基于代谢组学方法的小儿肺炎易感性研究

DOI :10.11895/j.issn.0253⁃3820.171245
基于代谢组学方法的小儿肺炎易感性研究
林丽丽1,2,3　汪受传*1,2,3　杨燕4　谢彤1,2　赵霞1,2,3　任靖1,2,3
李维薇1,2,3　陶嘉磊1,2,3　范嗣立5　单进军*1,2
1(江苏省儿童呼吸疾病(中医药)重点实验室,南京中医药大学中医儿科学研究所,南京210023)
2
(南京中医药大学医学代谢组学中心,南京210023)
3
(南京中医药大学附属医院,南京210029)
4
(首都医科大学附属北京儿童医院,北京100045)
5
(Genome Center of UC Davis,NIH West Coast Metabolomics Center,Davis 95616,USA)
摘　要　以6个月到6岁肺炎患儿尿液为样本,采用基于气相色谱与质谱联用技术(GC⁃MS)的代谢组学方法,研究肺炎患儿尿液内源性代谢产物的变化及其易感性的发病机制㊂收集不同感染次数的肺炎患儿尿液样本,包括正常儿童组29例㊁单次感染肺炎患儿组35例㊁多次感染肺炎患儿组31例,分析获得肺炎患儿尿液代谢轮廓;同时对所得数据进行主成分分析(PCA)及偏最小二乘法⁃判别分析(PLS⁃DA)等多元统计分析,综合单因素方差分析及倍数(Fold change,FC)变化分析结果,最终筛选并通过Fiehn⁃Lib 等数据库鉴定丝氨酸㊁组氨酸㊁脯氨酸㊁正亮氨酸㊁谷氨酰胺㊁硬脂酸㊁缬氨酸和异亮氨酸㊁乳糖醛酸等在正常儿童组与肺炎患儿组之间有代谢差异(p value adjusted by FDR<0.05)且FC>5,吲哚⁃3⁃乙酸㊁肌酸㊁乙醇胺㊁甘露糖基甘油酸和果糖在不同感染次数肺炎组之间具有差异性(p value adjusted by FDR<0.05)㊂实验结果表明,肺炎患儿易感性体质存在差异性代谢物,这些代谢物主要通过氨基酸及糖代谢对肺炎易感性产生影响㊂关键词　小儿肺炎;易感性;代谢组学;气相色谱⁃质谱联用
　2017⁃09⁃12收稿;2017⁃12⁃22接受
本文系国家自然科学基金项目(No.81373688)㊁江苏省研究生培养创新工程(No.SJLX_0432)㊁江苏省 333工程”科研资助项目(No.BRA2016427)和江苏省 六大人才高峰”高层次人才选拔培养项目(No.YY⁃022)资助*E⁃mail:jshan@;wscnj@
1　引言
肺炎是儿科常见病㊂世界卫生组织(WHO)将小儿肺炎列为全球3种重要儿科疾病之一,肺炎死亡
数占全世界各种原因死亡总数的5%[1],每年全球大约有100万5岁以下的儿童死于小儿肺炎,是发展中国家5岁以下小儿死亡的主要原因[2],故加强对肺炎的防治十分重要㊂
随着系统生物医学思维模式的建立,现代医学的研究正由微观㊁实体的探索向宏观㊁系统的角度转变,现代研究融入当前系统生物学将是必然的趋势㊂代谢组学做为系统生物学的代表之一,运用高通量技术,如气相色谱与质谱联用技术(GC⁃MS)㊁液相色谱与质谱联用技术(LC⁃MS)等,研究生命体代谢产物的变化规律,揭示机体代谢的本质[3,4]㊂近年来,尿液代谢组学的临床及实验研究越来越多,部分研究基于液相色谱⁃质谱技术探讨疾病的尿液代谢特征谱,涉及嘧啶代谢㊁氨基酸代谢㊁嘌呤代谢等[5~9],且尿液为非创伤性诊疗措施,尿样本采集难度较低,适用于成人及小儿临床疾病特征谱的探索㊂
近年来,已有对小儿肺炎分子水平上的代谢组学研究报道[10,11]㊂Lu 等[12]研究发现H1N1流感病
毒感染肺炎患者血清内多种代谢途径发生改变,以花生四烯酸代谢通路中的内源性物质改变最显著,也可能与一些内源性氧化还原物质如谷胱甘肽的代谢紊乱有关[13,14]㊂本研究采用GC⁃MS 技术,研究小儿肺炎的代谢特征,以小儿肺炎晨尿样本为例,从尿液代谢角度出发,探讨了小儿肺炎易感性的物质基础,研究并揭示基于代谢组学的小儿肺炎易感性体质的可能的生物学机制㊂
2　实验部分
2.1　仪器与试剂
配备AS 1310自动进样器的Trace 1310气相色谱和TSQ 8000质谱仪㊁TG⁃5MS 气相色谱柱(30m×
第46卷2018年2月
分析化学(FENXI HUAXUE)　研究报告Chinese Journal of Analytical Chemistry
第2期188~194
0.25mm,0.25μm)㊁Speed Vac 离心浓缩仪(Thermo 公司);Allegra 64R centrifuge 离心机(美国Beckman Coulter 公司);CPA225D 电子天平(德国Sartorius 公司)㊂
1,2⁃13C 肉蔻酸(1g)㊁BSTFA (含1%TMCS,10mL)㊁C8~C40烷烃系列标准品(1mL)㊁吡啶
(100mL)和甲氧胺盐(50mg)均购于Sigma 公司㊂11种标准品包括组氨酸㊁丝氨酸㊁脯氨酸㊁硬脂酸㊁缬氨酸㊁异亮氨酸㊁赖氨酸㊁苏氨酸㊁谷氨酸㊁次黄嘌呤㊁肌酸(50~100mg,Sigma 公司)㊂
2.2　样品采集与制备
2.2.1　肺炎诊断标准　参照‘诸福棠实用儿科学“第8版制订肺炎诊断标准[2],选择病例㊂(1)纳入标准　符合上述肺炎诊断标准的6月~6岁住院患儿及正常儿童㊂(2)排除标准　有明确先天/后天遗传代谢障碍疾病者㊂入选时有心力衰竭㊁呼吸衰竭㊁中毒性脑病㊁渗出性胸膜炎等严重合并症者㊂合并有心脑血管㊁肝肾和造血系统等严重原发性疾病及精神病患者㊂
2.2.2　样品采集　本研究经南京中医药大学附属医院(江苏省中医院)伦理委员会批准,纳入病例均获得患儿家属知情同意㊂选取2014年1~4月在首都医科大学附属北京儿童医院住院部确诊为肺炎的
6月~6岁患儿及儿童保健科采集6月~6岁正常儿童的晨尿㊂共纳入正常儿童(NC)组29例,单次感染肺炎(FIP)组35例,多次感染肺炎(RIP)组31例,临床资料见表1㊂3组间儿童年龄㊁性别㊁身高㊁体重无统计学差异(p >0.05),而肺炎组的血常规(白细胞计数㊁中性粒细胞㊁淋巴细胞)㊁用药情况与正常组存在差异,有统计意义(p <0.05)㊂由表1可知,学龄前期正常儿童的血常规中淋巴细胞比重较高㊂肺炎组儿童血常规中性粒细胞比重较正常儿童组高,淋巴细胞比重较正常儿童组低,说明本项研究纳入肺炎患儿以细菌感染占主导地位,符合肺炎的发病规律[2]㊂留取晨起空腹第一次尿液的中段尿液约
2mL,于-80℃保存,避免反复冻融㊂
表1　正常儿童及肺炎患儿基本情况
Table 1　The baseline of normal group and pneumonia groups
项目Iterm
正常组NC group (n =29)单次感染组FIP group (n =35)多次感染组RIP group (n =31)p 值p value 年龄(月)Age,months 27.1±12.8
31.3±16.526.9±18.3>0.05b 男/女比例Male /female(%)13/1620/1125/10>0.05a
出生时体重Weight of birth (kg) 3.4±0.4 3.4±0.3 3.4±0.4>0.05b 就诊时体重
Weight when hospitalized (kg)12.7±2.912.9±3.513.1±4.6>0.05b 身高Height(cm)
87.5±9.288.1±9.686.3±10.3>0.05b BMI 指数BMI(kg /m 2)16.5±2.2
16.4±2.417.1±2.5>0.05b 抗生素使用率Antibiotic (%)/77.480.0>0.05a 雾化激素使用率
Hormone drugs (%)(oral inhalation)/
83.9
82.9
>0.05a 白细胞计数White blood cell(109/L)7.6±1.811.8±5.611.0±4.0<0.01b 中性粒细胞比例Neutrophils (%)29.0±10.140.6±2.251.2±18.2<0.01b 淋巴细胞百分比Lymphocytes (%)61.4±9.941.2±21.939.6±16.7<0.01b 嗜酸性粒细胞百分比Eosinophils (%)
2.8±1.7
1.7±5.2
0.5±0.3
<0.05b
表中的数值为均值±标准差或者百分比㊂a 采用卡方检验,b 采用Kruskal⁃Wallis test㊂
Values are given asmean ±SD or number of individuals (%).a is chi⁃square test.b is Kruskal⁃Wallis test.Normal children (NC);First infection with pneumonia (FIP);Repeated infection with pneumonia (RIP);
2.2.3　样品制备　(1)尿样处理　将尿液样本置于4℃(或冰上)融化,14000r /min 离心10min,取上清180μL,加入含30U 尿素酶溶液20μL,37℃孵育30min,然后加入800μL 甲醇(冰浴,甲醇内含
1mg /mL 的内标1,2⁃13C 肉蔻酸),涡旋10min,4℃12000r /min 离心10min,吸取200μL 上清液,置于离心浓缩仪中挥干2h㊂(2)样品衍生化　向尿液样本中均加入15mg /mL 甲氧胺吡啶溶液30μL,涡旋1min 后振荡1.5h,混匀5min,加入30μL BSTFA(含1%TMCS)溶液后,涡旋1min,后振荡0.5h (37℃,600r /min)㊂静置,吸取上清液60μL 于玻璃内插管中,供GC⁃MS 进样分析[15]㊂
2.3　色谱⁃质谱仪条件
载气为氦气,流速为1.2mL /min,采用分流模式,进样口温度250℃,分流比为20∶1,升温程序:起始温
9
81第2期林丽丽等:基于代谢组学方法的小儿肺炎易感性研究
度60℃,保持1min 后,以20℃/min 升至320℃后,保持5min;进样量为1μL㊂采用EI 源;离子源温度为
280℃,离子传输线温度为250℃,电离能为70eV,采集范围为m /z 50~500,采集时间3.5~19.0min [16]㊂2.4　数据处理及统计学方法
采集各样品的图谱信息,使用MS⁃DIAL 及Fiehn⁃Lib 数据库[17,18]对得到的原始资料进行预处理,通过峰提取㊁物质鉴定㊁峰对齐,得到三维矩阵数据集,坐标分别为:化合物名称㊁保留时间㊁保留指数及根据峰高提取的峰面积(Peak height)㊂对矩阵数据集进行总离子流校准(mTIC normalization)及Pareto 校准后(Pareto scalling),采用Metaboanalyst 3.0[19]进行主成分分析(PCA)及偏最小二乘法判别(PLS⁃DA)等多元统计分析㊂接着对数据进行对数转换(log 2x transformation)后,基本满足正态分布及方差齐性后,进行单因素方差分析㊂根据FC 及单因素方差分析所得的p 值及False discovery rate (FDR)值筛选差异性代谢物,当FC >1.5及p <0.05时,提示该代谢物具有统计学意义㊂使用NIST 2014数据库和已有标准品对其进行验证,并经Metaboanalyst3.0分析相关代谢通路㊂
3　结果与讨论
3.1　GC⁃MS 分析结果
正常儿童组,单次感染肺炎组及多次感染肺炎组的GC⁃MS 分析总离子流图(TIC)见图1㊂使用MS⁃
DIAL 及Fiehn⁃Lib 数据库[17,18],将保留指数与保留时间进行线性匹对,共筛选出159种化合物,包括丝氨酸等氨基酸㊁半乳糖等糖类㊁琥珀酸等小分子代谢物㊂以内标(1,2⁃13C 肉蔻酸)及C8~C40烷烃作为质控标准,保留指数及峰面积RSD 均控制在30%以内㊂
t （min ）
I n t e n s i t y （×109）
0.44
5
6
7
8
9
101112
13
14
15
16
17
18
0.00.60.81.01.2C t （min ）
I n t e n s i t y （×109）
0.4456789
101112131415161718
0.0
0.60.81.01.2B
t （min ）
I n t e n s i t y （×109）
0.4456789
101112131415161718
0.00.60.81.01.2A
3
33
图1　(A)正常儿童组㊁(B)单次感染肺炎患儿组和(C)多次感染肺炎患儿组的GC⁃MS 总离子流色谱图
Fig.1　Total ion chromatograms (TICs)of urine samples from (A)normal children (NC)group,(B)
first infection with pneumonia (FIP)group and (C)repeated infection with pneumonia (RIP)group
3.2　肺炎代谢轮廓分析及差异性代谢物鉴定
采用MS⁃DIAL 处理尿液中筛选的色谱峰,再进行PCA 及PLS⁃DA 分析,由PLS⁃DA 得分图(图2)可见,正常儿童组与肺炎患儿组区别性比较好,肺炎组之间能够良好区分,提示正常儿童组及不同感染次数的肺炎患儿组尿液的确存在代谢差异,通过FC>1.5及单因素方差分析(p <0.05)筛选,共找出对
091 分析化学第46卷
得分图区分做出主要贡献的差异性代谢物共62种,并用标准品对组氨酸㊁丝氨酸㊁脯氨酸㊁硬脂酸㊁缬氨酸㊁异亮氨酸㊁赖氨酸㊁苏氨酸㊁谷氨酸㊁次黄嘌呤㊁肌酸共11种物质进行了确认(图3)㊂同时通过Cytoscape 得到网络关系图(见电子版文后支持信息图S1)㊂
C o m p o n e n t 2（7.6%）
Component 1（20.3%）
-40000
-60000
-200002000060000-20000
020000
4000060000A
Scores plot
FIP RIP NC
FIP
RIP
NC
Component 1（9%）
-40000
-40000
-20000
020000-200000
20000
40000B
Scores plot
FIP RIP
FIP
RIP
40000
C o m p o n e n t 2（12.6%）
图2　(A)尿样PLS⁃DA 得分图R 2=0.668,Q 2=0.433;permutation p <0.001),(B)不同感染次数肺炎患儿组PLS⁃DA 得分图,R 2=0.640,Q 2=0.143,permutation p <0.05)
Fig.2　(A)Partial least squares⁃discriminant analysis (PLS⁃DA)score plots of metabolic profiling of urine samples in three groups,R 2=0.668,Q 2=0.433;C,permutation p value <0.01).The three groups are NC group,FIP group and RIP group.(B)PLS⁃DA score plots of metabolic profiling of urine samples in two
pneumonia groups,R 2=0.640,Q 2=0.143,permutation p <0.05).
3.3　代谢通路分析
使用MetaboAnalyst3.0进行代谢通路分析㊂根据通路影响值及p 值得到:(1)丙氨酸㊁天冬氨酸和谷氨酸代谢,(2)甘氨酸㊁丝氨酸和苏氨酸代谢,(3)色氨酸代谢,(4)氨基酰⁃tRNA 生物合成,(5)精氨酸和脯氨酸代谢,(6)半胱氨酸和甲硫氨酸代谢,(7)淀粉和蔗糖代谢,(8)嘌呤代谢,(9)缬氨酸㊁亮氨酸和异亮氨酸生物合成,共9条相关代谢通路(富集分析p value<0.05,Impactor factor>0.02)㊂上述通路与差异性代谢物之间的关系见图4㊂
氨基酸类差异性代谢物(组氨酸㊁丝氨酸㊁脯氨酸㊁亮氨酸㊁异亮氨酸㊁硬脂酸㊁天冬酰胺,赖氨酸㊁苏氨酸㊁色氨酸㊁酪氨酸和缬氨酸等)在肺炎患儿组相对含量上升,糖类差异性代谢物(半乳糖醛酸㊁L ⁃二硫苏糖醇㊁纤维二糖)在肺炎患儿组相对含量下降㊂不同感染次数肺炎患儿组与正常儿童组之间尿液差异性代谢物的相对含量变化(见电子版文后支持信息图S2)㊂
对比肺炎患儿组与正常儿童组可知,肺炎过程中机体能量供应受损,需要氨基酸代谢和糖代谢参与修复㊂氨基酸类代谢物主要参与蛋白质的转运,肺炎过程中蛋白质不断分解为氨基酸,氨基酸的氧化代谢及糖类物质的消耗,进而提供能量[20~23],参与机体修复㊂组氨酸及其代谢产物组胺是肺炎㊁哮喘等呼吸系统疾病的主要致炎因子[24],组氨酸在肺炎组的相对含量上升,代表肺炎正处于炎症急性期,组氨酸不断累积并及时参与到炎症反应中㊂组氨酸还可以不断转化成谷氨酸及谷氨酰胺,同时谷氨酰胺不断代谢为次黄嘌呤,黄嘌呤㊁黄嘌呤核苷㊁组氨酸及其代谢物的累积代表体内能量及代谢失衡㊂丝氨酸是色氨酸的前体,丝氨酸可以不断转化成色氨酸,甲硫氨酸等㊂在代谢网络调控中,色氨酸有两条主要代谢途径:犬尿氨酸代谢和5⁃羟色胺代谢㊂色氨酸⁃犬尿氨酸通路在多种疾病中发挥作用[25,26]㊂色氨酸代谢主要发生于炎症组织,肺炎急性期时,色氨酸和产物犬尿氨酸不断在尿液中代谢累积[27]㊂多次感染肺炎患儿组与单次感染肺炎患儿组对比,存在以下5种差异性物质:肌酸㊁乙醇胺㊁吲哚⁃3⁃乙酸㊁β⁃甘露糖基甘油酯等物质相对含量上升,这些物质均为氨基酸代谢产物,伴随糖酵解(半乳糖醛酸㊁L ⁃二硫苏糖醇㊁纤维二糖㊁果糖),此类代谢底物在尿液中含量累积及代谢,可以作为肺炎急性期感染期
1
91第2期林丽丽等:基于代谢组学方法的小儿肺炎易感性研究
I n t e n i s t y （×108）
4536789
101112131415161718
Histidine standards
10.31
1.00.80.60.40t （min ）
568910
1516I n t e n i s t y （×107）
437111213141718
10.31
1.00.80.60.40I n t e n i s t y （×109）
453678910
1112131415161718
1.0
0.80.60.40A
150
160170
0.60.40m /z
I n t e n i s t y （×108）
Histidine standards 1.00.8155.14156.13
154.08
150160170
0.60.40I n t e n i s t y （×108）
Histidine in pneumonia urine
1.00.8155.13
156.14
154.12
153.12B Histidine in pneumonia urine
155
155
165165图3　(A)组氨酸在肺炎患儿尿液中提取的色谱峰与标准品色谱峰保留时间(保留指数与保留时间线性对齐)匹对良好;(B)肺炎患儿尿液组氨酸的一级质谱图与组氨酸标准品的匹对㊂
Fig.3　A:Total ion chromatogram peaks for histidine (middle panel.)in the urine from pneumonia children,it matches good with the extracted ion chromatogram of histidine standard on the bottom panel.(B)MS1spectrum of these two groups also match well.
Fumarate
Oxalo 鄄acetate
Citrte
Succinyl 鄄CoA （９）
Phosphoenolpyruvate (7)
(1)
(6)
(2)(3)
Pyruvate Acetyl 鄄CoA Digalaeturonic acid Aspartic acid
Glycine
Guanidoacetic acid Ammonia (4)(8)
(5)5鄄Aminopentanoic
acid
Citrulline
Ornithine Creatine 琢鄄Ketogluarate
Tyrosine Asparagine Glucuronic acid
sucrose 5′鄄deoxy 鄄5′鄄methylthioadenosine Methionine Threonine
Serine Tryptophan Isoleucine valine
Glutamate
L 鄄kynurenine indolcacctic acid
Hypoxanthine
Glutamine Histicline Xanthine
Proline
Xanthosine 图4　不同感染次数肺炎患儿与正常儿童之间生物标志物的代谢通路网络图㊂红色物质为肺炎组上调,蓝色物质为肺炎组下调,黑色表示无上下调趋势,灰色表示未检测到的物质
Fig.4　Metabolic pathway network of potential biomarkers of three groups.Red color for the significantly up⁃regulated metabolites in pneumonia groups,blue color for the significantly down⁃regulated metabolites in
pneumonia groups,black color means not significant metabolites,gray color means undetected metabolites)
及易感性的标记物㊂
4摇结论
采用GC⁃MS 与PLS⁃DA 方法分析不同感染次数肺炎患儿与正常儿童之间的尿液差异性代谢产物的变化,氨基酸类差异性代谢物,如组氨酸㊁丝氨酸㊁脯氨酸㊁正亮氨酸㊁硬脂酸等物质在肺炎组明显上升;糖类差异性代谢物,如半乳糖醛酸㊁L ⁃二硫苏糖醇㊁纤维二糖含量在肺炎组明显下降㊂经
291 分析化学第46卷
Metaboanalyst 分析得到共9条相关代谢通路㊂表明儿童肺炎主要影响氨基酸及糖代谢,推测肺炎引起了儿童机体的氨基酸代谢及糖代谢紊乱㊂本研究的样本来源尿液为无创性诊疗手段,易于获取及采集,
利用尿液代谢组学的方法评估及区分正常儿童与肺炎患儿及不同感染次数的肺炎患儿的代谢差异,可为临床肺炎急性发作期及肺炎易感性提供依据㊂References
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Metabolomics Study on Susceptibility of Pneumonia in Children
LIN Li⁃Li1,2,3,WANG Shou⁃Chuan*1,2,3,YANG Yan4,XIE Tong1,2,ZHAO Xia1,2,3,
REN Jing1,2,3,LI Wei⁃Wei1,2,3,TAO Jia⁃Lei1,2,3,FAN Si⁃Li5,SHAN Jin⁃Jun*1,2
1(Jiangsu Key Laboratory of Pediatric Respiratory Disease,Nanjing University of Chinese Medicine,Institute of Pediatrics, The First Clinical Medical College,Nanjing University of Chinese Medicine,Nanjing210023,China)
2(Medical Metabolomics Center,Nanjing210023,China)
3(The Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine,Nanjing210029,China)
4(Beijing Children's Hospital,Capital Medical University,Beijing100045,China)
5(Genome Center of UC Davis,NIH West Coast Metabolomics Center,Davis95616,USA)
Abstract　The changes of endogenous metabolites in urine samples that come from pneumonia patients of 6months to6years old children were analyzed by metabolomics methods based on gas chromatography and mass spectrometry(GC⁃MS).The aim of this study was to analyze and study the pathogenesis of endogenous metabolites in children with pneumonia and the pathogenesis of pneumonia susceptibility.The urine samples were collected and divided into normal children group(NC group,n=29),first infection with pneumonia group(FIP group,n=35),and repeated infection with pneumonia group(RIP group,n=31).The urine metabolic profile of pneumonia was obtained by GC⁃MS.Principal component analysis(PCA)and partial least squares⁃discriminant analysis(PLS⁃DA)were used to analyze the data.The results were analyzed by one⁃way analysis of variance and Fold change.Finally,there was significant difference between the normal group and the pneumonia group,the significant metabolites were serine,histidine,proline,norleucine,glutamine, stearic acid,valine,isoleucine with p value<0.05and Fold change>5,and indole⁃3⁃acetic acid,creatine, ethanolamine,mannosylglycerol and fructose were significant between the two pneumonia groups with p value< 0.05.The urinary metabolites demonstrated that amino acid metabolism and glucose metabolism were the main metabolic pathways and responsible for the susceptibility to pneumonia.
Keywords　Pneumonia inchildren;Susceptibility;Metabolomics;Gas chromatography⁃mass spectrometry
(Received12September2017;accepted22December2017) This work was supported by the National Natural Science Foundation of China(No.81373688),the Postgraduate Research and Innovation Project of Colleges and Universities of Jiangsu Province(No.SJLX_0432),Jiangsu Provincial333High⁃level Talents Cultivation Project(No. BRA2016427),and Jiangsu Provincial Six Talent Peaks Project(No.YY⁃022).。