哈氏弧菌谷胱甘肽还原酶基因克隆及原核表达

哈氏弧菌谷胱甘肽还原酶基因克隆及原核表达
朱帆;丁燏;鲁义善;简纪常;吴灶和
【摘要】The purpose of this study is to clone glutathione
reductase(GR)gene fromVibrio harveyi,construct the prokaryotic expression vector of it, and obtain the corresponding expressed protein. Digested GR and pET-32a(+)were cut with the double enzymesBamH I and Xho I, then ligated with T4 ligase to construct the recombinant plasmid pET-GR. Then pET-GR was transformed into Escherichia coli BL21 (DE3), which was induced by IPTG, and their expressions were analyzed by SDS-PAGE. An approximately 68.9 kD exogenous protein was observed on the SDS-PAGE. The optimal expression condition for the recombinant plasmid pET-GR was that the recombinantE. coli BL21 (DE3)was induced for 4 h at 28℃ by 0. 7 mmol/L of IPTG and it e xpressed in E. coli as the inclusion bodies. The conclusion of the study is that GR gene fromV. harveyican efficiently express inE. coli.%经克隆哈氏弧菌谷胱甘肽还原酶（GR）基因，并构建其原核表达载体，以获得相应的表达蛋白。

将GR和pET-32a（+）通过BamH I和Xho I双酶切后，体外用T4连接酶连接，构建重组质粒pET-GR；然后转化
至大肠杆菌BL21（DE3）中，利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达，应用SDS-PAGE分析表达情况和表达条件。

SDS-PAGE电泳获得分子量约为68.9 kD融合蛋白条带。

在E.coli BL21（DE3）中重组质粒pET-GR的表达条件为28℃，0.7 mmol/L的IPTG浓度诱导4 h表达量最高，且主要以包涵体形式表达。

哈氏弧菌谷胱甘肽还原酶基因在大肠杆菌中获得了高效表达。

【期刊名称】《生物技术通报》
【年(卷),期】2015(000)006
【总页数】6页(P183-188)
【关键词】哈氏弧菌;谷胱甘肽还原酶;基因克隆;原核表达
【作者】朱帆;丁燏;鲁义善;简纪常;吴灶和
【作者单位】广东海洋大学水产学院，湛江 524088; 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室，湛江 524088; 广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室，湛江 524088;广东海洋大学水产学院，湛江 524088; 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室，湛江 524088; 广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室，湛江 524088;广东海洋大学水产学院，湛江 524088; 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室，湛江 524088; 广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室，湛江 524088;广东海洋大学水产学院，湛江 524088; 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室，湛江524088; 广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室，湛江 524088;广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室，湛江 524088; 广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室，湛江 524088; 仲恺农业工程学院，广州510225
【正文语种】中文
哈氏弧菌（Vibrio harveyi）是一种革兰氏阴性、发光的海洋浮游细菌，广泛分布于近岸温暖的海水、海洋沉积物、海洋动物的体表等各种海洋场所［1］，是近10多年才被认识的水产养殖动物重要的条件致病菌。

暴发性弧菌病是对虾的一种
严重疾病，曾引起多个国家对虾养殖的大面积死亡，如墨西哥［2］、菲律宾［3］、澳大利亚［4］、中国［5］等，给对虾养殖造成灾难性的经济损失［6］。

该菌同时能够感染大西洋棘白鲳（Chaetodipterus faber）［7］、大黄鱼（Pseudosciaena crocea）［8］、斜带石斑鱼（Epinephelus coioides）［9］等多种养殖鱼类。

随着海水养殖业的迅速发展，弧菌病的流行也越来越多。

目前，抗生素仍然是控制弧菌病的主要手段，然而由于抗生素的大量使用导致耐药菌的出现，使弧菌病的控制变得更加困难［10，11］。

细菌耐药的形成机制有目
标靶蛋白的修饰、主动药物转运系统、细胞外膜通透性的改变等［12，13］，有
研究表明，细菌在抗生素的刺激下会产生氧化应激，细胞内产生过量的氧化物和自由基（Reactive oxygen species，ROS），导致细胞内的氧化和抗氧化失去平衡，从而引起细胞损伤［14，15］。

因此细菌细胞对活性氧和自由基的清除可能是耐
药性形成的一个原因。

谷胱甘肽（Glutathione，GSH）是广泛存在于动植物、微生物细胞内重要的抗氧化剂，能够有效清除活性氧自由基，维持细胞内稳定的氧化还原状态［16，17］。

GSH参与的大部分反应都是还原态形式，还原型GSH失
去电子形成氧化型谷胱甘肽（Glutathione oxidized，GSSG），谷胱甘肽还原酶（Glutathione reductase，GR）以还原型辅酶Ⅱ（NADPH）作为电子供体还原GSSG形成GSH［18］。

而GSH的抗氧化能力主要取决于细胞内GSH的浓度和GSH/GSSG的比率［19］，因此GR是GSH抗氧化作用中的重要组成部分，与
细菌的耐药性形成也密切相关。

本实验构建含哈氏弧菌GR基因的大肠杆菌BL21（DE3）重组菌株，并对融合蛋
白表达的IPTG诱导条件进行优化，旨为进一步研究GR的功能特别是在细菌耐药性中的作用奠定基础。

1.1 材料
1.1.1 菌株和质粒哈氏弧菌（Vibrio harveyi）ZJ0603，E.coli DH5α和
E.coli BL21（DE3）均由本实验室保存；克隆质粒pMD18-T，内切酶BamH I，Xho I均购自TaKaRa公司；原核表达质粒pET-32a（+）由本实验室保存。

1.1.2 主要试剂细菌基因组DNA提取试剂盒，DNA凝胶回收纯化试剂盒，购自Thermo公司；PCR试剂盒，T4连接酶，购自TaKaRa公司；PCR引物由上海生工合成；BamH I、Xho I均购自大连宝生物公司。

1.2 方法
1.2.1 GR基因克隆使用细菌DNA提取试剂盒，提取哈氏弧菌基因组，根据GenBank中已发表的哈氏弧菌VIBHAR_00523的GR基因序列（登录号5552818），利用Primer 5.0设计引物，grs 5'-CGGG ATCCATGGCGACTCATTTTGATTAT-3'（酶切位点BamH I）gra 5'-CCGCTCGAGCTAACCTGTCATGGT AACGAAC-3'（酶切位点Xho I）。

以基因组DNA为模板扩增GR的ORF，PCR程序为：94℃预变性4 min；94℃ 40 s，61℃ 40 s，72℃ 1 min，28个循环；72℃，7min；4℃ forever。

PCR结束后取产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，并回收PCR产物，-20℃保存。

1.2.2 PCR产物检测将回收的PCR产物16℃过夜连接到pMD18-T载体，命名为pMD18-gr，取10 μL连接产物转化至E.coli DH5α感受态细胞［20］；转化产物涂布于含氨苄青霉素的LB琼脂平板，37℃培养8-10 h。

挑取单个转化菌落，接种于1 mL含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃ 200 r/min培养1-2 h，菌落PCR检测阳性的单克隆送至上海生工测序部测序。

1.2.3 pET-gr目标载体的构建测序结果比对正确后，提取重组质粒pMD18-gr和质粒pET-32a（+），经过双酶切后用T4 DNA连接酶将酶切后的目的片段和pET-32a（+）连接构建重组质粒，命名为pET-gr，再转入受体菌E.coli BL21（DE3），PCR检测阳性克隆并测序。

1.2.4 重组目标蛋白的诱导表达将含有重组质粒pET-gr的大肠杆菌BL21按
1∶50接种于含氨苄抗性的LB液体培养基中37℃ 200 r/min培养。

当OD600
达到0.4-0.6时，加IPTG至终浓度为1 mmol/L，继续培养4 h。

取1 mL菌液于1.5 mL EP管中，10 000 r/min离心2 min，弃上清，菌体经预处理后进行SDS-PAGE分析。

以同样的方法诱导含空质粒pET-32a（+）的Ecoli BL21（DE3）作对照；并从时间、温度、IPTG浓度3个方面探索目标蛋白表达的最佳条件。

IPTG 浓度：其他培养条件不变时，设置不同的IPTG浓度0.1、0.2、0.4、0.7和1.0 mmol/L诱导，分别处理菌体进行SDS-PAGE分析；时间：其他培养条件不变时，在诱导后的2、4、6、8和10 h分别取样，分别处理菌体，进行SDS-PAGE分析；温度：其他培养条件不变时，在不同温度28℃，37℃条件下诱导培养，分别收集菌体后利用超声波破碎，超声程序为：超声破碎6 s，间歇6 s，保护温度设置为37℃，直至菌液澄清，然后离心收集上清和沉淀进行SDS-PAGE分析。

2.1 目的基因ORF克隆与分析
设计的GR引物，经PCR扩增分别得到1 000 bp左右的条带（图1-A），连接
至pMD18-T vector后转化入E.coli DH5α，菌落PCR扩增的条带大小与之相符（图1-B）。

根据NCBI网站的ORF Finder软件分析，GR基因序列包含一个1 356 bp的完
整开放阅读框（ORF），编码451个氨基酸，分子量预测为48.9 kD，理论等电
点为5.29，SignalP 3.0 Server分析显示该基因没有信号肽序列，TMHMM Server v. 2.0分析该基因不存在跨膜区。

NetGlyc 1.0 Server 预测其没有N-糖基化位点，NetPhos 2.0 Server预测该基因有3个丝氨酸磷酸化位点。

8个酪氨酸
磷酸化位点和4个苏氨酸磷酸化位点，一个cAMP和cGMP依赖性的蛋白激酶磷酸化位点，2个蛋白激酶c磷酸化位点，6个酪蛋白激酶II磷酸化位点，14个N-十四酰化位点，一个CAAX box，11个微体C末端定位信号序列。

氨基酸同源性分析序列分析显示，哈氏弧菌GR基因与轮虫弧菌（V.Rotiferianus），副溶血弧
菌（V.parahaemolyticus）和溶藻弧菌（V.alginolyticus）都具有很高的同源性，其中与轮虫弧菌的同源性达到99%。

2.2 原核表达
2.2.1 原核表达载体的构建克隆的GR基因连接到pET-32a（+）转化至E.coli
BL21（DE3）感受态细胞中，阳性菌落的PCR鉴定有约1 356 bp的亮带（图3-A），提取质粒经Xho I和BamH I双酶切鉴定（图3-B），出现的条带大小与预期结果一致，测序并分析证明原核表达载体pET32-gr构建成功。

2.2.2 重组质粒的诱导表达含重组质粒pET-gr的大肠杆菌BL21经IPTG诱导，
得到约68.9 kD的融合蛋白，其中预计GR分子量为48.9 kD，pET-32a（+）表
达的融合标签约为20 kD；没有诱导的含重组质粒的E.coli BL21（DE3）和诱导
的含pET-32a（+）空载体的E.coli BL21（DE3）作为对照，未发现目的蛋白表
达（图4），因此目的基因表达成功。

GR基因表达的条件优化结果表明，GR在IPTG浓度为0-1.0 mmol/L范围内，表达量先升高后降低，在0.7 mmol/L时表达量最大（图5-A），诱导4 h时表达量最大（图5-B），最适诱导温度为28℃（图5-C）。

在最佳诱导条件下诱导表达后，收集重组菌经超声破碎细胞，SDS-PAGE分析表明，37℃和28℃诱导时沉淀和上清中都有明显的目的蛋白条带，但是28℃诱导时沉淀和上清的目的蛋白条带
均相对于37℃诱导时的亮，并且两种温度诱导下沉淀中的目的蛋白条比上清中的
目的蛋白多（图5-C），表明重组蛋白在E.coli BL21（DE3）中主要以包涵体形
式存在。

GSH作为细胞内重要的抗氧化剂可以和许多化合物反应，参与细胞内许多生理过程，以维持细胞内硫醇的氧化还原状态。

GSH的抗氧化能力是通过为关键的抗氧
化防御酶如抗坏血酸、过氧化物酶等提供还原当量来实现的［21］。

但在清除ROS的解毒过程中，形成大量的谷胱甘肽二硫化物（GSSG）即GSH的氧化形式，
而GR则以NADPH作为辅酶，催化GSSG转变成GSH［22］，它属于一种黄素蛋白还原酶。

因此，GR通过保持较高的GSH/GSSG比率在维持细胞内稳定的氧化还原水平中具有重要作用。

目前，在许多生物中已克隆出编码GR的基因组DNA或cDNAs，包括细菌［23］、植物［24］、和小鼠［25］等。

并且通过酶活性测定和基因表达定量分析，对GR在植物的抗逆性和抗氧化，以及动物癌细胞的耐药性方面的作用已经进行了较多的研究。

研究显示，GR在植物抗胁迫时参与氧化应激和对刺激的耐受性具有重要作用［26］，具有较低GR活性的植物对温度、重金属、盐度等环境胁迫更加敏感，GR基因缺失菌株在环境胁迫因子刺激下存活率更低，重组高产GSH 合成酶系统使大肠杆菌对重金属的耐受性提高［27］，因此GSH抗氧化系统在植物抗逆性、抗胁迫、动物肿瘤耐药性治疗、细胞抗氧化、抗衰老等方面具有广阔的应用前景，但是细菌耐药性的形成与GSH抗氧化系统的相关性研究相对较少。

抗生素作用于细菌，引起细菌细胞内的氧化应激时，过量氧化物和自由基消耗GSH，导致GSH/ GSSG比率降低，GSH合成酶体系的表达和GSSG的还原途径在调控维持细胞的氧化还原平衡时的分子机制不是很清楚。

本实验克隆并分析了哈氏弧菌GR基因序列，其中活性位点和可能的功能位点可以帮助预测该基因的蛋白质结构，从分子水平预测抗氧化系统与细菌耐药性的关系，同时可以进一步从构建GR功能位点缺失的突变株来研究GR的功能和参与的代谢过程。

因为本实验室制备的哈氏弧菌GSH抗氧化酶GST和GPx基因疫苗对斜带石斑鱼具有较好的保护作用，而且有研究在大肠杆菌中表达的哈氏弧菌GR［28］、SOD ［29］纯化蛋白对鱼也有较好的保护作用，本实验经克隆病原菌哈氏弧菌GR基因构建表达载体，并得到了该蛋白表达的最佳条件，28℃诱导时蛋白在上清中的表达量较多。

探索重组活性蛋白的表达条件，获得大量活性蛋白，可以从GR蛋白对细菌的药物敏感程度的影响来探讨GR与细菌耐药性的关系，从而进一步研究其
在细菌耐药性中的功能与作用；同时也可以用于弧菌疫苗的研究，以期从GR角度对弧菌病起到较好的防疫作用。

本研究克隆了哈氏弧菌谷胱甘肽还原酶GR基因，得到1 356 bp碱基序列，将之与pET-32a（+）连接后，转化入E.coli BL21（DE3）中构建了重组菌株。

表达条件优化结果为，当重组表达菌生长至OD600=0.4-0.6 时，经 0.7 mmol/L 的IPTG 在28℃诱导 4 h，表达出较多的68.9 kD蛋白，为获得高效表达的蛋白以检测其生物学活性和以后实验中的应用奠定了必要的基础。

【相关文献】
［1］ Han-Ching Wang K， Tseng CW， Lin HY， et al. RNAi knock-down of the Litopenaeus vannamei Toll gene（LvToll）significantly increases mortality and reduces bacterial clearance after challenge with Vibrio harveyi［J］. Developmental and Comparative Immunology， 2010，34：49-58.
［2］ Vandenberghe J， Verdonck L， Robles Arozarena R， et al. Vibrios associated with Litopenaeus vannamei larvae， postlarvae， broodstock，and hatchery probionts［J］. Appl Environment Microbioltic， 1999，65（6）：2592-2597.
［3］ Lavilla-Pitogo CRM， Baticados CL， Cruz Lacierda ER， et al. Occurrence of luminous bacterial disease of Penaeus monodon larvae in the Philippines［J］. Aquaculture， 1990， 91（1）：1-13.
［4］ Pizzutto M， Hirst RG. Classification of isolates of Vibrio harveyivirulent to Penaeus monodon larvae by protein profile analysis and M13 DNA fingerprinting［J］. Diseases of Aquatic Organisms，1995， 21（1）：61-68.
［5］ Liu PC， Lee KK， Yii KC， et al. Isolation of Vibrio harveyi from diseased kuruma prawns Penaeus japonicus［J］. Current Microbiol， 1996，33（2）：129-132.
［6］ Huang HH， Liu XL， Xiang JH， Wang P. Selection of Vibrio harveyiresistant Litopenaeus vannameivia a three round challenge selection with a pathogenic strain of V. Harveyi［J］. Fish and Shellfish Immunology， 2013， 35：328-333.
［7］ Alvare JD， Austin B， Alvarez AM， Reyes H . Vibrio harveyi：a pathogen of penaeid shrimps and fish in Venezuela［J］. Journal of Fish Diseases， 1998， 21（4）：313-316.
［8］祝璟琳，王国良，金珊. 养殖大黄鱼病原弧菌多重PCR检测技术的建立和应用［J］. 中国
水产科学， 2009， 16（2）：157-163.
［9］ Talpur AD， Ikhwanuddin M. Azadirachta indica（neem）leaf dietary effects on the immunity response and disease resistance of Asian seabass， Lates calcarifer challenged with Vibrio harveyi［J］. Fish and Shellfish Immunology， 2013， 34：254-264.
［10］俞慎，王敏，洪有为. 环境介质中的抗生素及其微生物生态效应［J］. 生态学报， 2011，31（15）：4437-4446.
［11］ Ottaviania D， Bacchiocchi I， Masini L. Antimicrobial susceptibility of potentially pathogenic halophilic vibrios isolated from seafood［J］. International Journal of Antimicrobial Agents， 2001， 18：135-140.
［12］朱家馨. 铜绿假单胞菌碳青霉烯类抗生素耐药的分子机制研究［D］. 广州：中山大学，2006.
［13］吴峥嵘. 双黄连粉针剂对多重耐药大肠埃希菌耐药性影响的机理研究［D］. 北京：北京中
医药大学， 2013.
［14］ Albesa I， Becerra MC，Battán PC，Páez PL. Oxidative stress involved in the antibacterial action of different antibiotics［J］. Biochemical and Biophysical Research Communication， 2004，317：605-609.
［15］ Aiassa V， Barnes AI， Albesa I. Resistance to ciprofloxacin by enhancement of antioxidant defenses in biofilm and planktonic Proteus mirabilis［J］. Biochemical and Biophysical Research Communications， 2010， 393：84-88.
［16］樊阅评，于建春，余跃，张琳. 谷胱甘肽的生理意义及其各测定方法比较、评价［J］. 中国临床营养杂志， 2003， 11（2）：136-139.
［17］ Sies H. Glutathione and its role in cellular functions［J］. Free Radical Biology and Medicine， 1999， 27（9）：916-921.
［18］邓治，王翔，李德军. 巴西橡胶树中谷胱甘肽及其合成代谢途径关键酶活性的研究［J］.
热带农业科学， 2012， 32（12）：50-53.
［19］张亚妮. 谷胱甘肽与铜绿假单胞菌致病性及抗生素抗性的关系研究［D］. 西安：西北大学，2009.
［20］王金慧. 南极冰藻GPx、GST和SAHH基因的克隆、定量分析及原核表达载体的构建［D］. 湛江：广东海洋大学， 2011.
［21］ Loprasert S， Whangsuk W， Sallabhan R， Mongkolsuk S. The unique glutathione reductase from Xanthomonas campestris：Gene expression and enzyme characterization［J］. Biochemical and Biophysical Research Communications， 2005，331：1324-1330.
［22］ Ding SH， Lei M， Lu QT， et al. Enhanced sensitivity and characterization of photosystem II in transgenic tobacco plants with decreased chloroplast glutathione reductase under chilling stress［J］. Biochimica et Biophysica Acta， 2012， 1817：1979-1991.
［23］沈立新，魏东芝，赵哲峰，等. 谷胱甘肽合成酶系的克隆、测序及表达［J］. 生物工程学报， 2001， 17（1）：98-100.
［24］刘莹. 南极衣藻谷胱甘肽还原酶基因的克隆、表达和定量分析［D］. 湛江：广东海洋大学，2010.
［25］张菁. GSH对氧自由基介导的细胞凋亡保护机制研究［D］.天津：天津医科大学， 2002. ［26］张扬. 番茄S-亚硝基谷胱甘肽还原酶基因（S1GSNOR）沉默对番茄高温抗性的影响［D］. 杭州：浙江大学， 2013.
［27］李平平，柳生奎，邱志奇，安志刚. 谷胱甘肽合成酶基因StGCS-GS的表达提高大肠杆菌对重金属的抗性［J］. 森林工程， 2011， 27（1）：5-8.
［28］陶然. 哈维一氏弧菌硫氧还蛋白还原酶在大肠杆菌中的表达及对大菱鲆免疫保护作用［D］. 青岛：中国海洋大学， 2011.
［29］辛瑞晓，易飞，张蕊，等. 哈维氏弧菌铁超氧化物歧化酶基因表达及免疫作用研究［J］. 水生生物学报， 2012， 36（2）：213-217.。