青蒿素对乳腺癌MT40细胞的生长抑制作用及CD71表达的影响和后遗效应!

第47卷第3期第295页2018年6月
华中科技大学学报（医学版）
A c ta M e d U n iv S c iT e c h n o lH u a zh o n g
Vol. 47 No. 3 P. 295
Jun. 2018
青蒿素对乳腺癌M T40细胞的生长抑制作用及
C D71表达的影响和后遗效应
佘和平，崔乐，王必蓉，刘键桦，王坤
武汉市第四医院华中科技大学同济医学院附属普爱医院甲乳外科，武汉430033
摘要：目的探讨不同浓度的青蒿素对乳腺癌MT40细胞的生长抑制作用和CD71表达的影响及后遗效应。

方法将处于对数生长期的MT40细胞分为20、40、60、80pm ol/L青蒿素实验组及不加任何药物的阴性对照组、10^m〇l/L 丝裂霉素的阳性对照组，采用流式细胞仪检测各组MT40细胞凋亡及细胞周期变化及CD71的表达，绘制各实验组后遗 细胞生长曲线，计算细胞倍增时间，实验重复3次。

结果20、40、60、80/mol/L青蒿素实验组细胞凋亡率分别为（6.81 ±1.28)%、（10.55±3.49)%、（17.12±3.73)%、（19.50±3.70)%，阴性对照组为（1.15±0.21)%，阳性对照组为（2.45 ±0.53)%，青蒿素明显提高MT40细胞凋亡率（均P〈0.05)。

不同浓度青蒿素作用于MT40细胞后，Gf)/Gi期细胞增 加，C/M及S期细胞减少（均P〈0.05)。

20、40、60、80/mol/L青蒿素实验组细胞CD71表达率分别为（57.42 土
3.45)%、（50.38±3.22)%、（7.23±2.35)%、（3.27±2.86)%，阴性对照组为（62.90±2.4 1)%，阳性对照组为（60. 13
±2. 89)%，青蒿素抑制了 MT40细胞CD71的表达（均P〈0.05)。

20、40、60、80/川〇1凡青蒿素实验组后遗细胞生长曲 线峰值后移（F= 11.86，P〈0.01)。

各组后遗细胞倍增时间，阴性对照组和阳性对照组均为0.59 d，20、40、60、80/mol/ L青蒿素组分别为0.61、0.65、0.71、0.78 d。

结论青蒿素对乳腺癌MT40细胞具有诱导细胞凋亡，阻滞细胞于G。

/G 期，下调细胞CD71表达的作用，并具有使MT40细胞倍增时间延长的后遗效应。

关键词：青蒿素；CD71;乳腺癌；细胞凋亡；细胞周期阻滞；后遗效应
中图分类号：R737.9 DOI：10.3870/j.issn. 1672-074 . 2018. 03.008
Cytotoxic Effect of Artemisinin on Breast Cancer MT40 Cells
and Expression of CD71 and Residual Effect
Yu Heping,Cui Le?Wang Birong et al
Department o f Thyroid and Breast S u rg ery，Wuhan Fourth Hospital P u a i H osp ita l，Tongji Medical C ollege，
Huazhong University o f Scienceand T echnology，Wuhan 430033，China
Abstract Objective To study the cytotoxic effect of Artemisinin in different concentration on breast cancer MT4 0 cells and expression of CD7 1and residual effect in vitro.Meth o ds M T40 cells in logarithmic growth phasewere divided into 20，40，60 and 80 ^mol/L concentration Artemisinin groups and negative control group»positive control group. was used to detect apoptosis a nd cell cycle change and the expression of CD71 of breast cancer MT'40 cells after being treated by Artemisinin. The growth curve was drawn and the doubling time of surviving cells calculate. T'he experiment was repeated 3 times. Results Apoptosis rate of MT40 cells in 20,40，60 and 80 /imol/L concentration Artemisinin groups was (6. 81 土
.28)%，（ 10■55± 3. 4 9 ) %，（ 1 7. 12 ± 3. 73 ) % and ( 1 9. 50 ± 3. 70) %，respectively; the apoptosis rate of negative control and positive control was 15 ± 0■21 ) % ancK2. 45 ± 0. 53) %，respectively; Artemisinin significantly increased apoptosis rate of MT40 cclls(all P〈0. 05.). After M T40 ccllswcre treated byArtemisinin in different concentration，the cells at G0/’(G increased and those at G/M a n d S dccrcascd(all P〈0. 05)The expression of CD71 ofM T4 0 cells was inhibited byArtemisinin in differ­ent concentration，he expression r ateof CD7 1was ( 57. 42 ± 3. 4 5 ) %，（ 50. 38 ± 3. 22 ) %，（ 47. 23 ± 2. 35 ) % and ( 43. 27 土2. 86.) %，respectively in 20，40，60 and 80im o l/’L Artemisinin group，respectively; the expression rate of CD71in negative con­trol was(62. 90 ± 2. 4 1.) %，the expression rate of CD7 1of positive controlwas( 60. 13 ± 2. 89.) % ; Artemisinin inhibited the ex­pression of CD7 1ofM T40cells in different conccntration(all P〈0. 05.). The peak of the growth curve of surviving cells in each Artemisinin groups moved backwards»the doubling time of the surviving cells in each groups was 0. 59，. 59，. 6165，. 71，
0. 78 days respectively in negative control，positive control and 20，40，60，80 /imol/L Artemisinin group，respectively.
C on clusio n Artemisinin can induce apoptosis，block MT40 cells at (G,/’(G phase and depress the expression of CD71and extend
the doubling time in surviving cells in vitro.
Key w o r d s Artemisinin; CD71; breast cancer; apoptosis; ccll-cyclc arrest; residual effect
乳腺癌是女性发病率最高的恶性肿瘤，每年新 发病例超过100万，死亡率为女性恶性肿瘤的第2位[1]。

即使经过综合治疗，仍有超过30%的乳腺癌 患者最终会出现肿瘤复发或转移[2]。

乳腺癌患者一
余和平，男，1973年生，医学硕士，主治医师，E-niail: yuhepingl2 @ 163 com 旦出现转移，基本无法再采用手术治疗，还可能出现 化疗药物耐药，预后很差，从出现肿瘤转移到死亡的 中位生存时间只有2年左右[3]。

青蒿素是由我国研 制的抗疟药，近年研究发现其具有抗多种肿瘤作用及耐药逆转作用。

本研究探讨不同浓度青蒿素对乳 腺癌M T40细胞凋亡、生长周期及CD71表达的影
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响以及对其产生的后遗效应，为乳腺癌的治疗寻找新途径。

1材料与方法
1. 1试剂及仪器
青蒿素购于陕西汇生医药科技有限公司，丝裂 霉素（MMC)购于浙江海正药业股份有限公司，高糖 D M E M培养液购于H Y C I O N E公司，胎牛血清(FCS)购于杭州四季青公司，噻唑蓝（M T T)购自 Am resco公司，小鼠CD71 —抗购于B D公司，M T40细胞由苏州大学附属医院提供。

主要实验仪器包括：倒置显微镜（重庆重光仪器 公司），LD4-2台式离心机（北京医用离心厂），电热 恒温水浴箱（北京长风仪器厂），BB 16H F二氧化碳 气体培养箱（香港力新仪器公司）超净工作台（北京 长城空气净化工程公司）Multiskan Ascent全自动 酶标仪（芬兰 Thermo Labsysterms 公司），UFR()-01纯水装置（军事医学科学院卫生装备研究所）流 式细胞仪（FACSCalibur S E,美国B D公司）。

1.2实验方法
1.2.1 细胞培养 M T40细胞以含10%胎牛血清 的D M E M培养液加双抗，37°C饱和湿度、5%02条 件下培养。

2 d换培养液1次，胰蛋白酶消化、传代 和收集细胞。

1.2.2 实验分组及细胞处理方法按照干预方式将实验分为3组：①阴性对照组，不加任何药物；② 青蒿素实验组，按照处理细胞的青蒿素浓度分为4 个亚组d O y m o l/L青蒿素组、40,抓1〇1/1青蒿素组、60;imol/L青蒿素组、80;imol/L青蒿素组；③ 阳性对照组，采用临床针对复发乳腺癌化疗常用的丝裂霉素作为阳性对照，浓度为10fmi〇1/L[]。

各 组实验重复3次。

12. 3 流式细胞仪检测各组细胞周期及凋亡率
将生长状态良好的M T40细胞接种于6孔培养板 中，细胞密度为5X105/孔，加培养液至体积2m L，培养12h。

细胞依上述实验分组进行相应处理，继 续培养4 8h后，消化，分别收集于离心管中（细胞密 度达5X1()6/m U，制备单细胞悬液、洗涤、固定，4°C过夜，P I染色、避光孵育30min，上机检测细胞周期。

实验重复3次。

1 2. 4 流式细胞仪检测各组M T40细胞CD71表 达按照1 2. 3方法处理各组细胞后消化，分别收 集于离心管中（细胞密度达5X107mL)，制备单细 胞悬液、洗涤、固定，4°C过夜，CD71-P E染色、避光 孵育30 min,上机检测CD71表达。

实验重复3次。

1.2.5各组后遗M T40细胞生长曲线测定采用细胞计数法。

按照1 2. 3方法处理各组细胞后，更 换无药物培养液继续培养24h,各孔细胞分别接种 于24孔培养板中，每孔含细胞1X1(0个，每孔加培 养液至体积1m L,每24h消化各板3孔并进行细 胞计数，每次计数3次，取平均值，连续观察8 d。

每 24h给未计数各孔换液。

以时间为横轴，细胞数 (对数）为纵轴，描记于半对数坐标，连成曲线即成生 长曲线。

按下式计算各组细胞倍增时间：T。

=t X
lg2/(lgNt—IgN。

），其中t为培养时间，Nt为最终细 胞数，N0为初始细胞数。

1.3统计学方法
采用统计软件SPSS 13. 0对数据进行处理。

实 验结果以均数士标准差（无± d表示，组间均数比较采用方差分析，采用L S D进行组间两两比较，以P <0. 05为差异有统计学意义。

2结果
2.1青蒿素对乳腺癌M T40细胞凋亡及周期的影响
用流式细胞仪检测各组MT40细胞凋亡及细胞 周期变化发现，各组MT40细胞凋亡率差异有统计学 意义（F=14. 32，P<0. 01)且青蒿素明显提高MT40 细胞凋亡率。

与阳性及阴性对照组相比较，不同浓度 青蒿素作用于乳腺癌MT40细胞后，仏/01期细胞增 加，G2/M及S期细胞减少。

见表1及图1。

表1各组细胞凋亡率及细胞周期比例(1±5，％，《 = 3)
Table 1 Apoptosis rate and cell proportion in each cell cycle phase in each g ro u p(x士5，%，?z= 3)
组别凋亡率G n/G丄期S期G2/M期阴性对照组115 士 0. 2158. 12士3. 5 69. 98士3. 2230. 28士214阳性对照组245士0. 5359. 03士3. 1210. 23 士26429. 24士216
20ynio 1/ L青蓄素组6. 8丄士 128* △64. 23 士208* △8. 12士204* △25. 32士225* △4 0y m o1/ L青蒿素组丄0. 55士3. 49* △68. 3丄士204* △7. 3丄士187* △24. 4丄士233* △
60/aniol/ L青蓄素组17. 12士3. 73* △70. 33士 198* △6. 84士196* △22. 63士199*^ 80ymo 1/ L青蒿素组19. 50士3. 70* △7205士267* △6. 05士 186* △20. 75士2. 07*^ F值14. 328.847.548.67
P值<0. 01<0. 01<0. 01<0. 01
与阳性对照组比较，*P<0.05;与阴性对照组比较，^^<0.05
余和平等.青蒿素对乳腺癌M T40细胞的生长抑制作用及CD71表达的影响和后遗效应• 297 •
图1流式细胞术检测各组M T40细胞凋亡及细胞周期
Fig. 1Cell apoptosis and cycle in each group detected by flow cytometry
2. 2青蒿素对乳腺癌M T40细胞C D71表达的影响
各组CD71表达率差异有统计学意义（F= 22. 25，P<0. 01)不同浓度青蒿素作用后可抑制乳 腺癌M T40细胞CD71的表达。

见表2及图2。

2.3青蒿素对乳腺癌M T40细胞后遗细胞生长曲线及细胞
倍增时间的影响
各组后遗细胞继续培养，绘制生长曲线如图3, 均呈S形，阴性对照组与阳性对照组后遗细胞生长曲线几乎重叠，20、40、60、80^〇!!〇1/1青蒿素组后遗 细胞生长曲线峰值后移CP=11.86，P<0.01)。

表2各组细胞C D71表达率(无士^%)
T ab l e 2 Expression rate of C D71(f士%)
组别C D71表达率（％)
阴性对照组62. 90士2. 41
阳性对照组60. 13士2. 89
20 p m o l/L青蒿素组57. 42 士 3. 45* A
40 y m o l/L青蒿素组50. 38士 3. 22 * A
60 y m o l/L青蒿素组47. 23士 2. 35 * A
80 y m o l/L青蒿素组43. 27士 2. 86 * A
与阳性对照组比较，*P<0.05;与阴性对照组比较，A P<0.05; F=22. 25,P<0.01
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MT40 FITG
阴性对照组
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MT40 FITG
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MT40 FITG
60 (imol/L青蒿素组
图2流式细胞术检测各组细胞C D71的表达
Fig. 2 Expression of CD71 in each group detected by flow cytometry
MT40 FITG
80 |imol/L
青蒿素组
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计算各实验组后遗细胞倍增时间，阴性对照组为0. 59d，阳性对照组为 0. 59d，20、40、60、80M mol/L 青蒿素组分别为0. 61、0. 65、0. 71、0. 78d。

图3各实验组后遗细胞生长曲线图
Fig.3 Growth curve of surviving cells in each groups
3讨论
在我国乳腺癌发病率占女性恶性肿瘤的7%〜10%，已经成为发病率最高的恶性肿瘤之一[5]，且发 病率还在逐年上升，成为严重威胁女性健康的“红颜 杀手”[]。

随着对乳腺癌研究的深入，目前一致认 为，乳腺癌是一种全身性疾病，手术治疗是乳腺癌治 疗的重要方法，标本病理检查结果对预后判断有重要意义。

目前乳腺癌临床手术切除的范围逐渐减小，综合辅助治疗的重要性越来越得到重视[7]。

而 一旦乳腺癌患者出现转移，基本无法再采用手术治疗，还可能出现化疗药物耐药，预后很差。

在乳腺癌 综合治疗中，抗肿瘤药物治疗占重要地位，但临床广 泛使用的抗肿瘤药物常有显著的毒副作用及易产生 耐药性等缺点。

因此，寻找对乳腺癌高效、低副作用 的治疗方法具有重要意义。

青蒿素是我国自主研制的抗疟药。

近年多项研 究发现，青蒿素对白血病、结肠癌、黑色素瘤、乳腺 癌、卵巢癌、前列腺癌等肿瘤细胞具有显著的杀伤作 用[8]，对耐药性乳腺癌有耐药逆转作用[]。

一般认 为其作用机制可能为与肿瘤细胞内Fe2+结合，引起 分子内过氧桥裂解产生活性自由基攻击细胞内膜系 统及氧化核糖核酸等生命物质，发挥迟滞细胞生长周期、减少肿瘤血管生成、致癌基因改变和肿瘤抑制 基因表达以及抗耐药性的作用[10]。

CD71为转铁蛋 白受体（T F R)，是一种95 k D的n型跨膜糖蛋白，主要表达于增殖细胞膜[1]，可与转铁蛋白结合，调 节细胞对Fe2+摄取，从而发挥调节细胞生长的作用。

在CD71介导下，Fe2+通过胞吞作用被细胞摄取，促进D N A的合成、细胞增殖及细胞内电子呼吸 链传递有序进行[12]。

研究显示，增殖活跃的非肿瘤 细胞和肿瘤细胞CD71的表达明显高于无增殖活性 细胞[3]。

Leplletier等[14]研究表明，非何杰金瘤细 胞CD71表达远高于正常B细胞；Dowlati等[15]研 究显示，肺癌组织CD71的表达与组织分化程度密切相关，低分化者CD71呈高表达，高分化者CD71 呈低表达；〇〇1^^等[16]认为，CD71的表达与肿瘤 基因激活有关。

CD71在肿瘤细胞的表达程度与其T N M分期、肿瘤分化程度、细胞异型程度等密切相 关，可反映肿瘤的增殖状况，与患者的生存期和肿瘤 远距离转移关系密切。

因此，降低肿瘤细胞CD71 的表达对肿瘤的综合治疗有重要意义。

丝裂霉素为 抗肿瘤抗生素，临床常用于复发及转移的乳腺癌治疗，其机制为与肿瘤细胞D N A交联反应产生抗肿瘤作用。

本研究发现，不同浓度青蒿素对乳腺癌M T40具有引起细胞凋亡作用，与阳性对照组相比，20、40、60、80M mol/L青蒿素组细胞凋亡率呈上升趋势，并且G。

/G1期细胞比例增加，G2/M及S期细 胞比例减少，差异有统计学意义，并随着青蒿素浓度 升高，细胞凋亡率及G0/G1期细胞比例呈现升高趋势，表明在20〜80 M mol/L浓度范围内，青蒿素引 起乳腺癌M T40细胞凋亡作用和阻滞细胞于G0/ &期作用呈浓度依赖趋势。

本研究还发现，青蒿素 在迟滞M T40细胞增殖的同时，还明显降低M T40 细胞CD71表达，在20〜80 M mol/L浓度范围内，随 着浓度的升高，降低CD71表达的趋势越明显。

另外，我们还发现，青蒿素对M T40细胞具有延长细胞倍增时间的后遗效应，经过青蒿素处理后遗留的M T40细胞生长曲线高峰明显后移，细胞倍增时间 延长，并且随着浓度的升高，延长后遗细胞倍增时间 作用越明显。

而丝裂霉素不具有阻滞细胞周期、降 低M T40细胞CD71表达的作用及延长M T40细胞 倍增时间的作用。

表明青蒿素对乳腺癌M T40细 胞具有抑制增殖、诱导凋亡的同时，还具有降低其恶 性程度的能力，而丝裂霉素不具有该能力。

从这个 角度来看，青蒿素对乳腺癌的治疗有明显优势。

总之，本研究表明，不同浓度青蒿素能导致乳腺 癌M T40细胞凋亡，迟滞细胞增殖，并能下调肿瘤组织CD71的表达，具有延长乳腺癌M T40细胞倍 增时间的后遗效应，具有重要临床意义。

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(2017-09-08 收稿）。