高分子蛋白和蛋白酶A对纯生啤酒泡沫稳定性的影响

高分子蛋白和蛋白酶A对纯生啤酒泡沫稳定性的影响
姜珊;张彦青;杜金华;李惠萍;董倩倩;房慧婧;李琳
【摘要】In this study, the key factors influencing the foam stability of pure draft beer were investigated. The content of high-molecular protein and the activity of proteinase A were detected by Coomassie brilliant blue method and fluorescence-based assay in both beer brewing and beer storage process, respectively. The results showed that, different fermenting parameters in each fermenting vessels resulted in significant difference in the change of high-molecular protein content and proteinase A activity. During the fermenting stage, high-molecular protein content decreased slowly from 350~407.6 mg/L in wort to 180.1~243.1 mg/L in product beer, and proteinase A activity strengthened slowly prior to yeast harvest-ing and reached the highest levels of 18.27~30.13 U/mL, after yeast harvesting, proteinase A activity reduced and finally its activity in product beer was only 19.06%~36.4%of the previous highest value. Through the tracing of high-molecular protein content and proteinase A activity in product pure draft beer and the analysis of their effects on beer foam stability, it was found that there was significant positive relations between high-molecular protein content and foam stability (r=0.794, P<0.01), however, there was no significant relations between proteinase A activity and foam
stability/high-molecular protein content.%利用考马斯亮蓝法、荧光底物法分别跟踪检测啤酒酿造和贮存过程中高分子蛋白含量及蛋白酶A活力变化，研究影响纯生啤酒泡沫稳定性的关键因素。

结果表明，各发酵罐因发酵阶段工艺参数的不
同，导致高分子蛋白含量及蛋白酶A活力变化趋势存在明显差异。

发酵阶段高分
子蛋白含量缓慢降低，由入罐麦汁时的350～407.6 mg/L降到成品酒时的
180.1～243.1 mg/L；蛋白酶A活力在回收酵母前增加，后达到最高值，其范围
是18.27～30.13 U/mL，回收酵母后蛋白酶A活力下降，最终在成品酒中的蛋白酶A活力检测值为发酵过程中最高值的19.06%～36.4%。

通过对成品纯生啤酒中高分子蛋白含量、蛋白酶A活力的跟踪，分析各自对泡持性的作用发现，高分子
蛋白含量与泡持性（r=0.794，P＜0.01）显著正相关；蛋白酶A活力与泡持性及
高分子蛋白含量之间没有显著相关性。

【期刊名称】《酿酒科技》
【年(卷),期】2014(000)011
【总页数】6页(P18-22,27)
【关键词】高分子蛋白;蛋白酶A;纯生啤酒;发酵过程;泡沫稳定性
【作者】姜珊;张彦青;杜金华;李惠萍;董倩倩;房慧婧;李琳
【作者单位】山东农业大学，食品科学与工程学院，山东泰安271018; 广州珠江
啤酒股份有限公司，广东广州510308;广州珠江啤酒股份有限公司，广东广州510308; 中国食品发酵工业研究院，北京100027; 华南理工大学轻工与食品学院，广东广州510641;山东农业大学，食品科学与工程学院，山东泰安271018;广州
珠江啤酒股份有限公司，广东广州510308;山东农业大学，食品科学与工程学院，山东泰安271018;广州珠江啤酒股份有限公司，广东广州510308;华南理工大学
轻工与食品学院，广东广州510641
【正文语种】中文
【中图分类】TS262.5;TS261.4;TS261.7
啤酒泡沫是啤酒外观质量的核心指标，是消费者判断啤酒质量的第一感觉[1]。

影
响啤酒泡沫稳定性的因素很多，如高分子蛋白、金属离子、表面张力、异α-酸、CO2含量等[2-4]，其中高分子蛋白含量尤为重要[5]。

啤酒中含有3种主要的高分子蛋白质，第一组是来自醇溶蛋白的富含脯氨酸的、分子量为15～32 kDa的多肽，能导致啤酒浑浊；第二组是脂转移蛋白1-LTP1，其分子量为9.7 kDa，主要
参与啤酒的泡沫稳定性；第三组是分子量为40 kDa的Z蛋白，同样在稳定泡沫方面发挥作用[6]。

考马斯亮蓝法是测定啤酒中高分子蛋白质的简单方法，能比较准
确地测定分子量大于5 kDa的蛋白质[7-8]，由于此方法对芳香族氨基酸的反应敏
感性远高于脯氨酸敏感性，因此该方法测定的高分子蛋白含量与啤酒泡持性有很高的相关性[9]。

纯生啤酒由于不经过热杀菌，最大限度的保持了啤酒的新鲜和营养，因而深受消费者的喜爱。

但也是因为这个原因而造成纯生啤酒的泡沫问题，是困扰各厂家及国内外研究学者的关键问题，许多研究认为这是由于酒液中存在的蛋白酶A造成的[2，10]。

啤酒中的蛋白酶含量特别低，基质影响复杂，常规的蛋白酶检测方法无法准
确测定，荧光底物法具有灵敏度高、抗干扰能力强的优势，通过合成带有荧光基团的人工合成肽链准确地测定纯生啤酒中蛋白酶A活力，为检测啤酒中蛋白酶A活
力的有效方法。

后期，研究者继续对荧光底物的开发做深入探索，使该方法在灵敏度和稳定性方面逐渐提高，到目前为止，Hiroto Kondo[11]等开发的新型荧光底
物已经得到广泛认可，国内外研究学者将它作为检测成品酒及发酵液中的蛋白酶A 活力的常用方法[12-15]。

由于高分子蛋白含量和蛋白酶A活力对纯生啤酒泡沫具有重要影响，许多学者对
纯生啤酒贮存过程中蛋白酶A活性变化、高分子蛋白含量变化及泡持性衰减进行
了跟踪研究，结果也被进一步确认[2，16]。

而对于发酵过程中高分子蛋白含量和
蛋白酶A活力变化的研究则并不多，相关的研究也仅仅初步作了发酵过程中蛋白
酶A活力变化趋势研究[11，17，18]，对于啤酒发酵过程中两者含量变化以及相
互作用对成品纯生泡沫稳定性的影响则未见相关报道。

本实验通过跟踪检测发酵过程中蛋白酶A活力、高分子蛋白含量变化，对发酵过
程中两个关键因素的变化情况有清楚了解，并通过对发酵工艺的控制，提出改善啤酒泡沫稳定性的可行性建议，最终通过跟踪测定出罐后成品酒泡持值，分析蛋白酶A活力、高分子蛋白含量与泡持值的相互影响。

1.1 材料与试剂
考马斯亮蓝G-250，国药集团化学试剂有限公司；无水乙醇，安徽安特食品股份
有限公司；磷酸，广州市东红化工厂；牛血清蛋白，上海伯奥生物科技有限公司；Na2HPO4·12H2O、柠檬酸，广州化学试剂厂；DMSO，FARCO化学试剂公司；蛋白酶K，Sigma公司。

荧光底物MOCAc-Ala-Pro-Ala-Lys-Phe-Phe-Arg-
Leu-Lys（Dnp）-NH2，日本多肽研究所。

仪器设备：V3140型分光光度计，澳大利亚GBC公司；Nibem-THaffman泡沫
测定仪，荷兰Haffmans公司；LRH-250A生化培养箱，广东省医疗器械厂；RF-5301PC荧光分光光度计，日本东京岛津公司；HHW 21-420XMTB数显调节恒
温水浴锅，余姚市东方电工仪器厂；HI8417 pH计，Hanna公司；MEDIFRIGER-BL型冷冻离心机，西班牙J.P.SELECTA公司。

1.2 实验方法
1.2.1 泡持值测定
参照国标GB/T4928—2008中仪器法测定啤酒泡持性。

每次测定各取两瓶，取其平均值。

1.2.2 蛋白酶A酶活测定[17]
在离心管中加入1m L体系：500μL的pH5.5磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，440μL
双蒸水，40μL经过除气的啤酒样品，20μL浓度为0.2mmol荧光底物（1.1mg
荧光底物溶于3850μLDMSO中，于-20℃避光保存）。

混合均匀后，将离心管避光盖紧，转入30℃水浴中避光反应30m in（实验空白需先在80℃下灭活10min，再进行避光反应）。

反应结束后，将离心管转入80℃水浴中灭活5m in。

将灭活
后的样品快速冷却至0℃并进行离心处理（0℃，10000 r/m in，3m in）。

用移
液枪吸取750μL 样品测定荧光强度，激发波长λex=328 nm，发射波长
λem=393 nm。

由于Sigma公司生产的蛋白酶A标准品已经停产，考虑将其他蛋白酶作为替代品。

查阅相关资料发现蛋白酶K的催化活性相似，其占主导地位的断开键是脂肪族氨
基酸和芳香族氨基酸的羧基族肽键[20-22]，与蛋白酶A作用荧光底物时破坏两个苯丙氨酸（Phe-Phe）键比较一致[11]。

因此选用蛋白酶K作为替代品，以灭活纯生啤酒为稀释液，做标准曲线，结果见图1。

其线性范围是2×10-5 U/m L 到
8×10-5 U/m L，R2为 0.9886，这与前人研究的蛋白酶A标准曲线的结果相似[11]。

综合以上分析和实验结果，为处理数据的表征结果的便利性，在本研究中，选择蛋白酶K作为蛋白酶A的替代品建立标准曲线(图 1)。

1.2.3 高分子蛋白含量测定
称取100mg考马斯亮蓝G-250溶于50m L 95%vol乙醇中，后加入85%（m/v）磷酸100m L，放冷至室温，加水定容至1000m L。

过滤至棕色试剂瓶中备用。

待测啤酒用蒸馏水稀释4倍后取1m L，与5m L上述配制好的考马斯亮蓝溶液混
合均匀。

室温静置10m in，于595 nm波长处比色，测定吸光度，重复3次。

分别准确量取200mg/L牛血清蛋白1mg/L、2mg/L、3mg/L、4 mg/L、5
mg/L、6m L 于 10m L 具塞试管中定容，分别取1m L上述标准溶液，再加5m
L考马斯亮蓝G-250染液，充分混匀。

室温静置10m in，于595 nm波长比色，测定吸光度，建立标准曲线，结果见图2。

1.2.4 发酵过程分析
对发酵过程进行蛋白酶A活力和高分子蛋白含量的跟踪测定，观察不同种类酵母
对蛋白酶A活性的影响，以及发酵过程中其他参数对两项检测指标的影响。

1.2.5 成品啤酒分析
对跟踪后的成品纯生啤酒进行泡持值、高分子蛋白含量及蛋白酶A活力的跟踪测定，观察储存时间对酶活性的影响及泡持值与两者的相互关系。

2.1 啤酒发酵过程参数与蛋白酶A变化情况分析
啤酒发酵过程参数与蛋白酶A变化分别见表1与图3。

发酵过程中，跟踪 4个罐号分别为1#、24#、34#、44#的500 t13°P发酵液，
蛋白酶A的变化情况见图3。

4个发酵罐的接种酵母为H酵母和P酵母2种。

4
个发酵罐中的蛋白酶A活力变化不同。

由表1可知，接种同种H酵母的1#罐和
44#罐，酵母使用代数相同，44#罐接种酵母存活率比1#罐要高，其蛋白酶A活
力在发酵过程中的整体趋势更低；接种P酵母的24#和34#罐，24#罐酵母使用
代数大，接种酵母存活率低，其蛋白酶A活力在发酵过程中高于34#罐的蛋白酶
A活力。

本研究选用酵母都是2代和3代活力较高的酵母，发酵过程的参数变化
的趋势差异很小，但蛋白酶A的峰值出现的时间差异较大。

其他参数如：接种酵
母储存时间、酵母回收时间等对蛋白酶A峰值大小及出现时间的影响，需要更进
一步深入研究。

可以看出，冷麦汁中未检测到蛋白酶A活力，蛋白酶A是酵母在发酵过程中产生的。

在整个发酵过程中，蛋白酶A活力先增加，达到最大值后下降。

每个发酵罐
中蛋白酶A的活力在发酵的不同阶段有着明显的变化，4个发酵罐中蛋白酶A活
力分别于8 d、12 d、14 d和16 d达到最高值，最高值分别为20.31U/m L、18.27U/m L、27.51U/m L和 30.13 U/m L。

4个发酵罐中，1#、24#降温到0℃时需8 d，34#、44#降温到0℃时需10 d。

冷储阶段的蛋白酶A活力会显著下降，
在出罐前下降到6.93～10.19U/m L。

蛋白酶A是一种易浑浊敏感蛋白，在低温条件下可以絮凝，通过低温条件部分沉淀去除这一观点[4，10]得到证实。

Hiroto Kondo[11]等研究发现，发酵过程中氮含量较低时，特别是氨基酸含量低时，酵母细胞能释放更多的蛋白酶A，这个结论总体上与本研究结果一致，但需要指出的是实验仅跟踪了1#罐发酵液的变化情况，蛋白质A的变化情况与本研究中44#罐相似。

过滤后成品啤酒的蛋白酶A含量结果见表2，4个发酵罐滤后成品啤酒的蛋白酶A 活力为发酵过程中蛋白酶活力最高值的19.06%～36.4%，这与D.J.Cooper[18]等研究发现，滤后啤酒中蛋白酶A含量大致为最高值的20%的结论基本接近。

2.2 发酵过程高分子蛋白含量变化情况
高分子蛋白含量在发酵过程中的变化情况见图4。

图 4 表明，1#、24#、34#、44# 各发酵罐在入罐前麦汁高分子蛋白含量分别为399 mg/L、370 mg/L、408mg/L和350mg/L，发酵过程中逐渐降低，从入罐前麦汁到发酵结束最终发酵液，高分子蛋白含量下降了15.0%～28.7%。

发酵过程作为高分子蛋白含量下降的最重要阶段，主要原因有以下几个方面：发酵过程中产生的气泡消耗大量的泡沫活性物质，同时酵母在回收时造成许多高分子蛋白的流失，使高分子蛋白含量降低；酵母合成蛋白水解酶，这些酶进入发酵液中会降解其中的蛋白质，从而对啤酒的泡沫稳定性产生负面影响，这个过程一般发生在发酵或贮酒过程中[8]。

过滤后成品酒的高分子蛋白含量见表3。

4个发酵罐过滤后成品的高分子蛋白质含量为过滤前发酵液的67.2%～76.2%，小于稀释后的滤前发酵液高分子蛋白含量的理论值76.9%（成品啤酒的原浓为10°P，而发酵液的原浓为13°P）。

啤酒在过滤过程中会有少量的蛋白质因沉淀而损失。

2.3 储存过程中二者的变化情况及与泡持性的关系
2.3.1 成品纯生啤酒泡持值衰减
跟踪4个发酵罐在灌装后储存期内泡持衰减情况，见图5。

纯生啤酒的泡持衰减有一定的规律性，前期泡持衰减较快，3周后泡持衰减缓慢，1#和34#泡持衰减幅度小，24#、44#泡持值衰减严重，泡持值分别下降51 s和30 s。

2.3.2 储存过程中纯生啤酒的高分子蛋白含量变化
利用考马斯亮蓝法测定4个发酵罐纯生啤酒在灌装后到储存期1个月时高分子蛋白含量变化情况，见图6。

4发酵罐跟踪酒样储存7 d后，高分子蛋白含量分别为1#223mg/L，24#180mg/L，34#243mg/L，44#216mg/L，高分子蛋白含量随储存时间的延长而慢慢衰减。

4个成品酒储存4周时的泡持值，由高到低依次为1#＞34#＞24#＞44#。

啤酒储存初期高分子蛋白含量差别大，后期随储存时间的延长，差值慢慢减小，由储存7 d时的差值为63mg/L减少为储存4周后的
34mg/L。

麦汁阶段高分子蛋白含量，分别为399mg/L、370mg/L、408mg/L 和350mg/L（按照发酵罐号先后顺序）。

高分子蛋白含量由麦汁阶段到成品酒阶段下降了134～190mg/L。

2.3.3 成品纯生啤酒蛋白酶A活力变化
由表3可知，蛋白酶A活力在发酵液中较低。

过滤后各罐成品酒中蛋白酶A活力依据实验记录结果依次为 5.74U/m L、3.68U/m L、2.01U/m L、2.17U/m L。

利用荧光底物法测定4个发酵罐纯生啤酒在灌装后到储存期1个月时蛋白酶A活力变化情况，见图7。

成品酒储存7 d，蛋白酶A活力有明显上升，其原因可能与蛋白酶A前驱物质成分有关，需要进行更深入研究。

在随后跟踪过程中，酶活力表现出正常波动。

已有研究证明，泡持的衰减与酒体中存在的活性蛋白酶A的量成正相关[10]。

由图7可知，34#罐与24#罐蛋白酶A活力较高，1#罐与44#罐酶活力相对较低，联系各罐成品酒泡持值与高分子蛋白含量，对三者相关性进行分析：34#啤酒高分子蛋白含量高，蛋白酶A活力虽高，但没有导致泡持值严重降低；24#啤酒中的
高分子蛋白含量最低，蛋白酶A活力较高，其成品酒泡持值为4个罐中最低；1#
啤酒因较高的高分子蛋白含量和较低的蛋白酶A酶活，成品酒泡持一直为4个罐
中最优；44#啤酒虽有4个罐中最低的蛋白酶A活力，但其高分子蛋白含量不高，成品酒泡持性值优于24#罐。

2.3.4 泡持性、高分子蛋白含量与蛋白酶A活力之间的相关性分析
对纯生啤酒第一个月储存期内，泡持性与高分子蛋白含量、蛋白酶A活性的相关
性进行分析，高分子蛋白含量与泡持性显著正相关（r=0.794，P＜0.01）；蛋白
酶A活力与泡持性及高分子蛋白含量之间没有显著相关性。

综合4个罐纯生啤酒
中高分子蛋白含量及蛋白酶A活力对纯生啤酒泡持性的作用，可知蛋白酶A活力
的影响要小于高分子蛋白含量在实际生产过程中的影响。

4个罐发酵液大生产过程中，酵母产生蛋白酶A，其活力在发酵过程中先增加后减少，酶活力的最高值范围是18.27～30.13U/m L；高分子蛋白含量从发酵初期到
成品酒储存阶段，不断下降，由麦汁到成品酒阶段下降134～190mg/L。

得到的
成品啤酒，泡持在1月内有13～51 s的下降。

其中高分子蛋白含量与泡持性
（r=0.794，P＜0.01）有显著正相关；蛋白酶A活力与泡持性无相关性。

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