关节软骨的玻璃化冷冻与保存

１ ２ 周后 ， 行组 织 学（ 苏木精 一 伊红、 番红一 Ｏ
染 色） 检测， 结 果发现 ： 玻 璃化 组软 骨移 植 区颜 色与 周 围正常软 骨组 织基 本 一致 ，软 骨完 整 ，无坍 陷及 裂 纹；镜 下可 见其组 织
深 层呈 透 明软 骨样 ，浅层 区可 见 纤维样 软
染 色） 观察， 发 现软 骨 细胞 能够正 常分 泌基
环境 温度 、集预 处理 与冷 冻过程 为一体 的
冷 冻设备 研 究 ， 以期 简化 操作 ， 提 高效率 。
Ｍｃ Ｇａ ｎ ｎ 等 以Ｄ ＭＳ Ｏ、 甘 油 、丙二 醇 、 乙二 醇混合 液（ 总 浓度６ ． ５ ｍｏ ｌ ／ Ｌ ） 为冻存 剂
浓度（ １ — ５ ｍ ｏ Ｉ ／ Ｌ ） Ｄ ＭＳ Ｏ中保 存 的 软 骨 细
能 与 高 浓度 单 一 冷 冻保 护 剂 在 复 温 时会 诱 导蛋 白质 变性 、破 坏 细胞膜 及 细胞 内多
种 酶 的作用 有 关。
存 ，１ ４ ｄ 后 将样 本取 出于３ ７ ℃水 浴复温 ， 再 按相 反 顺序 经６ 个 浓度 逐渐 降低 的玻 璃
化 溶液 洗脱 至含 １ ｍｏ ｌ ／ Ｌ 蔗 糖 的平衡 液 。 组
氮 中保存 ，一段 时 间后取 出组 织 ，将 组织 经 特殊 处 理 （ ｃ ｒ ｙ ｏ ｓ ｕ ｂ ｓ 玳 ｏ ｎ ） 后 ，用扫 描
电镜 观 察研 究组织 的微 结构 ，结 果发 现低
仪 计数 及 阿 尔新 蓝 染 色等 方法 测 试 了复
温后 软骨 细胞 的存 活率 、凋亡率 及生 物活 性 。结果表 明 ：虽然该 法保 存 的软骨 细胞 存 活 率较 高，达￣ ， １ ８ ７ ％，但 糖胺 多糖 的合 成 能力 降低 ，表 明其 细胞 活 性 下降 。 魏 民等 选 取 Ｄ ＭＳ Ｏ和 乙酰 胺 为 冻 存 剂 对 兔股 骨髁 骨 软 骨柱 （ 直 径５ ｍｍ， 厚 度
织 消化 后 ， 测得 细胞 存活 率 为７ ３ ％一 ８ ５ ％。 复 温 组 织 移 植 于 兔 嚓 关节 软 骨 缺损 模 型
不 同种 类 、 低 浓 度冷 冻保 护剂 组合 配
置 的 高浓度 冻存 剂 的毒 性较 小，适合 作 为 玻 璃化 冷 冻荆使 用 。如将 渗透 性冷 冻保 护 试剂（ Ｄ ＭＳ Ｏ等 ） ，与 半渗 透 性冷 冻保 护 试
４ ｍｍ） 进 行 了玻璃 化 冻存 研 究 。４ ｏ Ｃ下将 样 本按 照 从低 浓度 至 高浓度 的 顺序 ，经６
存 的 羊和 人 关 节软 骨 组 织 中的 Ｓ 渗 入 率
分 别达到 ８ ７ ％和 ７ ０ ％。在 此基 础 上 ，课题 组 还 开展 了能 够精 确控 制 冻存 剂 浓度 与
总 浓度 为８ ． ４ ｍｏ ｌ ／ Ｌ 的混合 冻存 剂Ｖ Ｓ ５ ５ ， 对
Ｓ ｏ ｎ ｇ 等也 选 用Ｖ Ｓ ５ ５ 对 兔股 骨软 骨组
织 进行 了玻璃 化 冻存 方法研 究 ，超微 结 构
来源也 逐渐 从动 物过 渡到 人 。 ５ 玻璃化冷冻保存 关节软 骨的问题 与展望 尽 管玻 璃 化 冻存 关 节 软 骨 的研 究 取
度 ，再 结合 冻存 剂 毒 性 和 冰 点 等 物 理 参
数 ，设 计 了适 宜 的冻存 剂预 处 理 ／ 洗脱 方 法。 玻璃 化 冻存后 细胞 存活 率 达到７ ５ ． ４ ％， 全 层 组织 中均有 活 细胞 分布 。将 复 苏组织 消化 、 细胞培 养后 ，进行 组 织 学（ 番红 一 Ｏ
胞 内存 在 大量 由于 冰 晶 形 成 而 产 生 的孔
洞 ，基 质 的 网络 结 构 断 裂 明显 ； 高 浓度 Ｄ ＭＳ Ｏ（ ６ ． ０ — ７ ． ０ ｍｏ ｌ ／ Ｌ ） 中保 存 的软 骨基质 仅 呈现 出 少量 的 小孔 结 构 ，基 质 结构 完 整， 但 细胞存 活率 不 高（ ３ ３ ％一 ４ ２ ％） 。这可
关静
关节软嚣的玻璃佬冷冻与保存
ｗ Ⅵ Ｃ ＲＴ Ｅ Ｒ ． ｏ ｒ ｇ
完 整性 与 生 物 力 学性 能等 ） 来 筛选 冻存 过 程 参数 方面 。Ｊ ｏ ｍｈ ａ 等将 猪股 骨 关节软 骨
组 织 块 浸 泡 于 系列 浓 度 （ １ — ７ ｍｏ ｌ ／ Ｌ ） 的 二
范学敏 等 以Ｄ ＭＳ Ｏ、乙二醇 、 甲酰胺 、 海藻糖 混合 液 为冻存 液 ，对 兔 关节软 骨进
对人 骨软骨组 织块（ 直径１ Ｏ ｍｍ，厚 度
１ ． ５ — ３ ． ５ ｍｍ） 进 行 了玻 璃化 冻存 研 究 。依
个梯 度玻 璃化 溶 液浸 泡后 ，投入 液 氮 中保
据 冻存 荆渗 透性 建立 了数 学模 型 ，实时预
测 了预处 理 过程 中组织 内４ 种 冻存 剂 的浓
质 组 分
剂（ 海藻糖等） 或非渗透性冷 冻保 护试剂
（ 羟 乙基 淀 粉 等 ） 混 合 配 置 的 高 浓度 冻 存 液 ，与等 浓度 的单一 冷 冻保护 试剂 相 比 ，
总之 ，关节 软骨 的玻璃 化冷 冻保 存研
究 从早 期 的 单 纯 实验 阶段 逐 步 过 渡 到 以
行 了玻璃化 冷 冻保存 研 究 ，通过 流式 细胞
对 已在 上述 ７ 种溶 液 中平衡 的软 骨 组 织 内
的Ｄ ＭＳ Ｏ浓度 进行 了测 试 ，优化 了冻存 液
的预 处理 和洗脱 方 式 ，最终 使得 玻璃 化 冻
甲基 亚砜 （ Ｄ ＭＳ Ｏ） 中 ，待 Ｄ ＭＳ Ｏ渗 ห้องสมุดไป่ตู้进 入 组 织后 ，将 盛有组 织块 的冷 冻管投 入 到液
骨组 织 ，细胞 成 熟 ，胞 外存在 大量软 骨基
质。
数 学模型 和统 计分 析 为指导 ， 将 理论 预 测
与 实验 结果相 结合 的 理性 阶段 。生 物标 本
能 够减 少其毒 性作 用 ， 而 且在 复 温 时可 以
提 供 一 个 高渗 环 境 ，有 效 防止 水分 进 入 细胞 太快 而 引起 细胞 肿胀 。 Ｇ ｕ ａ ｎ 等 选用