蛋白样本制备、定量及western步骤详解

β
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细胞裂解液-RIPA Buffer的配方分析及技术要点
其它
水；溶剂 NaCl： ：
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全蛋白抽提时注意事项
抑制蛋白酶及磷 酸酶 注意事项 可以适量加入甘 油,稳定蛋白 稳定蛋白
裂解液的用量
细胞或组织的样 本量
使用的 Detergent的种 的种 类 纯度 浓度 干 扰 去除等因素
mass spectrometry
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二
蛋白样本制备的原则
方法应具备标准化， 可靠性、简便性； 方法应具备标准化，具有重现性 、可靠性、简便性； 尽量抽提完全； 尽量抽提完全；
蛋白 样本 制备 原则
应使所有蛋白全部处于溶解状态 防止发生蛋白的降解、聚集、沉淀、 防止发生蛋白的降解、聚集、沉淀、变性 防止在抽提过程中发生化学修饰 如做2D则需去除高丰度蛋白或无关蛋白 如做 则需去除高丰度蛋白或无关蛋白 必要时去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。 必要时去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。
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膜蛋白的直接提取
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蛋白的分级提取
按蛋白溶解度不同进行分级抽提,降低样品的复杂性并富集低丰度蛋白质 按蛋白溶解度不同进行分级抽提 降低样品的复杂性并富集低丰度蛋白质
第一步：用非表面活性剂溶液裂解细胞提取高溶解性蛋白； 第一步：用非表面活性剂溶液裂解细胞提取高溶解性蛋白； 第二步：把未溶解的pellet用裂解液溶解 提取高疏水性蛋白 膜蛋白 ； 用裂解液溶解,提取高疏水性蛋白 膜蛋白)； 第二步：把未溶解的 用裂解液溶解 提取高疏水性蛋白(膜蛋白 第三步：用含复合表面活性剂的蛋白溶解液， 第三步：用含复合表面活性剂的蛋白溶解液，最后抽提前两次抽提后不 能溶解的膜蛋白约占整个样品的11%（W/W）。 能溶解的膜蛋白约占整个样品的 （ ）。
目的蛋白的结性质 与分布 分布于胞桨/胞核/ 膜 可溶/不可溶 含 量多少 分子量大小 四级结构特征 磷酸 化等修饰……
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案例分析-三 案例分析 细胞中总蛋白的制备
裂解样品
离心收集
定量检测
细胞加入裂解 液冰上放置 10-15分钟 10-15分钟
高速离心收集 上清即得全蛋 白样本
试剂名称 氟化钠 正钒酸钠 焦磷酸钠 抑制作用 酸性磷酸酶，丝氨酸/苏氨酸磷酸酶 酸性磷酸酶，丝氨酸 苏氨酸磷酸酶 碱性磷酸酶， 碱性磷酸酶，酪氨酸蛋白磷酸酶 丝氨酸-苏氨酸磷酸 丝氨酸 苏氨酸磷酸
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细胞裂解液-RIPA Buffer的配方分析及技术要点
还原剂
防止蛋白质发生氧化，保护二硫键。DTT、 防止蛋白质发生氧化，保护二硫键。 、 巯基乙醇等。 －巯基乙醇等。.
细胞裂解液-RIPA Buffer的配方分析及技术要点
磷酸 酶抑 制剂
抑制磷酸酶的活化，防止蛋白样本脱磷酸化， 抑制磷酸酶的活化，防止蛋白样本脱磷酸化，使 用前临时加入。 用前临时加入。
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磷酸酶抑制剂选择
磷酸酶主要包括非特异性的磷酸酶（例如：碱性磷酸酶， 磷酸酶主要包括非特异性的磷酸酶（例如：碱性磷酸酶， 酸性磷酸酶），特异性的丝氨酸/苏氨酸磷酸酶 例如： ），特异性的丝氨酸 苏氨酸磷酸酶（ 酸性磷酸酶），特异性的丝氨酸 苏氨酸磷酸酶（例如： PP1, PP2A, PP2B） 、酪氨酸蛋白磷酸酶（例如： ） 酪氨酸蛋白磷酸酶（例如： PTP）。 ）。 常规的抑制剂主要包括： 常规的抑制剂主要包括：
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二
蛋白样本制备的策略
制备蛋白的目的 活性分析 免疫印迹杂交 免疫沉淀或共沉淀 1D 2D EMSA CHIP等
实验材料 细胞 组织 固定组 织或石蜡包埋组织 微 生物 酵母 植物 提取 RNA后的剩余的蛋白 样本等
方法的选择 1 自行配制抽提试剂, 根据文献方法或经验提取 2 购买商品化试剂盒, 按其说明书的方法提取
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四 蛋白样本制备产品选择指南
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核蛋白样本制备
抽提原理 低渗裂解细胞膜, 低渗裂解细胞膜,释放出胞浆蛋白 与胞核; 与胞核; 离心分离出胞核; 离心分离出胞核; 高渗破裂胞核, 高渗破裂胞核,释放出可溶性核蛋 白; 加核酸酶降解DNA,释放出DNA结 加核酸酶降解DNA,释放出DNA结 合蛋白(组蛋白和转录因子) 合蛋白(组蛋白和转录因子) 实验注意事项 试剂和器皿冰上预冷 裂解液的用量 细胞总量 抑制蛋白酶 蛋白酶抑制剂
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选用表面活性剂考虑的因素
参考文献报告保持生物活性时使用的表面活性剂 工作条件下表面活性剂的溶解性
选 用 表 面 活 性 剂 考 虑 的 因 素
考虑表面活性剂的去除方法 保护蛋白活性时,不仅考虑表面活性剂的种类还有浓度 保护蛋白活性时 不仅考虑表面活性剂的种类还有浓度 根据样本下游的应用来选择表面活性剂的种类 表面活性剂的纯度影响提取蛋白的质量 使用分子生物学级的表面活性剂,无核酸酶蛋白酶等 使用分子生物学级的表面活性剂 无核酸酶蛋白酶等 尽量使用毒性较低的表面活性剂 因不明原因某些蛋白适用专门的表面活性剂进行分离 使用非表面活性剂NDSB结合表面活性剂来增加膜蛋白溶解性 结合表面活性剂来增加膜蛋白溶解性 使用非表面活性剂 有时比较难仅一种表面活性剂既能溶解蛋白又适用于蛋白分析, 有时比较难仅一种表面活性剂既能溶解蛋白又适用于蛋白分析 常先用一种表面活性剂将蛋白溶解,而另一种表面活性剂取代进 常先用一种表面活性剂将蛋白溶解 而另一种表面活性剂取代进 行蛋白的后续分析
可以适量加入 Benzonase /DNase I等核酸 等核酸 去除DNA,充 酶,去除 去除 充 分提取蛋白,降 分提取蛋白 降 低提取的粘度. 低提取的粘度
Temperature 试剂和器皿冰上 预冷,低温 低温4℃ 预冷 低温 ℃操 作
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细胞裂解液-RIPA Buffer的配方分析及技术要点
4
离子交换层析 Ion-exchange
Chromatography
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细胞裂解液-RIPA Buffer的配方分析及技术要点
蛋白 酶抑 制剂
抑制蛋白酶的活性，防止蛋白被水解， 抑制蛋白酶的活性，防止蛋白被水解，使用前临 时加入
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蛋白酶抑制剂及其鸡尾酒
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根椐胞浆/胞膜 胞核 根椐胞浆 胞膜/胞核 骨架 胞膜 胞核/骨架 蛋白的亚细胞策略用不同 提取液逐级溶解
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四种亚细胞组分分离提取的结果
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线粒体蛋白样本制备
首先用密度梯度离心方法分别分离 出线粒体,胞质 胞核. 出线粒体 胞质,胞核 胞质 胞核 再用线粒体抽提Buffer溶解线粒体 再用线粒体抽提 溶解线粒体 蛋白. 蛋白
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其它蛋白抽提产品
高丰度蛋白去除试剂盒 信号蛋白提取试剂盒 糖蛋白提取试剂盒 细菌蛋白提取试剂盒 酵母蛋白提取试剂盒 植物蛋白提取试剂盒
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五 蛋白定量产品选择指南
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BCA法蛋白定量 法蛋白定量
BCA（bicinchoninic acid）是理想的蛋白质定量方法。 （ ）是理想的蛋白质定量方法。 该方法因快速灵敏、稳定可靠， 该方法因快速灵敏、稳定可靠，对不同种类蛋白质检测的 变异系数非常小而倍备受专业人士的青睐。 变异系数非常小而倍备受专业人士的青睐。该方法的原理 在碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为 还原为Cu+，Cu+与 是，在碱性条件下，蛋白将 还原为 ， 与 BCA试剂形成紫色的络合物，测定其在562nm处的吸收 试剂形成紫色的络合物，测定其在 处的吸收 试剂形成紫色的络合物 并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。 值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。 BCA法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的 法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的 影响。在组织细胞裂解实验中，低浓度的去垢剂SDS， 影响。在组织细胞裂解实验中，低浓度的去垢剂 ， Triton X-100，Tween不影响检测结果，但螯合剂 不影响检测结果， ， 不影响检测结果 （EDTA，EGTA）、还原剂（DTT，巯基乙醇）和脂类 ， ）、还原剂（ ，巯基乙醇） ）、还原剂 会对检测结果有一定影响。实验中， 会对检测结果有一定影响。实验中，若发现样品稀释液或 裂解液本身背景值较高，可试用Bradford法测定蛋白浓 裂解液本身背景值较高，可试用 法测定蛋白浓 度。
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去除未结合的表面活性剂
根椐表面活性剂的疏水性,CMC,凝聚数目 和电荷等性质来去除. 凝聚数目,和电荷等性质来去除 根椐表面活性剂的疏水性 凝聚数目
1
疏水吸附方法 Hydrophobic Adsorption
2 透析法 Dialysis
3
凝胶层析法 Gel
Chromatography
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蛋白样本制备与Western Blot

主要内容
1 2 3 4 5 6
蛋白样本制备的目的 蛋白样本制备总体原则和策略 案例分析— 案例分析—细胞总蛋白的提取 蛋白提取产品选择指南 蛋白定量方法的选择 成功的 Western Blot
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亚细胞分级抽提
用超离心技术分离出细胞器、 用超离心技术分离出细胞器、 质膜和细胞核等成分， 质膜和细胞核等成分，再用适 当的蛋白质溶解液进行溶解。 当的蛋白质溶解液进行溶解。 其优点是不仅大大减少样品的 复杂性， 复杂性，而且可对分离的蛋白 质进行亚细胞定位。 质进行亚细胞定位。但该法需 要专业仪器， 要专业仪器，有时会出现假阳 性。
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膜蛋白样本制备
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膜蛋白的抽提
方法及原理
方法多 直接抽提法 分级抽提法 1:先机械法等非表面活性剂方法裂解细胞,再用表面活性剂抽提 2:按溶解性分级抽提 3:按亚细胞分级抽提
产物
细胞膜蛋白 细胞器质膜蛋白
注意事项
根椐膜蛋白种类和后续研究目的的不同,选择不同的产品或表面活性剂变 性剂等. 抑制蛋白酶. 样本量
缓冲液
Tris-HCl（pH7.5),提供 环境，使蛋白保持稳定， （ 提供pH环境 提供 环境，使蛋白保持稳定， 增加溶解性。 增加溶解性。
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细胞裂解液-RIPA Buffer的配方分析及技术要点
表面活 性剂
溶解膜与脂膜，溶解与稳定蛋白质（特别是膜蛋白） 溶解膜与脂膜，溶解与稳定蛋白质（特别是膜蛋白） 分为离子型（ 分为离子型（如SDS、脱氧胆酸盐等）和非离子型（ 、脱氧胆酸盐等）和非离子型（ 系列等）。 如NP-40、Triton-100、tween系列等）。 、 、 系列等
蛋白定量和 SDSSDS-PAGE 检测
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细胞裂解液-RIPA Buffer的配方分析及技术要点
缓冲液
表面活性剂
其它：Байду номын сангаас其它：H2O、NaCl、等 、 、
RIPA Buffer
蛋白酶抑制剂
还原剂
磷酸酶抑制剂
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细胞裂解液-RIPA Buffer的配方分析及技术要点
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各类表面活性剂特点
1 阴离子型 阴离子型: SDS 脱氧胆酸盐 2 阳离子型 阳离子型: CPB和CTAB 3 双性离子型 双性离子型: CHAPS Zwittergent系列 4 非离子型 非离子型: Brij系列 Triton-100 Nonidet P40 Tween 系列等
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Bradford法蛋白定量 法
考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使 染料，在酸性溶液中与蛋白质结合， 考马斯亮兰 染料 染料的最大吸收峰的位置（ ），由 染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm变为 ）， 变为 595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为， ，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为， 染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸） 染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和 芳香族氨基酸残基相结合。测定快速、简便， 芳香族氨基酸残基相结合。测定快速、简便，只需加一种 试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右 分钟左右。 试剂。完成一个样品的测定，只需要 分钟左右。由于染 料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成 分钟即可完成， 料与蛋白质结合的过程，大约只要 分钟即可完成，其颜 色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至 分钟之间， 色可以在 小时内保持稳定，且在 分钟至20分钟之间， 小时内保持稳定 分钟至 分钟之间 颜色的稳定性最好。 颜色的稳定性最好。由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族 氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测 氨基酸的含量不同，因此 法用于不同蛋白质测 定时有较大的偏差。去污剂、 定时有较大的偏差。去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫 、 酸钠（ 酸钠（SDS）干扰此法的测定。 ）干扰此法的测定。
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一
蛋白样本制备---成功蛋白分析的基础 蛋白样本制备---成功蛋白分析的基础 --蛋白样本制备的目的: 蛋白样本制备的目的 后续应用
activity assays
ELISA
protein microarrays
蛋 白 样 本
EMSA
SDS-PAGE /IEF
2-DE
immunoblotting