木犀草素对小鼠体外培养前成骨细胞MC3T3鄄E1增殖、分化、矿化和Wnt通路的影响

[收稿日期]2015⁃05⁃13
[作者单位]辽宁省鞍山市中心医院药剂科,114001[作者简介]尚　丹(1982-),女,主管药师.
[文章编号]1000⁃2200(2017)01⁃0044⁃04
㊃基础医学㊃
木犀草素对小鼠体外培养前成骨细胞MC3T3⁃E1增殖㊁分化㊁矿化和Wnt 通路的影响
尚　丹,王　辉,韩　晔,赵　冲
[摘要]目的:探讨木犀草素对小鼠体外培养前成骨细胞MC3T3⁃E1增殖㊁分化和矿化及Wnt 通路的影响㊂方法:在体外培养的MC3T3⁃E1s 培养基中加入木犀草素0.25~8.00μmol /L 培养12㊁24和48h,以洛伐他汀0.04μmol /L 作为阳性对照,采用细胞计数试剂盒法检测细胞增殖情况;用碱性磷酸酶(ALP)试剂盒检测细胞内ALP 的活性;茜素红S 染色法检测细胞矿化能力;采用实时荧光定量反转录PCR 法检测细胞Ⅰ型胶原㊁骨钙素㊁低密度脂蛋白受体相关蛋白5(Lrp5)㊁β⁃连环素㊁护骨素/细胞核因子κB 受体活化因子配体mRNA 表达水平㊂结果:木犀草素可以剂量依赖性和时间依赖性地促进成骨细胞MC3T3⁃E1增殖(P <0.05~P <0.01);木犀草素(2.00㊁4.00和8.00μmol /L)可以剂量依赖性地促进MC3T3⁃E1成骨细胞ALP 活性,增强MC3T3⁃E1成骨细胞矿化能力并上调MC3T3⁃E1成骨细胞中Ⅰ型胶原㊁骨钙素㊁Lrp5㊁β⁃连环素和护骨素/细胞核因子κB 受体活化因子配体mRNA 表达㊂结论:木犀草素2.00㊁4.00和8.00μmol /L 可以促进MC3T3⁃E1细胞的增殖㊁分化与矿化及Wnt 通路中Lrp5和β⁃连环素mRNA 的表达㊂
[关键词]木犀草素;成骨细胞;增殖;分化;Wnt 通路
[中图法分类号]R 282.71 [文献标志码]A DOI :10.13898/ki.issn.1000⁃2200.2017.01.012
Effect of luteolin on the proliferation ,differentiation ,
mineralization and Wnt pathway of MC3T3⁃E1osteoblasts in vitro
SHANG Dan,WANG Hui,HAN Ye,ZHAO Chong
(Department of Pharmacy ,Anshan Central Hospital ,Anshan Liaoning 114001,China )
[Abstract ]Objective :To investigate the effects of luteolin on the proliferation,differentiation,mineralization and Wnt pathway of MC3T3⁃E1osteoblasts in vitro .Methods :The MC3T3⁃E1osteoblasts were cultured with the 0.25to 8.00μmol /L of luteolin for 12,24and 48h in vitro.The 0.04μmol /L of lovastatin treating cell was used as the positive control group.The proliferation,activity of alkaline phosphatase(ALP)and mineralization capacity of MC3T3⁃E1osteoblasts in vitro were detected by cell counting kits⁃8method,alkaline phosphatase kit and Alizarin Red S staining,respectively.The mRNA expressions of type Ⅰcollagen,osteocalcin,low density lipoprotein receptor related protein 5(Lrp5),β⁃catenin,osteoprotegerin and nuclear factor κB⁃activating factor receptor ligands were quantified by real⁃time reverse transcription PCR(qPCR).Results :Luteolin could improve the proliferation of MC3T3⁃E1osteoblasts with time⁃and dose⁃dependence(P <0.05to P <0.01).Luteolin could promote the activity of ALP,strengthen the mineralization capacity and upregulate the mRNA expressions of type Ⅰcollagen,osteocalcin,Lrp5,β⁃catenin,osteoprotegerin and nuclear factor κB⁃
activating factor receptor ligands in MC3T3⁃E1s with dose⁃dependence in vitro .Conclusions :The 2.00,4.00and 8.00μmol /L of luteolin can promote the proliferation,differentiation and mineralization and the expressions pf Lrp5and β⁃catenin in MC3T3⁃E1osteoblasts.
[Key words ]luteolin;osteoblast;proliferation;differentiation;Wnt pathway
成骨细胞(osteoblast,OB)介导的骨形成和破骨细胞介导的骨吸收构成的骨重建在骨代谢中起着重要作用㊂当两者间的平衡被打破导致骨吸收大于骨形成时,即表现出以骨量减少,骨显微结构破坏为特征的骨流失现象[1]㊂因此,抑制破骨吸收或者促进OB 骨形成是预防和治疗骨质疏松的有效策略㊂文献[2-5]报道,许多黄酮类化合物对骨质疏松具有治
疗和预防作用㊂木犀草素是一种具有抗炎㊁抗肿瘤㊁抗氧化等类雌激素样活性作用的天然四羟基黄酮类化合物㊂近年有研究[2-3]报道,木犀草素有对骨流失和对破骨细胞分化的抑制作用,但忽略了对骨形成的研究,而且木犀草素的骨保护机制也尚不明确㊂CHOI [5]研究提示,木犀草素可能通过刺激OB 功能调节炎性介质㊂本实验着重研究木犀草素对小鼠前
OB 系MC3T3⁃E1s 增殖分化和矿化及成骨分化中重要的Wnt 信号通路的影响,以期为木犀草素应用于临床骨质疏松的预防和治疗提供理论参考依据㊂
1　材料与方法
1.1　细胞株及药品　MC3T3⁃E1细胞购于中科院上海细胞研究所㊂木犀草素购于中国药品生物制品检定所㊂洛伐他汀购于大连绿竹试剂公司㊂1.2　试剂　DMEM培养基和胰蛋白酶(Gibico公司);DMSO(Sigma公司);Triton X⁃100和维生素C (Amresco公司);β⁃甘油磷酸钠(Solarbio公司);胎牛血清(天津市灏洋生物制品科技有限责任公司);碱性磷酸酶(ALP)活性分析试剂盒(南京建成科技有限公司);BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天生物技术研究所);RNAiso Plus(Total RNA提取试剂)和Real time RT⁃PCR引物及其试剂盒[宝生物工程(大连)有限公司]㊂茜素红S染色液(上海远慕生物科技有限公司);细胞技术试剂盒(CCK)⁃8[上海同仁(DOJINDO)化学研究所]㊂
1.3　实验方法　
1.3.1　MC3T3⁃E1细胞培养及成骨诱导　MC3T3⁃E1培养于含10%FBS的DMEM培养基中,于37℃㊁5%CO2细胞培养箱中培养㊂采用维生素C 50μg/μL㊁β⁃甘油磷酸钠10nmol/L的DMEM细胞培养液作为条件培养液诱导成骨分化㊂实验分为对照组㊁木犀草素组(0.25㊁0.50㊁1.00㊁
2.00㊁4.00和8.00μmol/L和洛伐他汀组(0.04μmol/L)㊂1.
3.2　MC3T3⁃E1细胞增殖能力检测　采用CCK⁃8法检测细胞增殖效应,以1×105的密度接种细胞于96孔培养板中,待细胞融合率至80%时,加入木犀草素0.25㊁0.50㊁1.00㊁2.00㊁
4.00和8.00μmol/L 或洛伐他汀0.04μmol/L分别培养12㊁24和48h 后,各孔加入10μL的CCK⁃8溶液㊂37℃孵育2h,酶标仪测定450nm处吸光度㊂
1.3.3　ALP活性检测　以1×106的密度接种细胞于24孔细胞培养板中,待细胞贴壁后,加入上述备好的条件培养液,在37℃㊁5%CO2的细胞培养箱中继续培养7d,弃原细胞培养液,加入木犀草素
2.00㊁4.00和8.00μmol/L,洛伐他汀0.04μmol/L 培养24h,弃原培养液,用PBS洗2次,用体积分数为0.2%的Triton X⁃100裂解细胞后于12000g㊁4℃离心15min,取上清液㊂按照ALP试剂盒说明书测定ALP含量,并用BCA试剂盒测定蛋白总含量,按照ALP试剂盒说明书中提供的公式计算单位蛋白中ALP含量㊂
1.3.4　矿化能力检测⁃茜素红S染色　以1×106的密度接种细胞于24孔细胞培养板中,待细胞贴壁后,加入上述备好的条件培养液,在37℃㊁5%CO2的细胞培养箱中继续培养24d,弃原细胞培养液,加入木犀草素
2.00㊁4.00和8.00μmol/L,洛伐他汀0.04μmol/L培养24h,采用茜素红S染色法进行钙化结节组织化学染色㊂弃培养液,PBS洗2遍, 10%甲醛固定10min,加入0.1%茜素红染色剂(pH 4.2),37℃孵育1h,倒置显微镜下观察矿化结节的形成情况,并拍照㊂
1.3.5　Real Time RT⁃PCR检测细胞骨转换相关mRNA表达　用RNAiso Plus试剂提取细胞总RNA,使用反转录试剂盒[PrimeScript TM RT reagent Kit With gDNA Eraser(Perfect Real Time)]将总RNA反转录为cDNA㊂引物基因序列见表1,用扩增反应试剂盒[SYBR®Premix Ex Taq TM(Tli RNaseH Plus)reagent Kit]进行扩增,反应结束后根据Ct值,采用2-△△Ct定量分析法,以甘油醛⁃3⁃磷酸脱氢酶(GAPDH)作为内参基因进行计算和统计㊂骨转换相关mRNA包括Ⅰ型胶原(COL⁃Ⅰ),骨钙素(OCN),低密度脂蛋白相关受体蛋白5(Lrp5),β⁃连环素(β⁃catenin)和护骨素(OPG)/细胞核因子κB 受体活化因子配体(RANKL)㊂
表1　Real time RT⁃PCR引物序列
基因引物序列(5′to3′)产物/bp Lrp5上游引物:CTG CCA GGA TCG CTC TGA TG100下游引物:ACA CTG TTG CTT GAT GAG GAC ACA C
β⁃catenin上游引物:GCC ACA GGA TTA CAA GAA GC171下游引物:CCA CCA GAG TGA AAA GAA CG
OPG上游引物:AGA CCA TGA GGT TCC TGC AC131下游引物:AAA CAG CCC AGT GAC CAT TC
RANKL上游引物:GGC CAC AGC GCT TCTC AG141下游引物:TGA CTT TAT GGG AAC CCG AT
COL⁃Ⅰ上游引物:GCA TGG CCA AGA AGA CAT CC83下游引物:CCT CGG GTT TCC ACG TCT C
OCN上游引物:CTG ACA AAG CCT TCA TGT CCA A59下游引物:GCG CCG GAG TCT GTT CAC TA GAPDH上游引物:TGG ATT TGG ACG CAT TGG TC211下游引物:TTT GCA CTG GTA CGT GTT GAT
1.4　统计学方法　采用方差分析和q′检验㊂
2　结果
2.1　木犀草素处理12、24和48h时MC3T3⁃E1细胞增殖的影响　与对照组比较,木犀草素1.00~ 8.00μmol/L作用12h均产生明显促增殖作用(P <0.01),洛伐他汀促增殖作用不明显(P>0.05)㊂
木犀草素作用24h时,促增殖作用增强,木犀草素0.50~8.00μmoL/L均产生促增殖作用(P< 0.01),洛伐他汀亦有促增殖作用(P<0.05)㊂木犀草素0.50~8.00μmol/L作用48h产生促增殖作用(P<0.05~P<0.01)㊂洛伐他汀亦有促增殖作用(P<0.01)(见表2)㊂因此,我们选取木犀草素2.00㊁4.00和8.00μmol/L作用24h作为实验条件㊂
　表2　木犀草素处理12㊁24和48h对MC3T3⁃E1细胞增殖
的影响(n i=5;x±s)分组吸光度
　12h 24h 48h　对照组0.430±0.0970.468±0.0300.455±0.022
木犀草素组/(μmol/L)
　0.250.515±0.1100.493±0.0640.512±0.052
　0.500.523±0.0820.558±0.008**0.553±0.029*
　1.000.627±0.154**0.615±0.056**0.602±0.115**
　2.000.636±0.039**0.642±0.017**0.798±0.079**　4.000.637±0.023**0.710±0.075**0.837±0.079**　8.000.870±0.049**0.916±0.047**0.970±0.071**洛伐他汀0.04μmol/L组0.470±0.0590.546±0.025*0.638±0.011**　F12.8148.8236.81
　P<0.01<0.01<0.01　MS组内0.0080.0020.004
q′检验:与对照组比较*P<0.05,**P<0.01
2.2　ALP活性结果　MC3T3⁃E1细胞在木犀草素8.00μmol/L时培养24h,ALP活性明显高于对照组(P<0.01)(见表3)㊂
　表3　木犀草素培养24h对MC3T3⁃E1细胞ALP活性的影响(n i=4;x±s)
分组ALP活性/(U/g protein)F P MS组内对照组7.68±3.55
木犀草素组/(μmol/L)
　2.009.64±1.37
　4.0010.18±1.1510.92<0.018.139　8.0019.41±4.68**
洛伐他汀0.04μmol/L组8.82±1.73
q′检验:与对照组比较**P<0.01
2.3　矿化能力结果　诱导培养24d时,对照组钙化结节明显减少,茜素红染色较浅,给药组形成较多的成熟钙化结节,着色较深,其中高剂量组的钙化结节最多,面积最大㊂洛伐他汀组钙化结节形成亦较对照组大(见图1)㊂
2.4　mRNA表达情况　木犀草素8.00μmol/L组COL⁃ⅠmRNA表达高于对照组(P<0.05)㊂洛伐他汀亦明显上调了COL⁃ⅠmRNA表达(P<0.01)㊂木犀草素2.00㊁4.00和8.00μmol/L组及洛伐他汀组OCN mRNA均高于对照组(P<0.05~P<0.01) (见表
4)㊂
　表4　木犀草素培养24h对MC3T3⁃E1细胞成骨分化相关COL⁃Ⅰ和OCN mRNA的影响(n i=3;x±s)
分组COL⁃ⅠOCN
对照组 1.00±0.08 1.00±0.11
木犀草素组/(μmol/L)
2.00 1.21±0.17 1.60±0.31*　4.00 1.57±0.19 2.83±0.50**　8.00 2.45±0.24*
3.78±0.11**洛伐他汀0.04μmol/L组 3.81±0.99** 1.82±0.39*　F17.88 5.71
　P<0.01<0.01
　MS组内0.222 2.42
q′检验:与对照组比较*P<0.05,**P<0.012.5　OPG/RANKL mRNA比值的结果　与对照组比较,木犀草素8.00μmol/L组上调了OPG mRNA 的表达(P<0.05),木犀草素4.00和8.00μmol/L 组均下调RANKL mRNA的表达(P<0.01),而木犀草素2.00㊁4.00和8.00μmol/L组均使OPG/ RANKL mRNA比值上升(P<0.05~P<0.01)㊂洛伐他汀也明显上调了OPG/RANKL mRNA的比值(P<0.01)(见表5)㊂
2.6　Wnt通路中Lrp5和β⁃catenin mRNA的结果　与对照组比较,木犀草素4.00和8.00μmol/L上调了Lrp5的表达(P<0.05~P<0.01),而2.00㊁4.00和8.00μmol/L组均明显上调了β⁃catenin mRNA
的表达(P<0.01)㊂洛伐他汀明显上调了β⁃catenin mRNA的表达(P<0.01),但对Lrp5mRNA无明显上调作用(P>0.05)(见表6)㊂
　表5　木犀草素培养24h对MC3T3⁃E1细胞OPG/RANKL mRNA比值的影响(n i=3;x±s)
分组OPG RANKL OPG/RANKL 对照组 1.00±0.10 1.00±0.03 1.00±0.22
木犀草素组/(μmol/L)
2.00 2.13±0.980.80±0.23 2.73±0.42*　4.00 2.22±0.890.47±0.31* 5.54±1.38**　8.00
3.51±0.73*0.44±0.08*8.37±0.51**洛伐他汀0.04μmol/L组 2.73±1.140.79±0.20 3.52±0.61**　F 3.52
4.3743.51　P<0.05<0.05<0.01　MS组内0.7190.0390.552 q检验:与对照组比较*P<0.05,**P<0.01
　表6　木犀草素培养24h对MC3T3⁃E1细胞Wnt通路中Lrp5和β⁃catenin mRNA的影响(n i=3;x±s)
分组Lrp5β⁃catenin
对照组 1.00±0.09 1.00±0.14
木犀草素组/(μmol/L)
　2.00 1.34±0.2520.44±2.45**　4.00 1.48±0.13*25.99±7.98**　8.00 1.63±0.15**47.18±7.63**洛伐他汀0.04μmol/L组 1.37±0.2017.20±1.38**　F 5.4332.23
　P<0.05<0.01
　MS组内0.03025.965
q′检验:与对照组比较*P<0.05,**P<0.01
3　讨论
黄酮类天然化合物木犀草素对骨代谢的效果已经有研究[2-5]报道,MC3T3⁃E1细胞株因其保留着OB的各种生物学特性,如ALP的分泌㊁COL⁃Ⅰ合成和基质矿化等可成为较有价值的研究药物对OB作用及机制的体外细胞模型[6]㊂
本文CCK⁃8实验结果表明,木犀草素对MC3T3⁃E1小鼠前OB的促增殖作用具有时间依赖型和剂量依赖性,表现在木犀草素1.00μmol/L浓度以上给药12h时,均能显著促进OB的增殖(P< 0.01),而此浓度以下的木犀草素则无此作用(P> 0.05)㊂而且随着给药时间的增加,较低浓度的木犀草素(0.50μmol/L)亦有促增殖作用(P<0.05)㊂结合促增殖实验结果,我们选取了2.00㊁4.00和8.00μmol/L3个梯度浓度和24h作用时间做了木犀草素对MC3T3⁃E1小鼠前OB分化和矿化等相关的后续实验㊂
ALP是OB分化早期的标志,可以促进细胞成熟和钙化;COL⁃Ⅰ也是由OB分泌的胶原蛋白,是成骨分化的重要标志;OCN是维持骨组织正常矿化的骨质钙化必需因子,因此,OCN和骨矿化结节的形成则是OB晚期分化的标志[1]㊂本研究结果表明,木犀草素促进OB MC3T3⁃E1ALP的活性和OCN, COL⁃ⅠmRNA表达,增强MC3T3⁃E1矿化能力(矿化结节面的增大和数量的增多),提示木犀草素能促进OB分化和矿化过程㊂
OPG/RANKL是评价骨形成和骨吸收平衡的重要标志,而骨重建的平衡维持着骨量的稳定,OB可以分泌OPG和RANKL,而OPG与RANKL竞争性结合RANK,是RANKL的诱饵受体[1]㊂本研究结果表明,MC3T3⁃E1经适宜浓度的木犀草素培养24h,能显著上调细胞内OPG/RANKL mRNA的比值,表明木犀草素可通过调控OPG和RANKL mRNA的表达而调节骨重建过程㊂
细胞内Wnt/Lrp5/β⁃catenin通路是Wnt信号转导通路中经典的途径,Wnt可与Lrp5组成复合受体调控β⁃catenin在细胞质中的积累,因此两者是Wnt 通路的关键因子,其表达水平可反映对骨调节作用和机制[7]㊂本实验结果表明,木犀草素可以通过上调Lrp5和β⁃catenin mRNA表达水平激活MC3T3⁃E1细胞Wnt通路㊂
[参考文献]
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(本文编辑　马启)。