光作为激发光源，采用 光源针孔与检测针孔共轭聚焦技术，对样本进行断层扫 描，以获得高分辨率光学切片的荧光显微镜系统.
形态学研究：组织细胞 标本的抗原免疫荧光检 测，凋亡检测…
目的结构是用荧光探针标记的， 都可以用激光共聚焦显微镜观察
分子生物学：荧光原位杂交对DNA 和RNA定量，外源基因在真核细胞 的表达及定位，蛋白质相互作用 (FRET)…
4. 采 用点扫描技术将样品分成无数个点，用十分细小的激光 束逐点逐行扫描成像，再通过电脑组合成一个整体。传统的 光镜在场光源下一次成像，标本上每一点都会受到相邻点的 衍射光和散射光的干扰。这两种图像的清晰度和精密度是无 法相比的。
5.光电倍增管：检测设定范围内的光信号，并将光信号转换成 电 信号，相当于相机中的CCD或胶卷。 PMT只能检测到信号的强弱，不能记录信号的颜色，记录 的 结果通过信号强度和填充颜色表示。PMT单位用电压值V 表示，数值越大代表信号倍增越大，提高倍增会同时增加图 像的正常信号强度和噪声信号强度，使图像的信噪比下降。
照 明 针孔 光源
聚 集 平面
光 电 倍增管 检 测 针孔
分色镜
物镜 样本
只有焦平面上的点所发 出的光才能透过检测针 孔；焦平面以外的点所 发出的光线被检测针孔 阻挡，绝大部分无法通 过。因此，焦平面上的 观察目标点呈现亮色， 而非观察点则作为背景 呈现黑色，反差增加， 图像清晰。
探测针孔的作用示意图
time
Y XY平面 X
Z Y
Peripheral nervous system of a fruit fly embryo
XY平面ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱX
3
三维扫描及重构 (3-D reconstruction, x-y-z)
2015/6/12
激光共聚焦显微镜的设计特点：
1. 激光： 经过照明针 孔后形成 点光源 ， 光 源方 向性强、发散小、亮度高、颜色纯、单色性强。 2.光束分离器：将样品激发荧光与其他非信号 光线分开。 3.照明针孔和探测针孔：最大限度的阻挡非聚 焦平面以及聚焦平面上非焦点斑以外的散射光， 以保证探测器针孔所接受到的荧光信号全部来 自于样品焦点位置。
随着技术的不断发展和完善，产品的性能 也不断改进和更新，应用的范围也越来越 广泛。
一.激光扫描共聚焦显微镜基本配置
Confocal scan and detector unit 共聚焦扫描及检测装置
Computer 计算机
Microscope 荧光显微镜
Laser and electronic Control Unit 激光光源及 控制装置
7
3 荧光标记各种亚细胞结构： 细胞内微丝：荧光染料标记的毒蕈肽(phalloidin)
2015/6/12
细胞膜荧光探针：DiI 即DiIC18(3) [1,1’dioctadecyl-3,3,3’,3’-tetramethylindocarbocyanine perchlorate，红]和DiO即DiOC18(3) [dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate，绿]
光照下易淬灭，不易保存。
另一种常用的共价标记物是罗丹明，其光稳定性比 FITC好。其衍生物TRITC（四甲基异硫氰基罗丹明） 是常用的共价标记探针，发红色荧光。
2、样品要求：
1）经荧光探针标记(单标、双标、多标） 2）固定的或活的组织 3）固定的或活的贴壁培养细胞应培养在Confocal
专用小培养皿或盖玻片上 4）悬浮细胞，甩片或滴片后，用盖玻片封片
Leica TCS SP-2 AOBS Confocal System
Antivibration table 防震台
1
2015/6/12
成像基础：荧光物质中的电子吸收光的能量由低能状态 转变为高能状态，再回到低能状态时释放出的光。荧光物 质吸收短波光，发射出长波光。
成像主要原理 ： 利用放置在光源后的照明针孔和放置在检测器前的 探测针孔实现点照明和点探测。
XY平面 Z
Y
X
XY平面 Y
X
Optical sections collected simultaneously at three different excitation wavelengths (488, 568, and 647 nanometers). The specimen is the fruit fly third instar wing imaginal disk.
* 许多荧光探针是疏水性的，很难或不能进入细胞，需使 荧光探针与AM（乙酰羟甲基酯）结合后变成不带电荷的 亲脂性化合物方易于通过质膜进入细胞，在细胞内荧光 探针上的AM被非特异性酯酶水解，去掉AM后的荧光探 针不仅可与细胞内的靶结构或靶分子结合且不易透出质 膜，从而能有效的发挥作用。
5
2015/6/12
关键在于：照明针孔与探测 器针孔及焦平面形成共聚焦 装置。 检测针孔和照明针孔始终聚 焦于同一点，使聚焦平面以 外被激发的荧光不能进入检 测针孔 高分辨率的光学 切片
以微动步进马达控制载物台升降,可自由调节厚 度逐层获得高反差、高分辨率、高灵敏度的三维光学 横断面图像, 通过纵向扫描,可以逐层研究切片,得到 各层面的数据。因此,这一技术也称之为“细胞断层 扫描”即细胞CT。实现了图像三维重建。普通荧光显 微镜为X线。
系统和共轭聚焦成像系统。
1987年White和Amos在英国《自然》杂志发表了 “共聚焦显微镜时代的到来”一文，标志着LSCM 已成为进行 科学研究的重要工具。
我国在1990年引进五台LSCM，到了1997年 已有了三十多台设备。产品主要来自四家 公司，美国的Bio-Rad和Meridian公司，德 国的Zeiss和Leica公司。
Hoechst33342 ,Hoechst33258和DAPI，这三种都是 DNA的特异性的荧光染料，细胞毒性小，特异性强。 与DNA结合后都是以紫外光激发，发射明亮的蓝色 荧光，分辨率高。
FITC（异硫氰酸荧光素）能够结合细胞内总蛋白质， 它是检测蛋白质最常用的荧光探针。用488nm的激 光器激发后，发出明亮的绿色荧光。
gfp与外源基因连接gfp可作为外源基因的报告基因实时监测外源基因的表达活细胞特定蛋白的准确定位及动态观察如转录因子核转位基因表达粘附分子的膜转位细胞运动gfp与分泌蛋白基因连接动态观察蛋白分泌至细胞外的全过程gfp与细胞器特异蛋白基因连接显示细胞器的结构和生理活动观察蛋白之间的相互作用fret光活化荧光蛋白photoactivatedpa最早报道的光活化荧光蛋白是对野生型wtgfpt203h点突变后产生的pagfp属于不可逆的改变亮度的光活化荧光蛋白类
4
激光扫描共聚焦与传统荧光显微镜的主要区别： 1.激光扫描共聚焦显微镜只接收共焦点处荧光。分辨率 高，清晰度高。 2.普通荧光显微镜不仅接收焦平面上的光，来自焦平面 上方或下方的散射荧光也被物镜接收。
2015/6/12
CCD PMT
FV1000 (Olympus)： 多个荧光通道 (405, 458, 488, 515, 543, 633)，可同时 检测多个荧光标记。 一个透射光通道，透射光图像为非共焦图像。
时间序列扫描: xyt 、xyzt 和 xt 扫描
0s
10 s
20 s
30 s
Time-lapse imaging of a living fruit fly embryo injected with calcium green is presented in Figure 2. The series of images shows the change in distribution of the fluorescent probe over time.
内质网探针：荧光标记的glibenclamide 高尔基体探针：荧光标记的C5-ceramide。 溶酶体探针：荧光标记的DND99 线粒体探针：荧光标记的carbocyanine 线粒体膜电位探针：JC-1 [5,5’,6,6’-Tetrachloro1,1’,3,3’-tetraethyl-imidacarbocyanine iodide]
8
2015/6/12
5 荧光共振能量转移 (FRET, Fluorescence Resonance Energy Transfer)
confocal
conventional
2
2015/6/12
单一光学切片扫描 (single optical section, x-y) 时程活细胞扫描 (time lapse live cell imaging, x-y-t) 三维扫描及重构 (3-D reconstruction, x-y-z) 四维扫描 (4-D imaging, x-y-z-t)
8.动态观察在同一样品平面上随时间进行连 续扫描,就可分析细胞结构、内含、和标记 等动力学变化。目前在这方面做得最多的 是使用ＬＳＣＭ观察心肌或平滑肌细胞内 游离钙、钠、钾离子浓度或ｐＨ的动态变 化。
9.定量测量：首先应用专一的荧光探针对样 品进行染色，样品的荧光强度和所测成分 的含量呈正比，如果其余条件固定，通过 对比各组样品之间的荧光强度值，可得出 特定成分的含量比。
活细胞动态荧光测量：细胞 内 Ca2+、 Cl-等 离 子 的 动 态 分 布及定量，细胞连接间的信 息传递(FRAP)…
1971年美国Davidovits和Egger发明了以激光为光源 的透镜扫描系统。
1978年Sheppard等推出了载物台扫描装置。 1979年发明了样品扫描装置。 1980年Koestert等研制了镜扫描系统。 1983到1986年Aslund和Carlsson等发明了双镜扫描
confocal小皿
在35mm塑料平皿的圆形 底部中央打出一个直径1cm 左右的圆孔，并从平皿底部 的外面粘上一个厚度为 0.17mm的透光性极好的盖玻 片以密封园孔，并配有平皿 盖。
Confocal小皿兼有平皿和盖玻片双重优点 1、透光性比塑料平皿底部的透光性好，因此对细 胞等样品的成像效果好，质量高。 2、底部盖玻片厚度不大于0.17mm，适用于高倍镜 观察和高质量成像。 3、观察时，细胞上方有液体覆盖，不必加盖玻片， 能够保持细胞等样品不变形，不干燥，保持其原有 形态。 4、可以随时对细胞进行洗涤、加刺激物等处理， 利于保持细胞的生长和操作。
4 荧光漂白恢复（FRAP，Fluorescence Redistribution After Photo bleaching） FRAP应用于研究蛋白在细胞中的扩散。 测定活细胞的动力学变化，借助于高强度脉冲激光来照 射细胞某一区域，造成该区域荧光分子的淬灭，该区域 周围的荧光分子会以一定的速率向受照射区域扩散，其 扩散速率可通过低强度激光扫描探测到。 可以实时监测分子的扩散速率和恢复速率，反映蛋白流 动的迁移率或细胞间分子通讯等细胞活动机制。
6
3. 必须先在荧光显微镜下进行预实验,然后再行LSCM观 察。
应当强调指出,荧光染色不佳的标本,用LSCM并不能 获得更好的影像。这有几个原因: ①检测针孔滤掉大 部分光线,因此光量有限；②对染色不佳的标本,不得 不将明亮度和对比度设置很高,这样在最终影像上引起 光子噪声,形成颗粒化的图像。因此,适于LSCM的标本 必须是荧光镜下显示良好, 或者标本较厚而不适于荧 光镜者。
2015/6/12
激光扫描共聚焦显微镜的 主要应用
1 免疫荧光染色 (单标、双标、多标) 细胞浆、核、膜抗原的分布、半定量分析 几种抗原的共定位 抗原与细胞器的共定位 抗原转位
转铁蛋白在K526细胞中的定位
2 荧光标记活细胞内成分： 氯离子荧光探针：MQAE 细胞内pH的荧光探针：BCECF AM 活性氧荧光探针：DCFH-DA NO荧光探针：DAF-FM DA