SDS-PAGE样本制备

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4：蛋白质提取——组织蛋白质提取 蛋白质提取——组织蛋白质提取 ——
1：称量一定量的组织样本，去除干扰物质，比如血液等。 2：加入液氮研磨，直到研磨成粉，按每20毫克组织加入100-200 微升裂解液的比例加入裂解液。用枪吹打数下，使裂解液和细胞 充分接触。 3：冰上裂解30分钟，12000转，30min中收集上清，得到提取的蛋 白质。
滚珠粉碎法： 滚珠粉碎法 旋转玻璃球的摩擦作用能破坏细 胞壁，并释放细胞的内含物。
细胞悬浮 液 微生物
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2：SDS-PAGE裂解液的组成及作用
组成 种类 非离子去垢剂：triton X-100, NP-40 阴离子去垢剂：SDS 阳离子去垢剂：CTAB 作用 破坏蛋白质分子间的疏 水相互作用。
1：去垢剂
2：还原剂
β-巯基乙醇，二硫苏糖醇（DTT）,断裂蛋白质中的二硫键， TBP 以利于肽链的分离 抑制蛋白酶活性
3：蛋白酶抑 PMSF,AEBSF,EDTA,多肽蛋白酶抑制 制剂 剂，磷酸酶酶抑制剂
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3：常见SDS-PAGE 裂解液
裂解液 NP-40裂解液 RIPA裂解液 IP裂解液 SDS裂解液 裂解液组成 50mmol/L NaCl, 1% NP-40, 50mM/L tris-HCl （PH7.4) 150mmol/L NaCl, 1% NP-40, 0.5%脱氧胆酸钠， 0.1%SDS, 50mM/L tris-HCl（PH7.4) 20mM Tris(pH7.5)，150mM NaCl，1% Triton X100 50mM Tris(pH8.1)，1% SDS
当只有一种特定的亚细胞成分（细胞内成分）要分析时，也可以用温和的 裂解方法。例如，选择反应的条件，只释放胞质蛋白，或通过差速离心的方 法得到完整的线粒体或其它细胞器。有时这些方法混合使用(如酶处理后再渗 透裂解，在去污剂存在的条件下冻融)。
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1：裂解方式——温和裂解方法 裂解方式——温和裂解方法 ——
细胞破碎的方法 渗透裂解： 渗透裂解： 这是一种非常温和的方法 ，非常适用于被裂解样品破 碎成亚细胞成分。 冻融裂解： 冻融裂解： 适用材料 血细胞 组织培养细胞 细菌细胞 组织培养细胞 组织培养细胞 一般过程 将细胞悬浮在低渗透液中。 利用液氮将细胞迅速冻结 后再融化。如果需要，可 反复进行。 去污剂能溶解细胞的细胞 膜从而降解细胞并释放内 含物。
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4：蛋白质提取——贴壁细胞蛋白质提取 蛋白质提取——贴壁细胞蛋白质提取 ——
1：去除培养液，PBS洗涤3次。 2：按每孔（6孔板）加入100-200微升裂解液的比例加入裂解液。 用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。 3：冰上裂解30分钟，12000转，15min中收集上清，得到提取的蛋 白质。
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4：蛋白质提取——悬壁细胞蛋白质提取 蛋白质提取——悬壁细胞蛋白质提取 ——
1：收集细胞，1200转，离心3分钟收集细胞，除去培养基，PBS洗 涤3次。 2：按每孔（6孔板）加入100-200微升裂解液的比例加入裂解液。 用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。 3：冰上裂解30分钟，12000转，15min中收集上清，得到提取的蛋 白质。
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SDS-PAGE蛋白质提取方法
1：裂解方式的比较及选择 2：裂解液的组成及作用 3：常见裂解液 4：蛋白质提取一般实验步骤
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去污剂裂解： 去污剂裂解：
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1：裂解方式——温和裂解方法 裂解方式——温和裂解方法 ——
细胞破碎的方法 酶裂解： 酶裂解： 如溶菌酶用于细菌细 胞；纤维素酶和果胶酶用 于植物细胞）。 适用材料 植物组织 细菌细胞 真菌细胞 一般过程 在等渗透液溶液中用酶处理 细胞。
固体组织 微生物
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1：裂解方式——剧烈的裂解方法 裂解方式——剧烈的裂解方法 ——
机械匀桨法： 机械匀桨法 手工操作的匀浆器（如 Dounce或 Polfer-Elvehjem）能够用来破碎细胞 悬浮液或较柔软的组织。 固体组织 搅拌器或其它的电动的装置能用 来处理大量样品。除了在粉碎过程中 会有蛋白酶的释放，样品粉碎很迅速 且对蛋白质无影响。 如果需要，将组织切碎， 加入预冷的匀桨缓冲液(组 织的5-20倍)，迅速进行粉 碎。利用过滤或离心的方 法使裂解物澄清。 将细胞悬浮在等体积预冷 的破碎液中，并转移到一 支坚硬的试管内。每克湿 细胞中加入1-3克预冷的玻 璃珠，旋转液体一分钟并 且在冰上冷却一分钟，这 样重复2-4次。
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1：裂解方式——剧烈的裂解方法 裂解方式——剧烈的裂解方法 ——
细胞破碎方法 适用材料 一般步骤 短时间冲击细胞悬浮液避 免产生热量，在超声波冲 击间隙将样品放在冰上冷 却。 将细胞悬浮液放入预冷的 压力室中，施加压力并收 集被挤出的破碎样品。 组织和细胞用液氮冷冻， 并将它们反复研磨成精细 的粉末，加入氧化铝 （Al2O3）和细沙有助于研 磨。 超声波法： 超声波法 通过超声波发生器产生的超声波 细胞悬浮 剪切力将细胞破碎。当达到最大的振 液 幅时，剪切也越完全，但必须注意减 少热量的产生和泡沫的形成。 高压法： 高压法 在高压情况下通过小孔对细胞施 加压力产生的剪切力破碎细胞。 研磨法： 研磨法 一些类型细胞将它们放在研钵中 利用研杵手工将它们破碎。 带细胞壁 的微生物
sdspage蛋白质提取方法提取蛋白质时主要需要考虑蛋白质裂解方式裂解液的组成等因素不同的样本需要用不同的裂解方式细胞一般直接用裂解液裂解组织样本需要经过液氮研磨或匀浆器研磨等因此不同的样本需要选择不同的裂解方式同样对于裂解液的组成以需要根据实验的不同选择不同的溶液
SDS-PAGE样本制备
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