转录因子Cdx1在大鼠胚胎肛门直肠发育过程中的时空表达

转录因子Cdx1在大鼠胚胎肛门直肠发育过程中的时空表达张涛;程树杰;张胜逆;李靖华;杨季红;商琰红;王晓春;李鹏;游冀鹏;张爱民
【摘要】目的：探讨Cdx1在大鼠胚胎肛门直肠发育过程中所发挥的作用。

方法应用乙烯硫脲（ ethylenethio－urea，ETU）致畸Wistar孕鼠24只肛门直肠畸形动物模型，免疫组织化学染色、RT－PCR和western blot 方法分别研究Cdx1 mRNA和Cdx1蛋白在正常和畸形大鼠胚胎泄殖腔及肛门直肠的表达。

结果 Cdx1在大鼠发育过程中正常胚胎泄殖腔中表达，在第13天和第14天主要表达于尿直肠隔和泄殖腔膜，胚胎第15天时在尿直肠隔与泄殖腔膜融合处Cdx1表达较强，第16天时肛膜破裂，肛门直肠与外界相通，Cdx1在直肠黏膜层表达。

Cdx1在ARM胎鼠泄殖腔和直肠黏膜层表达较弱或呈现阴性表达。

Western blot 和 RT－PCR 半定量检测结果：在发育期的后肠中Cdx1和Cdx1 mRNA的表达表现出时间依赖性的特点：在肛门形成的关键时期Cdx1的表达水平达到高峰，一旦肛门形成其表达量随即开始降低，畸形组与正常组相比较， Cdx1蛋白半定量分析结果156å．9±23．5 vs．102．7±14．4（第14天），165．5±26．2 vs．104．5±14．6（第14．5天），153．6±19．4 vs．76．2±10．7（第15天）。

Cdx1 mRNA的表达在第14～15天明显降低差异有统计学意义（ P ＜0．05）。

结论 ETU致畸的大鼠胚胎ARM肛门直肠发育过程中Cdx1／Tcf4的表达存在着时间－空间不均衡性的特点。

ETU致畸的大鼠胚胎期泄殖腔／后肠Cdx1／Tcf4表达模式的改变可能引起ARM的发生，Cdx1／Tcf4表达下调可能与ARM的发生有关。

%Objective To investigate the effect of caudal type homeobox gene-1 ( Cdx1 ) during anorectal development in normal and anorectal malformations ( ARM) embryos of rats ,and to explore its role in pathogenesis of ARM . Methods The anorectal malformation animal
models were induced by ethylenethiourea ( ETU) in 24 pregnant Wistar rats , then the expression levels of Cdx 1 mRNA and Cdx1protein were detected by immunohistostaining , RT-PCR and Western Blotting in cloaca,anus,rectum of embryos of normal rats and ARM rats .Results The expression of Cdx1was found in cloaca of normal embryos,which was mainly located in dorsal urorectal septum (URS),cloacal membrane (CM) and hindgut on day 13,day 14,and the expression levels were higher in the fusion area of URS and CM on day 15,the expression of Cdx1was found in mucous membrane layer of rectum on day 16.The expression levels of Cdx1in cloaca and mucous membrane layer of rectum of ARM rat embryos were lower .The results of Western Blot and RT-PCR showed that the expression levels of Cdx 1 and Cdx1 mRNA in hindgut were time-dependent,which reached peak during anus forming ,as soon as the process was completed,the expression levels were decreased immediately .The expression levels of Cdx 1 protein in abnormality group and normal group were 156.9 ±23.5 vs 102.7 ±14.4,on day 14,165.5 ±26.2 vs 104.5 ±14.6,on day 14.5,153.6 ±19.4 vs 76.2 ±10.7, on day 15 .There was a statistical significance in the decrease of expression levels of Cdx 1 mRNA during 14~15 days ( P <0.05 ).Conclusion The spatiotemporal malconformation of expression of Cdx 1/Tcf4 exists in the process of anorectal development of ARM rat embryos induced by ETU .The changes of expression mode of Cdx 1/Tcf4 in cloaca and hindgut of ARM rat embryos induced by ETU may cause the pathogenesis of ARM , moreover , down-regulation of Cdx 1/Tcf4 may be correlated to pathogenesis of ARM .
【期刊名称】《河北医药》
【年(卷),期】2014(000)024
【总页数】4页(P3689-3692)
【关键词】肛门直肠畸形;Cdx1;胚胎发育;大鼠
【作者】张涛;程树杰;张胜逆;李靖华;杨季红;商琰红;王晓春;李鹏;游冀鹏;张爱民【作者单位】071000 河北省保定市，河北大学附属医院普外科;071000 河北省保定市，河北大学附属医院普外科;071000 河北省保定市，河北大学附属医院皮肤科;071000 河北省保定市，河北大学附属医院普外科;071000 河北省保定市，河北大学附属医院普外科;071000 河北省保定市，河北大学附属医院肿瘤内
科;071000 河北省保定市，河北大学附属医院肿瘤外科;071000 河北省保定市，河北大学附属医院超声科;071000 河北省保定市，河北大学附属医院急诊外科;071000 河北省保定市，河北大学附属医院普外科
【正文语种】中文
【中图分类】R322.4
肛门直肠畸形(ARM)是常见的小儿消化道畸形之一，严重影响患儿的生活质量［1－3］。

ARM的预防和治疗的关键在于明确该畸形的基因调控和胚胎发生机制，普遍研究认为ARM是一组受多因素影响的，涉及多个基因的复杂畸形。

最近国外学者在大鼠胚胎发育研究中发现Cdx1在哺乳动物尾端发育中起到了重要的作用，尤其是对于后肠的发育特别关键［4］。

采用人类全基因组表达谱芯片技术对比分析正常和ARM患者直肠末端组织基因表达谱系的变化，结果显示有多个涉及
Cdx1在高位ARM与正常人直肠末端组织中呈现差异表达［5］。

据此我们推断Cdx1可能在泄殖腔和直肠的发育中起重要作用，与ARM的发生相关。

而在胚胎期肛门直肠发育中Cdx1的时空分布模式仍不明确，Cdx1在ARM的发生过程中
如何发挥的作用仍未得到满意的解释。

因此，本研究应用乙烯硫脲(ethylenethiourea，ETU)致畸的Wistar大鼠的ARM 动物模型，分析Cdx1蛋白和mRNA在正常及ARM大鼠胚胎肛门直肠的时空分布规律，探讨Cdx1在大鼠
胚胎肛门直肠发育过程中所发挥的作用;研究Cdx1/Tcf4与ARM胚胎发生机制的
关系。

1 材料与方法
1.1 材料动物:体重250～300 g的Wistar大白鼠(购自中国医科大学动物实验中
心并饲养，CMU-WR-102)，雌雄午夜合笼后次晨雌鼠阴道涂片，显微镜下见到
精子即确认已交配，此日计妊娠第0天。

ETU组:24只大鼠于妊娠第10天经胃管注入125 mg/kg的ETU。

正常组:12只大鼠于妊娠第10天经胃管注入等量的0.9%氯化钠溶液。

2组孕鼠分别做以下处理:分别于妊娠第13～16天，18天，21天正常组各取2只，ETU组各取4只孕鼠行剖宫术，取出所有胎鼠。

将30%第16天
之前的整个胚胎和第16天以后的胚胎躯干的尾部置入4%多聚甲醛磷酸缓冲液中
固定，常规脱水，石蜡包埋，进行矢状面连续切片，厚4 μm。

余下胎鼠置于液氮15～20 min后转移至－80℃冰箱保存，以备显微切割提取组织蛋白和mRNA。

1.2 方法
1.2.1 免疫组化染色:胎鼠正中矢状面连续切片，Cdx1免疫组化染色。

连续动态对比观察Cdx1在正常和畸形大鼠胚胎泄殖腔及肛门直肠发育过程中的表达。

免疫组化染色具体步骤:一抗为1∶200山羊抗大鼠Cdx1抗体(Santa Cruz公司，美国)，4℃孵育12 h。

二抗采用福州迈新公司S-P试剂盒，DAB显色经苏木素复染，脱水、透明后封片。

Cdx1免疫组织化学染色见胞核呈棕黄色为阳性，该细胞为阳性
细胞。

每次染色均设阴性和阳性对照。

采用 NIS－Elements Basic Research多媒体彩色病理图像分析系统对 Cdxl表达进行定位观察分析，每张切片分别观察100倍、200倍及400倍视野图像，来判定阳性细胞的分布区域及大体变化趋势。

1.2.2 Western-blot检测组织中的蛋白质表达量:①常规制备三组胎鼠冰冻切片，解剖显微镜下手工显微切割方法准确切取泄殖腔标本。

组织总蛋白提取:组织经破碎，组织匀浆低温离心，应用南京凯基全蛋白提取试剂盒提取总蛋白。

其含量按改良Lowry法测定，于－20℃冻存备测。

②Western blot杂交:取总蛋白40 μl，经6%SDS－PAGE电泳后转移至硝酸纤维膜(Invitrogen公司)上，5%牛血清白蛋白封闭抗原后，加入山羊抗大鼠Cdx1抗体(1∶200稀释)和β-actin抗体(1∶5 000 稀释，Sigma公司)，4℃孵育12 h。

洗膜后，加碱性磷酸酶标记的兔抗山羊
IgG(工作浓度1∶2 000，Santa Cruz公司)进行二抗杂交、显色。

结果采用GIS－2020凝胶图象分析系统扫描分析结果，对蛋白质含量进行密度分析，以相对灰度值代表蛋白表达量。

1.2.3 RT-PCR方法:常规制备2组胎鼠冰冻切片，解剖显微镜下手工显微切割方法准确切取泄殖腔标本。

RT-PCR方法具体步骤:Trizol提取组织总RNA，计算RNA 纯度。

逆转录合成 cDNA反应体积为20 μl，具体步骤参照逆转录试剂盒(TaKaRa 公司)推荐方法。

利用Primer5.0版软件设计引物(上海 Invitrogen生物技术有限公司):F-5’-TGTGGTGAGCCTGTTGGA-3’;R-5’-CCCTCTGAATCTTGGGAAAT-3’(116bp)，扩增片断长度116bp。

内参照选用β-actin，扩增片断长度690 bp。

PCR扩增反应总体积为25 μl。

反应条件:95℃预变性 2 min，94℃ 40 s，52.4℃ 40 s，72℃ 40 s，35个循环，72℃延伸 7 min。

PCR 产物于3%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙啶染色，紫外灯下观察，以Marker DL2000为分子量标准。

用G:BOX SYNGENE凝胶分析系统分析扩增产物。

1.3 统计学分析应用SPSS 13.0统计软件，计量资料以±s表示，采用t检验，P
＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果
2.1 大体观察结果正常组共产胎仔186只，未见畸形发生。

ETU组共产胎仔212只，均为无尾或短尾，根据切片观察后分为给药无畸形组(n=65)和畸形组(n=139)。

ARM在 ETU组中的发生率为65.7%(139/204)。

胎龄第16～21天胎鼠中的无肛畸形均为直肠尿道瘘和泄殖腔畸形。

2.2 免疫组化结果
2.2.1 正常组:第13天时，大量的Cdx1阳性细胞分布于尿直肠隔、后肠和泄殖腔
膜的上皮层，在泄殖腔膜的外层细胞内也可见一定量的阳性细胞分布(图1A、a)。

第13.5天时，阳性细胞集中分布于背侧尿直肠隔和后肠的上皮。

第14天时，阳
性细胞主要出现在尿直肠隔与泄殖腔膜的接近融合区域，同时，直肠肛管末端与尾沟的组织内也可见大量的阳性细胞。

并且，免疫反应的强度几乎达到顶峰(图2 A、a)。

第15天，大量的阳性细胞聚集于尿直肠隔与泄殖腔膜的融合区域的上皮;免疫反应强的阳性细胞在菲薄的肛膜上也出现。

第16天，肛膜破裂，肛门直肠与外界相通，Cdx1在直肠黏膜层表达。

2.2.2 肛门直肠畸形组:第13天，Cdx1表达于尿直肠隔和后肠上皮中，强度较弱，在泄殖腔膜上皮仅在外层细胞中见到零星的阳性细胞分布(图1B、b)。

第1
3.5天，极少量的阳性细胞在泄殖腔膜、尿直肠隔顶端以及后肠上皮。

第14天，阳性细胞散在分布在瘘管和后肠的上皮中(图2 B、b)。

第15天，直肠尿道瘘清晰可见，Cdx1在瘘管和后肠上皮中表达极弱。

第16天，阳性细胞散在出现在瘘管和直肠
肛管上皮中。

与正常组相比，给药无畸形组在各胎龄均差异无统计学意义(P ＞
0.05)。

2.3 Western-blot检测Cdx1的表达 Western蛋白印迹结果显示，与正常组相比
较，Cdx1的表达在ARM组中表现出相对的时间不均衡性。

在肛门形成的关键时期即第14天、14.5天和15天，于正常组Cdx1的表达量达到顶峰而在ARM组表达量明显下降(156.9±23.5 vs.102.7 ± 14.4(第 14 天)，165.5 ± 26.2 vs.104.5 ±14.6(第 14.5 天)，153.6 ± 19.4 vs.76.2 ±10.7(第15天)(P ＜0.05);自第16天起，在正常组和ARM组均可见Cdx1的表达开始减弱。

见表1。

表1 Cdx1蛋白的相对表达量在正常组及ARM组的比较情况±s组别13 d 13.5 d 14 d 14.5 d 15 d 16 d正常组72.5 ±10.8 134.9 ±20.3 156.9 ±23.5 165.5
±26.2153.6 ±19.4 105.3 ±10.4 ARM 组56.3 ±7.8 72.5 ±10.1 102.7 ±14.4 104.5 ±14.6 76.2 ±10.7 69.5 ±7.8 P组0.032 0.018 0.017 0.024 0.032 0.019 2.4 RT-PCR结果在正常组和畸形组大鼠胚胎中均能检测出Cdx1 mRNA表达。

在正常组胎龄第14～15天为表达高峰期。

畸形组与正常组相比较，Cdx1 mRNA 的表达在第13～16天明显降低［0.52±0.08 vs.0.38 ± 0.04(第 14 天)，0.49 ± 0.06 vs.0.37 ±0.08(第15 天)］，差异有统计学意义(P ＜0.05)。

肛门与外界相通后，即从GD16后Cdx1 mRNA表达量逐渐降低，正常组和ARM组在胎龄第18天和20天比较无明显差异(P ＞0.05)。

见表2。

表2 Cdx1 mRNA的相对表达量在正常组及ARM组的比较±s组别13 d 13.5 d 14 d 14.5 d 15 d 16 d正常组0.27 ±0.03 0.36 ±0.03 0.52 ±0.08 0.49 ±0.06 0.47 ±0.05 0.36 ±0.04 ARM 组0.18 ±0.01 0.27 ±0.06 0.38 ±0.04 0.37 ±0.08 0.36 ±0.03 0.26 ±0.07 P值0.023 0.021 0.016 0.022 0.047 0.035
图1 Cdx1在第13天正常组和ARM大鼠胚胎泄殖腔的表达(A、B×100;a、b
×400)A、a为正常组、B、b为 ARM组 H:后肠;URS:尿直肠隔;U:尿生殖窦;CL:泄殖腔;CM:泄殖腔膜;TG:尾肠;橙色箭头:阳性细胞
图2 Cdx1在14d正常组和ARM大鼠胚胎泄殖腔的表达(A＆B×100;a＆
b×400)A＆a为正常组，B＆b为ARM组H:后肠;URS:尿直肠隔;U:尿道;CL:泄殖
腔;CM:泄殖腔膜;F:瘘管
3 讨论
ARM的预防和治疗的关键在于明确该畸形的基因调控和胚胎发生机制。

普遍研究认为，ARM的发生是遗传因素和环境因素共同作用的结果。

流行病学和动物实验表明遗传因素在其发病过程中发挥重要作用［6］，ARM是一组受多因素影响的，涉及多个基因的复杂畸形。

目前国内外对该畸形的实验研究多采用动物模型，应用ETU、维甲酸等致畸大鼠产生ARM，观察其胚胎发生的病理改变和基因表达规律
及模式。

最近有学者在应用基因敲除制备ARM小鼠模型中发现Shh 信号通路［7－9］、Fgf10［8］、Bmp4［9］、EphB2［10］可能参与了ARM的发，但在
错综复杂的调控网络中，上述基因又不同程度的与Cdx1通过不同信号分子间的通路存在相互作用，触发了调节细胞生长、迁移、分化及发育等多方面的复杂信号级联反应。

在消化道形成过程中，众多基因参与其中，其中大多数基因在发育过程中具有高度保守-同源盒基因［11］。

同源异型框基因及相关蛋白以核转录调节因子的形式调节生物结构及细胞分化，在生物体的不断演化过程中，决定着生物体正常结构并始终保持相对的保守性。

Cdx1为果蝇同源异型盒基因(homeobox gene)的同源体，编码转录因子，可控制胚胎细胞的发育和分化［12］。

在小鼠胚胎的研究中发现，至 GD8.5，Cdx1 mRNA最初表达于发育中肠管的内胚层细胞中［13］，该基因
大部分表达限定在消化道上皮，起始于十二指肠，遍布于小肠和大肠，可提供上皮细胞沿消化道前后轴的位置信息，且在直肠区域表达至最高峰［14］;对消化道上
皮细胞的增殖与分化起调控作用。

上述结果提示在胚胎肛门直肠发育过程中，
Cdx1发挥了重要的作用。

在本研究中，我们采用免疫组化染色、Western blot和RT-PCR技术分析Cdx1
在正常和畸形大鼠胚胎发育中的时空表达模式。

本研究中显示，在正常组，Cdx1
的表达有着严格的时间依赖性规律，在GD14、GD14.5和 GD15，Cdx1的表达
处于最高水平，一旦肛门形成与外界相通，其表达水平即开始逐步下降;然而在畸
形组中Cdx1的表达水平较正常组明显减低且缺乏动态变化。

Cdx1在蛋白水平和mRNA水平统计分析，发现在肛门形成的关键时期，即胎龄第14天、14.5天和
第15天时在正常组二者的表达达到最高水平，然而在同时期的ARM组表达显著
的降低，这不仅说明Cdx1在正常的肛门直肠发育中发挥重要作用，在ARM的形成过程中可能也起到了关键的作用。

综上，我们认为，胎龄第14天、14.5和15
天是Cdx1在胚胎泄殖腔发育中的最佳转录时间，而在此关键时期特异性的Cdx1表达下调会干扰肛门直肠的正常发育，影响靶基因在此区域的转录和翻译，可能使尿直肠隔尾端细胞增殖和迁移受阻，尿直肠隔和泄殖腔膜的融合障碍，产生ARM。

因此我们推测，在肛门直肠的发育过程中，Cdx1不仅对正常的发育有调控作用，并且胚胎时期的Cdx1表达水平的减低可能与ARM的发生相关。

本研究通过免疫组织化学方法发现正常胎鼠和ETU致ARM胎鼠泄殖腔和直肠
Cdx1的表达呈现出空间依赖性的特点:在正常组，Cdx1主要集中表达于尿直肠隔尖端上皮、后肠背侧、泄殖腔膜融合区等和尿直肠隔与泄殖腔融合作用相关的区域。

GD16时肛膜破裂，肛门直肠形成，Cdx1在直肠黏膜层表达。

而在畸形组中，在上述区域中仅有零星的阳性细胞出现。

据此我们推测肛门直肠发育过程中的形态的变化是依赖Cdx1精准的空间定位表达的。

Cdx1在ARM胎鼠泄殖腔和直肠黏膜
亦有表达，但表达强度较正常组明显减低，从而影响了泄殖腔/后肠区域在特定时
间内的细胞增殖、转化和细胞凋亡，会干扰肛门直肠的正常发育，影响靶基因在此区域的转录和翻译，可能使尿直肠隔尾端细胞增殖和迁移受阻，尿直肠隔和泄殖腔膜的融合障碍，产生ARM。

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