tim-3在肝癌细胞上皮间质转化及转移中的作用机制

atoma cells. Method: Culture normal liver cell LO2 and hepatocellular carcinoma cell SMMC-7721,
detection of Tim-3 expression by RT-PCR.The hepatocellular carcinoma cells were divided into
three groups, experimental group control group HCC cells without transfection; experimental group:
HCC transfected with Tim-3 siRNA, low expression of Tim-3; positive control group: HCC trans-
tim3在肝癌细胞上皮间质转化及转移中的作用机制12方法121细胞培养将肝细胞lo2和smmc7721在培养瓶中加入025trypsinedta溶液1ml25cm2冤袁对细胞进行消化袁离心后袁弃去上清液袁加入适量完全培养基袁分瓶后置于37益袁5co2培养箱中袁取对数生长期细胞为实验对象遥122细胞转染选取对数生长期细胞作为实验对象袁分成不同组袁应用lipofectamine2000进行转染袁实验组转染tim3sirna袁阳性对照组转染pex3htim3过表达质粒袁对照组未接受转染遥123rtpcr检测通过rtpcr检测各分组细胞tim3尧ecadherin尧ncadherin尧mmp9尧twist1尧slug尧snail尧smadmrna的表达遥根据试剂盒说明书步骤提取细胞总rna袁然后按照pcr反应试剂盒说明进行反转录和pcr扩增遥pcr引物序列见表1遥124westernblot检测通过westernblot检测各分组细胞tim3尧ecadherin尧ncadherin尧mmp9尧twist1尧slug尧snail尧smad蛋白表达细胞裂解后提取总蛋白袁经过page电泳转于pvdf膜上袁血清蛋白封闭袁漂洗后加入一抗尧二抗袁免疫印迹增强化学发光法显像并记录袁应用imageproplus60图像分析袁通过对比灰度值袁计算各蛋白的相对表达量遥125transwell小室细胞迁移侵袭实验将不同分组肝癌细胞用pbs洗3遍袁将待测细胞胰酶处理袁取200滋l袁调至细胞浓度为5伊104ml袁接种到上室袁37益袁5co2共培养24h遥取出transwell小室袁用棉棒清除未穿透微孔滤膜的细胞遥将tran鄄swell放入95的乙醇溶液中袁静置15min袁然后将transwell小室放入01的结晶紫溶液中袁静置10min袁pbs清洗3遍遥染色后相差显微镜下200倍袁每张膜自上而下随机取10个视野袁计数每个视野内的穿过的细胞数遥实验重复3次遥13统计学处理采用spps160软件袁计量资料以x依表示袁两组之间比较采用检验袁相关性分析采用pearson相关分析法袁约005表示差异有统计学意义遥2结果21rtpcr检测肝癌细胞smmc7721及正常肝细胞lo2tim3mrna的表达smmc7721和lo2tim3mrna表达水平分别为185依021和102依019袁tim3mrna在肝癌细胞系smmc7721表达明显高于正常肝细胞lo2袁
中国现代普通外科进展 2019 年 9 月 第 22 卷 第 9 期
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揖ABSTRACT铱 Objective: To investigate the relationship between Tim-3 and epithelial-mes-
enchymal transition(EMT) in hepatocarcinoma cells and its effect on invasion and metastasis of hep-
Mechanism of Tim -3 in epithelial -mesenchymal transition of hepatocellular carcinoma
LIN Hua-peng, DUAN Yan-fei , MA Chang-lin, QIAO Sen
咱基金项目暂 山东省医药卫生科技发展计划渊2016WS0147冤 咱作者简介暂 林华鹏渊1982-06耀 冤袁男袁山东济宁人袁硕士袁主治医师袁研究方向院肝脏肿瘤遥 E-mail: feipeng923@ 咱通讯作者暂 乔森渊1959-04耀 冤袁男袁山东济宁人袁博士袁主任医师袁研究方向院肝脏肿瘤遥 E-mail: 274950599@
济宁市第一人民医院 肝胆外科 （山东 济宁 272000）
揖摘要铱 目的院探讨 Tim-3 与肝癌细胞发生上皮间质转化（EMT）的关系及对肝癌细胞侵袭和转移能力的 影响。方法院 培养正常肝细胞 LO2 和肝癌细胞 SMMC-7721，RT-PCR 检测 Tim-3 表达差异，将 SMMC-7721 分为 3 组，对照组：未接受转染的 SMMC-7721；实验组：转染 Tim-3 siRNA，细胞低表达 Tim-3；阳性对照组：转染 PEX-3-hTim-3 过表达质粒，细胞高表达 Tim-3。应用 RT-PCR、Western blot 检 测 3 组 肝 癌 细 胞 Tim-3 及 EMT 相 关 基 因 ：E-cadherin、N-cadherin、MMP-9、Twist1、Slug、 Snail、Smad mRNA 和蛋白的表达。通过 Transwell 小室侵袭实验检测 3 组肝癌细胞迁移和侵袭能力改 变；分析 Tim-3 表达与 EMT 相关基因表达的相关性。结果院（1）与正常肝细胞 LO2 比较，Tim-3 在肝癌 细胞中高表达（ <0.05）；（2）RT-PCR 和 Western bolt 结果提示，实验组上皮标志物 E-cadherin 表达 较对照组明显上升（ <0.05），而间质标志物 N-cadherin、MMP-9、Twist1、Snail、Slug、Smad 表达较对 照组下降 （ <0.05），提示 EMT 受到抑制；阳性对照组中 E-cadherin 表达较对照组下降（ <0.05）， N-cadherin、MMP-9、Twist1、Snail、Slug、Smad 表达较对照组上升 （ <0.05），促进了肝癌 EMT；（3） Transwell 迁移实验中，实验组与对照组和阳性对照组相比较，肝癌细胞迁移和侵袭细胞数明显减少，3 组之间比较差异均有统计学意义（ <0.05），实验说明 Tim-3 表达水平的改变，影响肝癌的迁移和侵袭 性；（4）Tim-3 的表达与 EMT 标志物的表达做相关性分析显示，Tim-3 的表达与 E-cadherin 的表达呈 负相关（ <0.05），与 N-cadherin、MMP-9 、Twist1、Snail、Slug、Smad 的表达呈正相关（ <0.05）。结 论院Tim-3 是肝癌细胞 EMT 的潜在诱导者，抑制 Tim-3 的表达，同时抑制肝癌细胞 EMT 的发生，肝癌 细胞迁移和侵袭能力下降。因此，Tim-3 有望成为今后的临床抗肿瘤药物新的治疗靶点，用于改善和评 估患者预后。 揖关键词铱 肝癌细胞 上皮间质转化 T 细胞免疫球蛋白及黏蛋白分子 3 上皮型钙黏附蛋白 神经型钙黏 附蛋白 揖中图分类号铱 R735.7 揖文献标识码铱 A doi: 10.3969/j.issn.1009-9905.2019.09.001 揖文章编号铱 1009-9905（2019）09-0673-05
fected with PEX-3-hTim-3 high expression plasmid, high expression of Tim-3. RT-PCR and West-
ern blot were used to detect the expression of mRNA aes
中国现代
普通外科进展
Chin J Curr Adv Gen Surg
窑 基 础 研 究 窑 Experimental Research窑 2019 年 9 月 第 22 卷 第 9 期 Sep.2019 Vol.22 No.9
Tim-3 在肝癌细胞上皮间质转化 及转移中的作用机制
林华鹏 段艳飞 马长林 乔森