生物芯片应用生物芯片检测细胞中microRNA的表达

1.2 miRNA 芯片的制备
所用的210 个寡核苷酸探针为mirVanaTM miRNA Probe Set试 剂盒(Ambion) , 其中206 个与已知的人类和小鼠miRNA 序列互补, 4 个为阳性对照。3×SSC 点样缓冲液溶解探针至50 μmol /L, 用 SpotArrayTM 24 基因芯片点样仪( Perkin Elmer) 印制于 SuperChipTMⅠ(PerkinElmer) 玻片表面, 制成miRNA 寡核苷酸芯 片。每次杂交前进行水合、干燥等点样后处理。
实验中用荧光标记的miRNA 直接与miRNA 检测芯片杂交, 检测发现 6种细胞系有各自不同的miRNA 表达谱。实验检测到miR- 21 在6 种肿瘤 细胞中的表达水平均较高,这与文献报道的miR- 21 在70%的肺癌和70% 的结直肠癌患者中表达上调一致[6]。Iorio 等[7]也发现, miR- 21 在乳腺 癌中表达明显上调, 而且在一定程度上可以显示肿瘤的恶性程度。miRNA 集簇存在是其一个显著特征, 我们检测到miR-17- 5p 与miR- 20a的表达 水平类似, 而也有文献报道miR- 17- 5p 与miR- 20a 及其他4 种miRNA 成 集簇存在于人类第13 号染色体上[8]。O'Donnell等[9]通过染色质免疫沉 淀实验, 发现c-Myc 可直接与miR- 17- 5p集簇位点结合, 激活其表达, 提 示这一miRNA 的表达可能和肿瘤的发生存在某种关联。MCF- 7 和HeLa 分别来源于人类乳腺和宫颈, 它们发育起源类似, 共同起源于胚胎内胚层。 我们检测到MCF- 7 和HeLa 细胞miRNA 的表达谱聚为一类。提示在哺乳 动物体内特殊的miRNA 有可能参与维持胚胎早期发生过程中的多潜能细 胞状态[10], 在器官和组织的发育、形成中发挥重要调控作用。
k562细胞中的前体mirna和成熟mirna表达量都非常高虽然标记反应没有对premirna进行荧光标记但在杂交过程中大量的premirna仍可能和相对较少的成熟mirna竞争影响了荧光标记的成熟mirna与探针的结合掩盖了k562中mir175p或是实验过程中的系统误差这种情况在普通的生物芯片技术中也存在
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2.3 数据聚类分析
将扫描得到的杂交后图像用ScanArray3.0 软件进பைடு நூலகம் 处理, 所得数据经归一化和对数转换后, 用Cluster3.0 进行聚类分析。结果, MCF- 7 和HeLa 细胞miRNA 的表达谱聚为一类。
2.4 RT- PCR 检测
用特异性引物对miR- 17- 5p、miR- 21 前体进行扩增, 同时以U6 作为内参。各细胞中miRNA 前体的表达水 平经内参校正后, 发现miR- 17- 5p 前体在K562 细胞 中的表达水平最高, 在ES- 2 细胞中的表达量次之; miR- 21 在6 种肿瘤细胞中的表达水 平均较高, 与芯片检测结果基本一致( 图1) 。
总RNA 中miRNA 所占的比例极少( 约为0.01%) [11], 为了验证芯 片检测结果是否可以反映miRNA 在总RNA 中的量, 我们用RT- PCR 的方 法对芯片检测结果进行了验证。实验结果表明微阵列和PCR 方法检测的 miRNA 的表达基本一致, 但也有些差异。用RT- PCR 方法检测到K562 细胞中miR- 17- 5p 的高表达,而在微阵列中却显示其在K562 细胞中表达 水平较低。这可能是由于: ①K562 细胞中的前体miRNA 和成熟miRNA 表达量都非常高, 虽然标记反应没有对pre- miRNA 进行荧光标记, 但在杂 交过程中大量的pre- miRNA 仍可能和相对较少的成熟miRNA 竞争, 影响 了荧光标记的成熟miRNA 与探针的结合, 掩盖了K562中miR- 17- 5p 信 号; ②或是实验过程中的系统误差, 这种情况在普通的生物芯片技术中也 存在。因此, 除了要在芯片实验过程中尽量减少人为干扰, 进一步改进实 验技术减少系统误差外, 在对某一miRNA 进行深入研究之前, 用其他方法 确定基因芯片结果是有必要的。本实验方法具有快速、平行、高通量的 特点。通过监控细胞miRNA 的表达, 可以帮助我们更好地了解这类小核 酸分子的功能及作用机制。miRNA 表达的比较性研究将可能发现新的诊 断性标志分子或治疗性靶分子。
图 一
3 讨论
microRNA 是一类在线虫、植物、昆虫和哺乳动物中存在的小 RNA 分子, 它们通过与靶mRNA 的3' 非翻译区( 3' - UTR) 互补, 将 mRNA 剪切或是抑制其翻译。已很明确, miRNA 在调控基因表达过程 中发挥非常重要的作用, 而理解miRNA 在生物体内如何发挥作用的关 键是要知道miRNA 的表达模式。但是因为miRNA 的长度非常短( 只 有18- 26 nt) , 检测miRNA 的方法受到很大的限制。我们利用生物芯 片的高通量、高敏感性的特点, 为在组织和细胞中检测多种miRNA 提 供了理想的手段。
1 材料和方法
1.1 材料
实验所用6 种人类肿瘤细胞系均为本实验室保存, 分别HeLa( 人 宫颈癌上皮细胞) 、K562( 人慢性髓细胞性白血病细胞) 、ES- 2( 人 卵巢透明细胞癌) 、MCF- 7( 人乳腺癌细胞) 、HT- 29( 人结肠腺癌 细胞) 和A549 细胞( 人肺腺癌细胞) 。所有细胞系均在5% CO2 条 件下, 用含有10%胎牛血清的适合培养基培养。
生物芯片检测细胞中microRNA 的表达
MicroRNA Expression in Cells Detected by Oligonucleotide Microarray
07生技1
microRNA(miRNA) 是一类在线虫、植物、昆虫和哺乳动物中存在的 小RNA 分子, 长度为18- 26 个核苷酸( nt) 的小非编码RNA，类似于siRNA 的分子 。
miRNA 通过调节基因表达, 参与调控细胞的众多生物学功能, 如生 物发育、脂肪代谢, 及细胞的分化、增殖和凋亡等。它们通过与靶mRNA 的3' 非翻译区( 3' - UTR) 互补, 将mRNA 剪切或是抑制其翻译。 人类基因组中已发现300 多种miRNA, 而且预测实际数目会更多, 它们可能 会对人类基因组中近30%的基因发挥调控作用。但关于miRNA 的表达模式、生 物学功能、作用机制等, 目前的认识还不很清楚。在此, 我们设计并制备了 miRNA 表达谱的寡核苷酸芯片, 利用其快速、平行、高通量的检测特点, 分析 了6 种不同细胞系中206 个miRNA 的表达水平特点, 为miRNA 的进一步研究奠 定了基础。
1.3 miRNA 的准备、标记与杂交
依mirVanaTM miRNA Isolation Kit(Ambion) 说明书提取肿瘤 细胞的富集miRNA。用Universal Microplate Spectrophotometer(Bio- tek) 紫外分析仪测定miRNA 浓度和纯度, 8 mol /L 尿素变性的15%聚丙烯酰胺凝胶检测质量。依 mirVanaTMmiRNALabeling Kit(Ambion) 说明书对富集miRNA 进 行荧光标记, 方法简单描述如下: 先在miRNA 末端添加20- 50 个经 过氨基修饰的核苷酸尾, 然后与带有N- 羟基琥珀酰亚胺酯类 (Nhydroxysuccinimidylester, NHS- ester) 的荧光染料Cy3 (Amersham Biosciences)反应。标记后的样本与3×miRNA Hybridization Buffer(Ambion) 混合并将其均匀铺于miRNA 寡核 苷酸芯片表面, 小心加盖玻片封片, 置于密封湿润的杂交仓中, 42℃ 杂交16 h。最后进行杂交后清洗。
2 结果
2.1 miRNA 的抽提和纯化
6 种细胞系富集miRNA 的D260nm/D280nm 值均为1.8～2.1, 符合miRNA 芯片的检测要求。
2.2 芯片杂交结果
标记、纯化后的miRNA 与芯片杂交, 用扫描仪在543 nm 通道处 对芯片进行扫描, 得到图像, 用Scanarray3.0 软件分析miRNA在6 种 细胞中的表达水平。经比较发现, 91 个miRNA 在6 种细胞间没有明显 差异, 115 个miRNA 存在差异。miR- 21 在6 种细胞中校正信号强度/ 背景强度均大于2 倍, 表达水平均较高;miR- 17- 5p 和miR- 20a 在6 种细胞中的表达情况相似, 在ES- 2细胞中校正信号强度/背景强度大于 10 倍, 表达较高; miR- 126与miR- 128a 和miR- 151, miR- 145 与 miR- 297- 1 在HeLa 和MCF- 7 细胞中的表达水平类似。见表2。
1.4 芯片图像的采集与数据处理
采用ScanArrayTM Express1.0 ( Perkin Elmer) 扫描 仪进行扫描, 扫描强度为100%, 光电倍增管增益为80%, 扫描精度为10μm。扫描所得图ScanArray3.0( Perkin Elmer) 软件进行处理, 得到杂交信号和与之相应背景的 平均强度值, 从杂交信号值中减去背景值得到校正信号强 度值。6 种细胞检测所得数据经阳性对照均衡后比较。 判断表达存在差异的标准是: ①相互比较的miRNA 信号 荧光强度值相差至少大于1 000; ②若其中有信号强度值 小于100, 则同一种miRNA 在不同细胞的荧光值差异需 大于500。数据经总体归一化和对数转化后, Cluster3.0( Stanford University) 进行聚类分析。
1.5 RT- PCR 验证miRNA
分别取6 种细胞总RNA 各5 μg, 用与miR- 17- 5p、 miR- 21前体互补的特异性引物和逆转录酶 SuperscriptⅢ ( Invitrogen) 进行逆转录反应, 分别 取1 μL 逆转录产物进行PCR 反应中的miRNA 序列 设计特异性引物,有关参数见表1。用15%非变性聚 丙烯酰胺凝胶验证扩增产物大小; 用LabWorks4.0 ImageAcquisition and Analysis 软件进行定量及 数据处理。取PCR 产物连入pGEM- T- easy 载体 ( Promega) ,送交测序, 测序结果与提供的miRNA 序列一致。