植物源抗病毒剂丁香酚抗烟草花叶病毒病的机理

植物源抗病毒剂丁香酚抗烟草花叶病毒病的机理
黄晓芳;苏杭;王春梅;陈浩;石志琦
【摘要】丁香酚是最新发现的一种植物源抗病毒剂.为了研究丁香酚对由烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)引起的烟草花叶病毒病的抗性机理,进行了烟草室内盆栽药效试验,并检测了丁香酚对TMV复制的影响,以及丁香酚对烟草叶片中水杨酸抗病信号通路的影响.结果显示:(1)400μg/ml丁香酚对烟草花叶病毒病的预防和治疗效果较好,防效分别为65.82％和62.14％;(2)丁香酚处理显著抑制了TMV 复制关键因子核酸复制酶(RdRp)和外壳蛋白(CP)基因的表达;(3)丁香酚能够促进烟草叶片内“氧爆”现象,即活性氧(O2ˉ和H2O2)的大量积累;(4)丁香酚处理促进了水杨酸的积累以及水杨酸信号通路中关键基因NPRI的表达.表明,丁香酚可能通过激活水杨酸途径诱导了烟草的系统抗性,进而抑制了TMV的复制和增殖.
【期刊名称】《江苏农业学报》
【年(卷),期】2013(029)004
【总页数】6页(P749-754)
【关键词】丁香酚;烟草花叶病毒;水杨酸;系统获得抗性
【作者】黄晓芳;苏杭;王春梅;陈浩;石志琦
【作者单位】南京师范大学生命科学学院,江苏南京210046;江苏省农业科学院食品质量安全与检测研究所,江苏南京210014;江苏省农业科学院食品质量安全与检测研究所,江苏南京210014;江苏省农业科学院食品质量安全与检测研究所,江苏南京210014;江苏省农业科学院食品质量安全与检测研究所,江苏南京210014;江苏省农业科学院食品质量安全与检测研究所,江苏南京210014
【正文语种】中文
【中图分类】S634.3
植物病毒病是危害农业生产的重要病害之一，仅烟草花叶病毒引起的花叶病毒病就造成全世界每年超过1×108美元的损失。

长期使用化学药剂易造成环境污染及抗药性等问题，而植物源的抗病毒剂具有环境友好、低毒低残留等优点，已逐渐成为研制新型抗病毒药剂的重要方向［1-3］。

随着人们对药剂抗病毒机理的深入研究，发现抗病毒机理主要包括抑制病毒侵染、增殖和诱导寄主产生抗病性［4］。

同时许多研究表明，抗病毒剂的抗病毒活性可能是多种机制共同作用的结果［5-6］。

丁香酚(C10H12O2)是一种植物源天然化合物，无色或苍黄色液体，有强烈的丁香香气，具有抗菌消炎、解热麻醉、防腐、驱蚊等作用。

前人对丁香酚的研究多集中在药理学和抗真菌、细菌方面［7-8］。

江苏省农业科学院产地环境与投入品安全研究室于国内外首次发现丁香酚制剂在田间具有较好的抗植物病毒病活性［9］，对烟草花叶病毒增殖有一定的抑制作用［10］，能够激发植物防御酶活性［11］等。

为进一步验证丁香酚对烟草病毒抗性的诱导，本研究拟通过水杨酸信号途径来探讨丁香酚对烟草抗烟草花叶病毒病的作用机理。

1 材料与方法
1.1 试验材料
烟草NC89，购于中国农业科学院烟草研究所(青岛)。

烟草花叶病毒由河南农业大学植物保护学院提供。

供试药剂:20%丁香酚水乳剂，由江苏省农业科学院产地环
境与投入品安全研究室提供;20% 吗胍·铜可湿性粉剂，购自山东神星药剂有限公司;99%丁香酚原药，购自Sigma公司;氯化硝基四氮唑兰(简称NBT，纯度＞
98.0%)，购自北京莱特生物有限公司;二氨基联苯胺(简称DAB，纯度＞97%)，购
自上海宝曼生物有限公司;总RNA提取试剂Trizol，购自美国Invitrogen公司。

1.2 试验方法
1.2.1 丁香酚对烟草花叶病毒病室内药效试验预防试验:选取长势一致，5～6叶龄
的健康烟草植株，分别以200 μg/ml、400 μg/ml、600 μg/ml丁香酚喷施整株
叶片，20%吗胍·铜可湿性粉剂600 g/hm2为阳性对照，同时设清水对照(CK)，
施药24 h后，于烟草倒5叶、倒6叶接种TMV病毒，每个处理10株，重复3次;治疗试验:选取长势一致，5～6叶龄的健康植株，于烟草倒5叶、倒6叶接种TMV病毒，接种后24 h后喷施药剂，处理药剂种类浓度与预防试验一致。

待发
病后调查各处理病情指数，计算防效。

病情分级依照中华人民共和国烟草行业标准(YC/T39—1996)［12］进行。

1.2.2 超氧阴离子(O2·-)原位检测及含量测定试验设4个处理:接种 TMV、丁香酚(400 μg/ml)、丁香酚+TMV(喷施400 μg/ml丁香酚24 h后接种TMV)、清水对照(CK)。

每个处理5株，重复3次。

超氧阴离子染色参照 Orozco-Cardens等［13］方法。

处理 12 h后，取倒 2叶片，将叶柄浸入 6 mmol/L NBT柠檬酸缓冲液(pH 6.0)中约8 h以上，25℃、光照。

95%乙醇水浴5 min脱色，保存于95%乙醇中拍照记录。

超氧阴离子含量测定采用抑制与产生超氧阴离子自由基试剂盒(购自南京建成生物
工程研究所)。

处理3 h和12 h后分别取倒2叶片进行超氧阴离子含量测定。

1.2.3 过氧化氢(H2O2)原位检测及含量测定试验处理及染色方法同方法1.2.2。

过氧化氢含量测定参照Jana等［14］方法略加修改。

处理3 h和12 h后分别称取
烟草倒2叶片0.1 g，加入1.5 ml磷酸缓冲液(50 mmol/L，pH 6.5)，研磨成浆，10000 g离心10 min，收集上清液。

取0.5 ml上清液加入1.5 ml 20%硫酸(含
0.1%氯化钛)混匀。

10000 g离心10 min，上清液在410 nm处测定吸光值。

1.2.4 水杨酸(SA)含量测定试验处理同方法1.2.2。

水杨酸含量测定采用植物水杨
酸(SA)酶联免疫试剂盒法(试剂盒购自上海卓越生物科技公司)。

分别于处理 6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、96 h后称取烟草倒2叶片1.0 g，加入0.1 mol/L pH 7.4磷酸缓冲液10 ml，冰浴研磨成浆，3000 r/min离心10 min，取上清，保存于超低温冰箱待测。

1.2.5 RT-PCR检测相关基因表达情况
1.2.5.1 NPR1基因试验处理同方法1.2.2。

处理12 h后取烟草倒2叶片液氮保存、待测。

1.2.5.2 烟草花叶病毒外壳蛋白基因(CP)和RNA复制酶基因(RdRp) 试验设3个处理，清水对照(CK)、接种 TMV、丁香酚+TMV(喷施400 μg/ml丁香酚24 h后接种TMV)。

处理96 h后取倒2叶片液氮保存、待测。

用Trizol法［15］提取得到叶片总 RNA，用 cDNA第一条链合成试剂盒(购自TaKaRa公司)反转录合成cDNA。

以管家基因Actin为内参基因，对各基因表达
情况进行PCR检测。

引物由英骏生物科技公司合成，序列见表1。

PCR反应程序为:94℃预变性5 min;94℃变性30 s，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，30个循环;72℃延伸10 min。

扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。

表1 PCR扩增所用引物序列Table 1 Primers sequences for PCR引物序列(5'-
3')Actin-F TCGCCTTGTGGAAGTTTGAGAC Actin-R CACCAACAGCAACAGTTTGACG NPR1-F GAAAGAGCCTAAAATTGTAGTGTC NPR1-R CTATTCCTAAAAGGGAGCTTATT TMV-CP-F CAGTTCGTGTTCTTGTCATC TMV-CP-R CCGATTATAAGATCCGGTTC TMV-RdRp-F CGCACCCGAGTTGTCTGGCA TMV-RdRp-R GCTCGCTAAACAACGGGCCG
1.2.6 数据统计分析运用SPSS 12.0数据处理系统，采用Duncan’s新复极差法
(DMRT)进行差异显著性分析。

2 结果
2.1 丁香酚对烟草花叶病毒病药效试验
从表 2 可见，400 μg/ml和600 μg/ml丁香酚对烟草花叶病毒病具有较好的防治效果，预防作用大于治疗作用，且显著优于20%吗胍·铜可湿性粉剂的防效。

以田间实际用药为依据，选取400 μg/ml丁香酚作为以下试验的药剂浓度。

表2 丁香酚对烟草花叶病毒病室内盆栽药效试验Table 2 Efficacy of eugenol on tobacco mosaic virus disease in pot experiment同列中不同小写字母表示处理间差异显著(P＜0.05)。

预防试验治疗试验处理病情指数防效(%)治疗指数防效(%)200 μg/ml丁香酚21.51 51.15b 19.03 56.78a 400 μg/ml丁香酚 15.05 65.82a 16.67 62.14a 600 μg/ml丁香酚 13.89 68.45a 16.05 63.55a 20%吗胍·铜可湿性粉剂 19.80 55.03b 26.77 39.20b清水对照 44.03 44.03
2.2 丁香酚对烟草花叶病毒外壳蛋白基因(CP)和RNA复制酶基因(RdRp)表达的影响
CP基因编码的外壳蛋白不仅能够保护病毒基因组，而且与病毒在寄主体内细胞间转移有关。

RdRp基因的编码产物是TMV复制不可缺少的酶。

因此研究CP和RdRp基因表达有很重要的作用。

如图1所示，TMV处理组CP和RdRp两种基因表达量很高，而丁香酚+TMV处理对两种基因表达有不同程度的抑制作用。

这可能是由于丁香酚诱导了烟草抗病性，使得两种基因的表达受到抑制。

图1 TMVCP基因和RdRp基因的表达Fig.1 Expression of TMVCP and RdRp genes by RT-PCR
2.3 丁香酚对烟草叶片超氧阴离子(O2·-)产生的影响
通过超氧阴离子原位检测来反映其在叶片中产生及分布情况，染色越深表明超氧阴离子产生量越大。

图2显示，接种TMV处理比清水、丁香酚、丁香酚+TMV处
理产生的超氧阴离子多，丁香酚处理产生的超氧阴离子最少，丁香酚+TMV次之。

TMV侵染造成超氧阴离子的大量产生，是植物抵抗外来病原侵染的正常应激反应。

丁香酚+TMV染色较清水产生的超氧阴离子少，这可能与丁香酚抗氧化功能有关。

丁香酚的抗氧化功能能够清除部分超氧阴离子，从而减少因病毒侵染带来的伤害。

测定烟草叶片产生超氧阴离子量的情况，进一步探讨超氧阴离子响应时间及响应量的差异。

图3显示，处理3 h后各处理之间超氧阴离子含量没有显著变化;处理12 h各处理之间超氧阴离子含量差异明显，TMV、丁香酚+TMV处理超氧阴离子含
量显著高于清水对照，TMV、丁香酚+TMV处理超氧阴离子含量显著高于丁香酚
处理，丁香酚处理超氧阴离子含量显著低于清水对照。

测定结果与染色试验结果基本吻合。

2.4 丁香酚对烟草叶片过氧化氢(H2O2)产生的影响
通过过氧化氢原位检测反映其在叶片中产生及分布情况，染色越深表明过氧化氢产生量越大。

图4显示，烟草叶片过氧化氢染色由深到浅依次为:丁香酚+TMV、TMV、丁香酚、清水对照。

丁香酚和TMV处理后烟草叶片过氧化氢染色情况表明非生物因素和生物因素均能够诱导大量的过氧化氢产生，丁香酚+TMV处理表明
在生物因素和非生物因素双重因子诱导下产生的过氧化氢比单一因子产生的多，两者可能有协同增效的作用。

图2 烟草叶片超氧阴离子染色情况Fig.2 Detection ofin tobacco leaves by dyingA:清水对照;B:接种TMV;C:丁香酚;D:丁香酚+TMV。

图3 处理3 h和12 h后烟草叶片超氧阴离子含量Fig.3 Contents of in tobacco leaves at 3 h and 12 h after varieties of treatments不同小写字母表示同一处
理时间下不同处理间差异显著(P＜0.05)。

图4 烟草叶片过氧化氢染色情况Fig.4 Detection of H2O2in tobacco leaves by dyingA:清水对照;B:接种TMV;C:丁香酚;D:丁香酚+TMV。

图5 处理3 h和12 h后烟草叶片中过氧化氢含量Fig.5 Contents of H2O2in tobacco leaves at 3 h and 12 h after varieties of treatments不同小写字母表
示同一处理时间下不同处理间差异显著(P＜0.05)。

测定烟草叶片产生过氧化氢量，进一步探讨过氧化氢响应时间及响应量的差异。

从图5可见，处理3 h后，丁香酚+TMV、丁香酚、TMV处理烟草过氧化氢量均显著高于清水对照，但丁香酚+TMV、丁香酚、TMV处理之间差异不显著，说明丁
香酚、TMV均能够很大程度上快速、大量诱导过氧化氢产生。

处理12 h后，丁
香酚+TMV、丁香酚、TMV处理亦均显著高于清水对照，结果与染色情况基本吻合。

2.5 丁香酚对烟草叶片水杨酸(SA)积累及NPR1基因转录的影响
SA在病原菌诱导信号传导途径中具有重要作用。

为了研究丁香酚处理是否能够引
起SA的积累，试验测定了不同处理后不同时期烟草叶片中SA的变化。

图6显示，随着处理后时间的增加，SA的量逐渐增大，在处理96 h时达到最大。

对水杨酸
的诱导效应总体表现为丁香酚+TMV＞丁香酚＞TMV＞清水对照，这可能是丁香
酚和TMV双重作用的结果。

图6 不同处理后烟草叶片中水杨酸(SA)随处理时间的积累情况Fig.6 Accumulation of SA in tobacco leaves after varieties of treatments for different time
NPR1是由各类已知抗病信号传导途径组成的信号传导网络的关键交叉点，NPR1的缺失导致病程相关蛋白(Pathogenesis-related proteins，PRs)基因的不表达，以及系统获得抗性(Systemic acquired resistance，SAR)的丧失。

图 7显示，处
理 12 h后NPR1基因表达量顺序为:丁香酚+TMV＞丁香酚＞TMV＞清水对照。

这说明TMV、丁香酚和丁香酚+TMV处理都能使基因NPR1表达上调。

图7 烟草叶片中NPR1基因表达Fig.7 Expression of NPR1 gene in tobacco
leaves
3 讨论
植物在长期的进化过程中形成了相对完善的防御体系，被病原物侵染几分钟后就会激发植物防御体系的快速反应，包括膜质通透性改变、pH的改变、质膜的去极化、活性氧的产生等［16-17］。

过氧化氢能够激活植物多种抗病能力，包括细胞程序化死亡［18］。

细胞的死亡不仅能够阻止病原菌的侵染，还能够引发植物产生系
统获得抗性(SAR)［19］。

系统获得抗性表现为抗病的系统性、广谱性和持久性特点，是植物防御基因被系统诱导表达的结果［20］。

这些防御反应的产生是通过
一些抗病信号途径产生的，已经被确认抗性信号分子主要是水杨酸(SA)和茉莉酸-
乙烯［21］。

SA在植物抗病信号过程中极为重要，研究发现当烟草受病原菌侵染后SA含量成倍增加，并诱导SAR，而外源SA处理植物，也能诱导植物对病原菌侵染抗性增强［22］。

NPR1是各类已知抗病信号传导途径组成信号转导网络中
的关键交叉点，参与各种类型的抗病性调控［23］。

NPR1的缺失导致植物对多
种真菌、细菌病原物的侵染表现更高的敏感性和更严重的病害症状［24］，表明NPR1在基础抗性的产生中起到重要作用。

本研究通过室内药效试验，发现丁香酚处理烟草后植株对烟草花叶病毒具有较好的抗病性。

通过活性氧的染色和检测发现，丁香酚处理能够清除部分超氧阴离子，不同程度地促进活性氧产生，特别是对H2O2的诱导作用尤为明显。

同时丁香酚
+TMV处理能够促进SA积累，并保持较长时间。

H2O2不仅能直接杀死病原菌，而且与SA之间存在相互作用。

Chen等［25］从烟草中发现SA及其类似物能够
抑制过氧化氢酶的活性，导致过氧化氢水平升高，激活PR-1基因表达，引发产生SAR。

植物体内SA含量的增加，可以更有效地诱导病程相关蛋白的合成，激活防卫系统，从而使植物产生SAR［21］。

丁香酚+TMV处理中SA的含量维持在较
高的水平，这可能与确保有效诱导植物产生抗病性有关。

同时丁香酚处理后NPR1
基因表达相应提高，病毒复制关键基因CP和RdRp表达受抑制，进一步说明了丁香酚处理后可能激活了烟草的抗病性，进而抑制了烟草花叶病毒在植株体内的复制。

本研究仅从水杨酸抗病信号途径探讨了丁香酚诱导烟草植株抗烟草花叶病毒的作用，是否涉及其他信号途径还需要进一步研究。

参考文献:
［1］樊兵，吴云锋，袁耀锋.植物源抗病毒活性物质的初步筛选［J］.西北农林科技大学学报，2005，33(B8):167-170.
［2］曲绍轩，马林，宋金俤，等.食用菌眼蕈蚊的分子鉴定及2种植物源农药的
室内毒力测定［J］.江苏农业科学，2012，40(9):123-125.
［3］白靖文，付颖，李理.植物源农药博落回研究进展［J］.江苏农业科学，2011，39(3):139-140.
［4］张正坤，沈建国，谢荔岩，等.鸦胆子素D对烟草抗烟草花叶病毒的诱导抗
性和保护作用［J］.科技导报，2008，26(8):31-36.
［5］车海彦，吴云锋，杨英，等.植物源病毒抑制剂WCT-Ⅱ控制烟草花叶病毒(TMV)的作用机理初探［J］.西北农业学报，2005，13(4):45-49.
［6］陈梅，邱德文，刘峥，等.植物激活蛋白对烟草花叶病毒RNA复制及外壳
蛋白合成的抑制作用［J］.中国生物防治，2006，22(1):63-66.
［7］周建新，许华，金浩.丁香油抑菌效果与抑菌成分的研究［J］.食品工业，2000，3(3):24-25.
［8］谭廷华，何西利.丁香酚对氧自由基的清除作用［J］.西北药学杂志，1996，11(1):30-31.
［9］陈浩，胡梁斌，王春梅，等.植物源抗病毒剂20%丁香酚AS防治西葫芦病
毒病药效试验［J］.江西农业学报，2009，21(12):112-113.
［10］王春梅，苏杭，陈浩，等.天然化合物丁香酚抗烟草花叶病毒病作用机制
初探［J］.农药，2012，51(1):29-31.
［11］苏杭，王春梅，陈浩，等.丁香酚对烟草抗烟草花叶病毒的诱导作用初探［J］.农药学学报，2012，14(1):24-29.
［12］YC/T 39—1996 烟草病害分级及调查方法［S］.
［13］OROZCO-CARDENAS M，RYAN C A.Hydrogen peroxide is generated systemically in plant leaves by wounding and systemin via the octadecanoid pathway［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences，1999，96(11):6553.
［14］JANA S，CHOUDHURI M A.Glycolate metabolism of three submersed aquatic angiosperms:effect of heavy metals［J］.Aquatic Botany，1981，20(11):67-77.
［15］CHOMCZYNSKI P，MACKEY K.Modification of the TRI
reagent.Procedure for isolation of RNA from polysaccharide-and proteoglycan-rich sources［J］.Bio Techniques，1995，19:924-945. ［16］GRANT M，MANSFIELD J.Early events in host-pathogen interactions ［J］.Current Opinion in Plant，1999，2(4):312-319.
［17］TNMNBERGER T，SCHEEL D.Signal transmission in the plant immune response［J］.Trends in Plant Science，2001，6(8):372-379. ［18］JONES J D G.Plant pathogens and integrated defence responses to infection［J］.Nature，2001，411(10):826-833.
［19］ZHANG Z G，WANG Y C.The role of SA in the hypersensitive response and systemic acquired resistance induced by elicitor PB90 from Phytophthora boehmeriae［J］.Physiological and Molecular Plant Pathology，2004，65(1):31-38.
［20］DURRANT W，DONG X.Systemic acquired resistance［J］.Annual Review of Phytopathology，2004，4(2):205-209.
［21］PHUNTUMART V，MARRO P，METRAUX J P，et al.A novel cucumber gene associated with systemic acquired resistance［J］.Plant Science，2006，171(5):555-564.
［22］师金鸽.水杨酸对CMV的诱导抗性及抗性累加效应的研究［D］.郑州:河南农业大学，2009.
［23］张红志，蔡新忠.病程相关基因非表达子(NPR1):植物抗病信号网络中的关键节点［J］.生物工程学报，2005，21(4):511-515.
［24］CAO H，BOWLING S A，Gordon A S，et al.Characterization of an Arabidopsis mutant that is nonresponsive to inducers of systemic acquired resistance［J］.The Plant Cell Online，1994，6(11):1583-1592.
［25］CHEN Z，MALAMY J，HENNING J，et al.Induction，modification，and transduction of the salicylic acid signal in plant defense responses ［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences，1995，92(10):134.。