啤酒废酵母细胞破壁方法的研究

啤酒废酵母细胞破壁方法的研究
作者：孟国庆等
来源：《中国果菜》 2014年第12期
孟国庆王传宝朱陶张海丽王宜磊
（菏泽学院生命科学系，山东菏泽274000）
摘要院本文采用反复冻融法、超声波法、微波法、盐法、酶法、液氮研磨等方法对啤酒酵
母细胞进行破壁处理，对细胞破壁率、海藻糖得率和破壁时间进行分析比较，结果表明：微波
法的细胞破壁率（49%）和海藻糖得率（5.64%）最高，且时间（30min）最短。

通过对这6 种
破壁方法的研究，为啤酒废酵母的综合开发利用提供理论数据和技术条件。

关键词院啤酒废酵母；破壁方式；革兰氏染色；海藻糖
中图分类号院Q93-3 文献标志码院A 文章编号院1008-1038(2014)12-0030-05
啤酒废酵母全身都是宝，它含有丰富的蛋白质、核糖核酸、维生素B 族、脂类、多糖和酶
等多种营养成分和某些协调因子，具有多种生理功能。

随着啤酒产业的迅猛发展，啤酒废酵母
产量也与日俱增。

我国现有啤酒企业500 多家，年产啤酒3000 多万t，每年产啤酒废酵母
60~90 万t。

啤酒废酵母大都经过简单烘干作为饲料，没做进一步加工，仍然没有形成对啤酒
副产物的真正综合利用。

研究发现，啤酒酵母不但可用于啤酒生产，而且在食品和医药工业也
有广泛应用，如可提取蛋白质、胞壁多糖、维生素、核酸和核苷酸类物质及谷胱甘肽等，也可
生产食品添加剂及功能性食品。

如果能将啤酒行业中产生的废弃酵母综合利用，既可以减少对
环境的污染，也可以回收大量的高附加值资源，产生巨大的经济效益和社会效益。

啤酒废酵母综合利用的第一步是对酵母细胞进行破壁处理[1]。

微生物细胞壁的结构和强度取决于细胞壁的组成以及它们之间相互交连的程度，破碎细胞的主要阻力来自于连接细胞壁网
状结构的共价键。

了解细胞壁的组成和结构，有助于选择合适的破壁方法[2]。

酵母细胞的细胞壁是比较坚实的，其厚度大约为0.1~0.3滋m，重量占细胞干重的18%~30%，主要构成为葡聚糖（35%~45%）、甘露聚糖（40%~45%）、蛋白质（5%~10%）、几丁质（1%~2%）、脂类（3%~8%）、无机盐（1%~3%），其结构类似三明治，外层为甘露聚糖，中间是一层蛋白质分子，其中有的是以与细胞壁结合的酶的形式存在，内层为葡聚糖[3]。

根据酵母细胞壁的组成和结构，选择合适的破壁方法。

细胞破壁的方法很多，按照作用方式的不同划分，可以分为三类：物理法，如高压匀浆破
碎法、超声波破碎法、微波破碎法等；化学法，如酸热法、化学渗透法；生物法，如酶溶细胞
破壁法等[4]。

这些方法各有其自身的局限性和不足，为此，国内外学者进行了大量的试验研究，以期找到理想的破壁方法[5]。

刘明源等[6]研究6种破壁方式对啤酒酵母细胞中海藻糖溶出的
影响，寻求能高效提取啤酒酵母细胞海藻糖的破壁方法。

王凤琴[7]在从啤酒废酵母中提取RNA 时就曾使用10%的食盐配合热处理对酵母细胞进行破壁，提取出的RNA得率为2.25%，提取时间为4h，提取温度为90℃。

黄国荣[8]在啤酒酵母多糖提取产工艺的研究中使用高压均质法对酵
母细胞进行破壁，提取多糖的得率为3.03%。

郭卫芸等[9]采用反复冻融法对啤酒废酵母进行研究，在反复冻融3 次时，破壁率可达35%，可溶性蛋白溶出率为50.29%。

鉴于上述酵母细胞破壁方法的研究，本文遵循产物高释放率、低能耗和便于后续提取的原则，旨在探索“环境友好型”的细胞破壁方法。

以废弃啤酒酵母泥为原料，采用反复冻融法、
超声波法、微波法、盐法、酶法、液氮研磨等方法对啤酒酵母细胞进行破壁处理，分别对细胞
破壁率、海藻糖得率和破壁时间进行比较分析，微波法的细胞破壁率（49%）和海藻糖得率
（5.64%）最高，且时间（30min）最短。

通过6 种破壁方法的研究，为废弃啤酒酵母的综合开发利用奠定技术基础。

1 材料与设备
1.1 材料与试剂
啤酒废酵母，青岛啤酒（菏泽）有限公司。

蜗牛酶，上海源叶生物科技有限公司。

NaC（l AR）、革兰氏染色液、蒸馏水等。

1.2 仪器与设备
超声波细胞粉碎机，Y92-Ⅱ型，配有超声波细胞粉碎机隔音箱，宁波新芝生物科技股份有限公司；
微波炉，合肥荣事达三洋电器股份有限公司；
恒温水浴箱，北京长安科学仪器厂；
台式高速冷冻离心机，TGL-16 型，上海安亭科学生物仪器厂；
冰箱，青岛海尔股份有限公司；
数码显微镜，OLYMPUS DP72，奥林巴斯数码仪器公司；
超滤离心管，Millipore 3KDa，苏格兰产；
台式高速冷冻离心机，HR/T20M，湖南赫西仪器装备有限公司。

2 方法
2.1 啤酒废酵母的预处理
啤酒废酵母→过筛（100 目）→离心洗涤→5%酒石酸脱苦→离心洗涤→过筛（100 目）→离心洗涤→蒸馏水→离心洗涤→干净酵母泥
2.2 破壁方法
2.2.1 反复冻融法
反复冻融法是利用冻结- 解冻过程中内部冰晶体对细胞壁的机械作用而使其破裂的一种物理方法。

该方法比较温和，可避免高温对原料造成的营养损失、风味劣变等不良影响[10]。

称取适量酵母泥，加入蒸馏水，按料液比1:3 制成酵母悬液，分别于-20℃冰箱中反复冻融3~5 次，每次冷冻时间2h，100℃水浴中解冻20min。

2.2.2 超声波法
超声波法是一种有效的、温和的破碎细胞的方法，是利用超声波的“空化作用”，产生局部高温高压，并形成强大的冲击波，而使细胞破碎。

同时，高速射流可对细胞组织产生物理剪切力，使之变形、破裂并释放出内含物，这就大大加速了细胞破碎的过程，是解决啤酒废酵母资源再利用的新途径[11]。

称取适量酵母泥，加入蒸馏水，按料液比1:3 制成酵母悬液，设定功率300w，于冰浴条件下进行超声破碎30min（设定工作5s，间隔10s）。

2.2.3 微波法
微波是利用微波场将电能转化为热能，导致细胞内的极性物质尤其是水分子吸收微波能，使细胞内温度迅速上升，液态水汽化产生的压力将细胞膜和细胞壁冲破[12]。

称取适量新鲜酵母泥，在平皿上铺成均匀薄层，置于微波炉中处理10min，微波工作功率为700W。

2.2.4 盐法
盐法是通过调节酵母所处环境的渗透压，使细胞壁或细胞膜通透性增大。

高浓度的盐可产生高的渗透压，使细胞失水，质壁分离，在外力作用下使细胞自身破裂。

盐法以其提取条件温和，成本低的优点，得到广泛应用[13]。

称取适量酵母泥，加入蒸馏水，按料液比1:3 制成酵母悬液，加入NaCl 制成浓度为2.0%盐溶液，于80℃水浴中处理60min。

2.2.5 蜗牛酶法
酶法破壁是在酶的作用下溶解细胞壁，蜗牛酶是一类混合酶，它能溶解酵母和植物的细胞壁。

酶法破壁对营养物质损伤小，破壁条件温和，成为近年来研究的热点。

称取适量酵母泥，加入蒸馏水，按料液比1:3 制成酵母悬液，然后按照每克鲜酵母加入
1mg 蜗牛酶（酶活1000u/mg）的比例，37℃恒温水浴摇床上处理4h。

2.2.6 液氮研磨法
液氮温度为-196℃，它既能使各种组织成分不易被破坏或降解，又能使组织变硬，脆性增加，易于磨碎。

液氮研磨，一是，终止细胞内外一切生物反应，比如提取RNA 时，防止RNA 酶的降解反应等；二是，在液氮中的细胞完全冻硬了，研磨可达很好破胞效果，使里边的物质释放出来。

称取适量新鲜酵母泥，直接放入预先处理好的研钵中，加入适量液氮，在其沸腾状态下进行多次研磨，直至研磨成细粉状。

2.3 测定方法
2.3.1 破壁率的测定方法
将6 种方法破壁后的酵母悬液，4500r/min，离心10min，上清液再过3000D 的超滤，超滤离心管装液量10mL，12000r/min，离心10min，收集超滤滤过液，离心分离，采用蒽酮- 硫酸法测定海藻糖含量。

沉淀部分分别进行革兰氏染色，对比不同破壁方法革兰氏染色差别。

点
样至血球细胞计数板，对酵母菌进行直接计数，按照以下公式计算样品中酵母总数和已破壁的
酵母细胞数量，计算破壁率。

1mL 菌液中的细胞数(个)=５×25×10×1000×式中：C—5 个中方格中酵母总数；
D—稀释倍数。

2.3.2 破壁时间的测定方法
破壁时间的计量，由于反复冻融法、超声波法、微波法、盐法、酶法、液氮研磨这6 种破
壁方法的操作条件不同，以实验过程中每种方法最终得到破碎酵母细胞悬液的平均操作时间为准。

3 结果与分析
3.1 蒽酮-硫酸法测糖标准曲线的制作配制海藻糖标准品梯度浓度，在590nm 的波长下测
定吸光度，以海藻糖标准品浓度为横坐标，以OD 值为纵坐标，绘制标准曲线。

如图1 所示，海藻糖标准溶液在给定浓度之间呈良好的线性关系，得到回归曲线方程
=0.6402 -0.0062， 2=0.9990。

3.2 不同破壁方法革兰氏染色效果及破壁率的比较通过对上述6 种方法处理后的酵母悬液
进行革兰氏染色后，显微镜下观察，能观察到不同处理的酵母细胞的破壁效果，见图2。

通过革兰氏染色，显微镜下明显观察到酵母细胞有红色和紫色之分，红色的细胞说明细胞
壁被破除。

通过三次平行试验，由血球板计数，对各种方法的破壁效率进行比较。

如图 3 所示。

由图3 可知，反复冻融法，破壁率达到36%；超声波破碎法，破壁率达到42%；微波法处理后，破壁率达到49%；盐法，酵母破壁率为25%，蜗牛酶法，壁率达到39%；液氮研磨处理后破壁率为31%。

由此可见，酵母破壁率较高的是微波法。

3.3 不同破壁方法海藻糖得率的比较
将6 种方法破壁后的酵母悬液，采用蒽酮- 硫酸法测定其海藻糖的含量，并计算海藻糖的得率，如图4所示。

由图4 可知，反复冻融处理时，海藻糖得率达到3.27%；超声波破碎时，海藻糖得率达到5.32%；微波处理，海藻糖得率达到5.64%；盐法，海藻糖得率为3.76%；蜗牛酶法，海藻糖得率达到4.37%；液氮研磨处理后，海藻糖得率为3.83%。

由此可见，微波法处理的海藻糖得率最高。

3.4 不同破壁方法破壁时间的比较
如图5 所示，6 种破壁方法中，以反复冻融法的破壁时间最长，为420min；微波法破壁提取时间最短，为30min，显著小于其他破壁方法；超声波法时间为60min，盐法处理时间为
60min；蜗牛酶法时间为240min；液氮研磨时间为75min。

不同方法破壁时间的比较，单从处理时间的长短方面考虑，微波法最佳，为实际应用和生产工艺的放大的可行性上提供参考。

4 讨论
综上所述，酵母细胞破壁的方法有很多种，各有一定的局限性。

本文采用反复冻融法、超
声波法、微波法、盐法、酶法、液氮研磨法对啤酒酵母细胞进行破壁处理，以细胞破壁率、海
藻糖得率和破壁时间为评价指标，微波法以其49%的细胞破壁率、5.64%的海藻糖得率和30min 的处理时间，优胜于其他5 种处理方法，综合考虑成本的高低及工艺放大的可行性，微波法适
宜进行工业化生产。

不同的细胞破壁的方法各有优缺点，可根据不同的目的和要求，选择合适的破壁方法。

在
实际应用的破壁条件中，选用什么样的破壁方法要根据具体情况而定。

许多学者将不同的破壁
方法相互叠加进行细胞破壁的复合处理研究，为此，我们下一步准备将上述探讨的几种环境友
好的破壁方法进行细胞破壁的复合处理，大幅度的提高使其破壁效率。

本实验选用反复冻融法、超声波法、微波法、盐法、蜗牛酶法、液氮研磨6 种方法破碎酵
母细胞壁，仅以细胞破壁率、海藻糖得率和破壁时间为评价指标。

众所周知，啤酒酵母中含有
丰富的蛋白质、胞壁多糖、核糖核酸、脂类和酶等多种营养成分和协调因子，具有多种生理功能。

下一步实验重点是以破壁后细胞中的可溶性蛋白质、胞壁多糖及功能性油脂等为指标，考
察细胞破壁的可行性、各种活性物质的收率及功能性添加剂的应用。

本文仅从环境友好角度选择6 种细胞破壁方法，通过这几种方法对啤酒废酵母细胞的破壁
效果、海藻糖得率及破壁时间上进行分析比较，考察这6 种方法为进一步探索经济、高效啤酒
废酵母的破壁方法提供理论数据和技术参考。

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